1 LỜI CẢM ƠN Từ lòng biết ơn sâu sắc của mình, em xin dành trang đầu tiên của khóa luận để bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến: Ban giám hiệu trường Đại học Nha Trang, Phòng Đào tạo, Ban giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường cùng toàn thể quý thầy cô đã giảng dạy tận tình và giúp đỡ em trong quá trình học tập tại trường. Tiến sỹ Lê Văn Bé – Viện trưởng Viện Vacxin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang, người thầy đã luôn quan tâm hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình thực tập tại Viện. Tiến sỹ Nguyễn Thị Lan Phương – trưởng phòng Kiểm Định, ThS. Vũ Thị Thu Hương, CN. Tô Thị Hồng Vân, Nguyễn Thị Hồng Nhiên đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo nhiệt tình, chu đáo và luôn tạo điều kiện thuận lợi nhất giúp em hoàn thành luận văn này. Qua đây em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS. Lê Phương Chung đã nhiệt tình giúp đỡ, góp ý và động viên em trong thời gian thực tập và hoàn thành luận văn. Em xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc Viện Vacxin Nha Trang đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực tập tại Viện. Xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, tất cả bạn bè, anh chị và các em đã quan tâm, giúp đỡ, chia sẻ, động viên em trong suốt thời gian qua. Nha Trang, tháng 7 năm 2011 Sinh viên Nguyễn Thị Tình. 2 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 8 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10 1.1.Tình hình bệnh cúm A/H1N1 và nghiên cứu sản xuất vacxin cúm A/H1N1. 10 1.2.Sản xuất vacxin cúm trên trứng gà có phôi 11 1.2.1.Quy trình sản xuất và kiểm định vacxin cúm trên trứng gà có phôi. 11 1.2.2.Tiêu chuẩn chất lượng của vacxin cúm A/H1N1. 13 1.3.Những yêu cầu và căn cứ pháp lý về thực hành tốt phòng thí nghiệm và thẩm định quy trình phân tích. 13 1.4.Thẩm định quy trình phân tích. 15 1.4.1.Phạm vi thẩm định, tái thẩm định 15 1.4.2.Các yêu cầu thực hiện để thẩm định quy trình phân tích. 16 1.5.Các chỉ tiêu hóa học trong vacxin và phương pháp định lượng. 21 1.5.1.Protein và phương pháp định lượng protein. 21 1.5.2.Formaldehyde và các phương pháp định lượng formaldehyde. 22 1.5.3.Sucrose và các phương pháp bán định lượng sucrose. 24 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1.Thời gian và địa điểm nghiên cứu. 26 2.2.Nguyên vật liệu 26 2.3.Phương pháp 27 2.3.1.Xác định hàm lượng protein tổng số bằng phương pháp Lowry. 27 2.3.2.Xác định hàm lượng formaldehyde tự do bằng phương pháp đo quang với thuốc thử acetylaceton. 30 2.3.3.Bán định lượng sucrose bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng. 32 2.3.4.Thiết kế thực nghiệm và tiêu chuẩn đánh giá các thông số cần thẩm định của phương pháp phân tích. 35 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 38 3.1.Kết quả thẩm định phương pháp xác định Lowry cải tiến. 38 3 3.1.1.Độ đúng 38 3.1.2.Độ chính xác. 38 3.1.3.Khoảng tuyến tính. 41 3.1.4.Độ đặc hiệu: 44 3.2.Kết quả thẩm định phương pháp xác định hàm lượng formaldehyde. 45 3.2.1.Độ đúng: 45 3.2.2.Độ chính xác. 45 3.2.3.Khoảng tuyến tính. 48 3.2.4.Dải đo. 51 3.2.5.Độ đặc hiệu 51 3.3.Kết quả thẩm định phương pháp sắc ký lớp mỏng. 52 3.4.Kết quả kiểm định hóa học vacxin cúm A/H1N1. 55 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 4.1.KẾT LUẬN. 57 4.2.KIẾN NGHỊ. 57 4 KÍ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT BĐM : Bình định mức BSA : Bovine Serum Albumin CTC : Copper Tartrate Carbonate CV : Hệ số biến thiên DAB : Digital Audio Broadcasting DOC : Sodium deoxycholate ĐC : Đường chuẩn ELISA : Enzyme – linked immune sorbent assay (Thử nghiệm miễn dịch gắn men) EPA : Environmental Protection Agency (Cơ quan bảo vệ Môi sinh Hoa Kỳ). EU : European Union (Liên minh châu Âu) HA : Haemagglutinin (Kháng nguyên HA) FP : Function Programming IARC : International Agency for Research on Cancer (Cơ quan Quốc tế Nghiên cứu Ung thư) IU : International Unit (Đơn vị quốc tế) IVAC : Institute of Vaccines and medical biological (Viện Vacxin và Sinh phẩm y tế) LAL : Limulus Amoebocyte Lysate (Thử nghiệm tìm nội độc tố) NIBSC : National Institute for Biological Standards and Control (Viện Quốc gia về tiêu chuẩn và Kiểm dịch Sinh học) GLP : Good Laboratory Practice (Thực hành tốt phòng thí nghiệm) GMP : Good Manufacturing Practices (Quy phạm thực hành sản xuất tốt) GTLT : Giá trị lý thuyết OD : Optical density (Mật độ quang) PBS : Photphat Buffer Saline (Dung dịch đệm của muối photphat) 5 Ph Eur : The European Pharmacopoeia SD : Standard Deviation (Độ lệch chuẩn) SDS : Sodium Dodecyl Sulphate SRID : Single Radial Immunodifution (Phản ứng khuếch tán miễn dịch vòng đơn) TCA : Trichloroacetic Acid TCYTTG : Tổ chức Y tế Thế giới TH : Tiến hành TLC : Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng) TSB : Tryptic Soy Broth WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) 6 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Tiêu chuẩn chất lượng của vacxin cúm A/H1N1/09 9. 13 Bảng 1.2: Các chỉ tiêu thẩm định các phương pháp phân tích [3] 20 Bảng 2.1: Bảng tóm tắt thẩm định thử nghiệm kiểm tra hàm lượng X 36 Bảng 2.2: Tổ hợp các điều kiện thử nghiệm để kiểm tra độ chính xác trung gian. 37 Bảng 3.1: Kết quả sau 5 lần thử nghiệm của phương pháp Lowry cải tiến. 38 Bảng 3.2: Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry cải tiến. 39 Bảng 3.3: Tổ hợp các điều kiện thử nghiệm phương pháp Lowry cải tiến. 39 Bảng 3.4: Kết quả xác định độ chính xác trung gian của phương pháp Lowry cải tiến. 40 Bảng 3.5: Phương trình đường chuẩn protein (750nm) 41 Bảng 3.6: Bảng kết quả kiểm tra độ đặc hiệu 44 Bảng 3.7: Kết quả xác định độ chính xác và độ đúng của phương pháp xác định hàm lượng formol tự do bằng thuốc thử acetylaceton. 45 Bảng 3.8: Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp xác định hàm lượng formol tự do bằng thuốc thử acetylaceton. 46 Bảng 3.9: Tổ hợp các điều kiện thử nghiệm phương pháp đo quang bằng thuốc thử acetylaceton. 46 Bảng 3.10: Kết quả xác định độ chính xác trung gian của phương pháp xác định hàm lượng formol tự do bằng thuốc thử acetylaceton. 47 Bảng 3.11: Phương trình đường chuẩn formol (420nm) 48 Bảng 3.12: Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu. 51 Bảng 3.13: Kết quả kiểm định hóa học vacxin cúm A/H1N1 55 7 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Quy trình sản xuất và kiểm định vacxin cúm. 12 Hình 3.1. Đồ thị đường chuẩn protein 1 41 Hình 3.2. Đồ thị đường chuẩn protein 2 42 Hình 3.3. Đồ thị đường chuẩn protein 3 42 Hình 3.4. Đồ thị đường chuẩn protein 4 43 Hình 3.5. Đồ thị đường chuẩn protein 5 43 Hình 3.6. Đồ thị đường chuẩn formol 1 48 Hình 3.7. Đồ thị đường chuẩn formol 2 49 Hình 3.8. Đồ thị đường chuẩn formol 3 49 Hình 3.9. Đồ thị đường chuẩn formol 4 50 Hình 3.10. Đồ thị đường chuẩn formol 5 50 Hình 3.11. Bản mỏng mỏng bán định lượng sucrose 1 52 Hình 3.12. Bản mỏng bán định lượng sucrose 2 53 Hình 3.13. Bản mỏng bán định lượng sucrose 3 54 8 ĐẶT VẤN ĐỀ Đại dịch cúm 2009 còn gọi là Dịch cúm A/H1N1 (2009), "cúm lợn" (hay "cúm heo") là dịch cúm do một loại virus thuộc chủng H1N1 lần đầu tiên được các cơ quan y tế phát hiện vào tháng 3 năm 2009. Cho đến nay, virus cúm gây ra đại dịch H1N1 2009 đã lan tràn tại hầu hết quốc gia trên toàn thế giới. Trước tình hình đó, Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) đã phát triển mở rộng chương trình cúm toàn cầu nhằm tìm ra các biện pháp kiểm soát và phòng ngừa nguy cơ bùng phát lan rộng, trong đó việc phát triển một vacxin có hiệu quả được xem là nền tảng quan trọng để bảo vệ cộng đồng. Ngày 06/08/2009, Tổ chức Sức khỏe Thế giới (WHO) đã ra thông báo về quá trình sản xuất vacxin cúm đại dịch H1N1 2009. Tổ chức Y tế Thế giới đã khuyến cáo các nước nên tự nghiên cứu sản xuất vacxin cúm A/H1N1 để có thể chủ động trong công tác phòng chống dịch, bảo vệ sức khỏe cộng đồng [9]. Cùng với việc tạo ra các chủng sản xuất vacxin cúm A/H1N1 thích hợp bằng kỹ thuật di truyền ngược, các trung tâm nghiên cứu bệnh cúm quốc tế cũng đưa ra những hướng sản xuất vacxin cúm khác nhau (sản xuất trên trứng gà có phôi, tế bào động vật…). Trên cơ sở đó, tùy thuộc vào điều kiện của từng quốc gia mà lựa chọn con đường sản xuất cho phù hợp nhưng phải đảm bảo tính an toàn và hiệu quả cao. Tại Việt Nam, Viện Vacxin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang đã nghiên sản xuất vacxin cúm A/H1N1 cho người bằng phương pháp nuôi cấy trên trứng gà có phôi. Và cho đến nay Viện đã sản xuất 20 lô vacxin thành công. Trước khi đưa vào sử dụng, vacxin cúm phải đạt được các tiêu chuẩn an toàn, miễn dịch cần thiết theo quy định của Bộ Y tế Việt Nam và TCYTTG. Một trong số các tiêu chuẩn đó là hàm lượng protein tổng số, formaldehyde và sucrose (đây là các tạp chất trong vacxin thành phẩm có thể gây dị ứng, ung thư…). Với điều kiện trang thiết bị hiện có, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu thẩm định quy trình phân tích các chỉ tiêu hóa học trong vacxin cúm A/H1N1/09”, bao gồm:  Xác định hàm lượng protein tổng số bằng phương pháp Lowry cải tiến. 9  Xác định hàm lượng formaldehyde tự do bằng phương pháp đo quang với thuốc thử acetylaceton.  Bán định lượng sucrose bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC). Mục tiêu của đề tài: - Chứng minh được các quy trình phân tích đã nêu trên phù hợp với mục đích ứng dụng để kiểm tra các chỉ tiêu hóa học tương ứng trong vacxin. - Thông qua kết quả thẩm định các quy trình phân tích với đầy đủ dữ liệu thực nghiệm. - Góp phần hoàn thành mục tiêu lấy chứng chỉ GMP cho sản xuất và kiểm định vacxin cúm trong năm 2011. 10 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình bệnh cúm A/H1N1 và nghiên cứu sản xuất vacxin cúm A/H1N1. Dịch cúm A/H1N1 mới bùng phát lần đầu tiên tại Mehico vào cuối tháng 3/2009, đến tháng 4 lan nhanh sang Mỹ và các quốc gia lân cận. Theo dòng người di chuyển, dịch cúm lan nhanh ra toàn thế giới. Tính đến ngày 7/3/2010, dịch cúm A/H1N1 mới lan ra 213 nước và vùng lãnh thổ ở tất cả các châu lục, với 339.620 người mắc và 16713 người chết, hai nước có số người chết nhiều nhất là Mehico: 108 người và Mỹ: 44 người [11]. Như vậy sau 41 năm (đại dịch năm 1957 giết chết 2 triệu người), thế giới lại có một đại dịch cúm mới A/H1N1. Trước tình hình đó TCYTTG (ngày 11/6/2009) đã nâng mức báo động dịch lên mức cao nhất 6/6 [11]. Vacxin phòng đại dịch cúm có công hiệu bảo vệ mạnh khi được tiêm trước hoặc gần thời điểm dịch bùng phát. Vì vậy, cần chế tạo và sản xuất vacxin đặc hiệu dành cho virus cúm A/H1N1/09 càng sớm càng tốt cũng như có những chiến dịch tiêm phòng đúng lúc đúng chỗ khi đại dịch cúm xảy ra. Để đối phó hiệu quả với đại dịch, WHO thúc đẩy việc sản xuất vacxin cúm ở các nước đang phát triển bằng hàng loạt giải pháp: Chuyển giao công nghệ, cấp kinh phí trợ cấp xây dựng cơ sở sản xuất và đào tạo cán bộ, tổ chức các hội nghị bàn về việc thúc đẩy năng lực sản xuất vacxin trên toàn thế giới [10]. Ngày 17/6/2009, Viện Vacxin và Sinh phẩm Y tế (IVAC) đăng ký đề tài độc lập cấp nhà nước Nghiên cứu ứng dụng quy trình nuôi cấy trên trứng gà có phôi để sản xuất vacxin cúm A/H1N1 mới. Trong năm 2010 Viện Vacxin và Sinh phẩm Y tế đã triển khai và hoàn thiện dây chuyền sản xuất vacxin cúm tại trại Chăn nuôi Suối Dầu và sản xuất thử để ổn định quy trình 12 lô vacxin cúm ở các quy mô khác nhau, trong đó có 5 lô hoàn thiện đến giai đoạn bán thành phẩm [4]. [...]... hoàn toàn và thay đổi quy trình phân tích đã được thẩm định 16 Tái thẩm định bao gồm: Phương pháp phân tích chuyển đổi và xét duyệt tại Cơ quan Kiểm nghiệm quốc gia xin đăng ký lại để lưu hành mặt hàng (thẩm định định kỳ) [5] 1.4.2 Các yêu cầu thực hiện để thẩm định quy trình phân tích Trong công tác xây dựng tiêu chuẩn, phải xây dựng các quy trình phân tích hay còn gọi là quy trình thử nghiệm để giúp... 1.4.1 Phạm vi thẩm định, tái thẩm định Nếu quy trình phân tích của một sản phẩm thử nghiệm đã có trong Dược điển Việt Nam hiện hành hay có trong Dược điển Châu Âu (Ph Eur.), (USP), (JP), (FP), (DAB), hoặc các phương pháp phân tích chính tắc của hiệp hội hóa học phân tích thế giới thì không phải thẩm định lại, nếu không phải tái thẩm định lại Phạm vi thẩm định bao gồm: Quy trình phân tích mới hoàn toàn... xác trong việc đánh giá chất lượng thuốc [3] 1.4 Thẩm định quy trình phân tích Trong công tác tiêu chuẩn, việc xây dựng các quy trình phân tích (Analytical Procederes) hay còn gọi là quy trình thử nghiệm (Test Procedures) nhằm giúp cho việc thực hiện kiểm tra chất lượng của tiêu chuẩn đó Quy trình phân tích là quy trình thử nghiệm, mô tả chi tiết các bước cần thiết để thực hiện một thử nghiệm Quy trình. .. lọ tạo thành vacxin thành phẩm [10] Song song với quy trình sản xuất, quy trình kiểm định cũng diễn ra theo sơ đồ 10: 12 Quy trình sản xuất Quy trình kiểm định Gây nhiễm tr Thu gặt Tinh sạch cô đặc Ly tâm phân đoạn sucrose Bất hoạt, lọc vô trùng Hình 1.1: Quy trình sản xuất và kiểm định vacxin cúm 13 1.2.2 Tiêu chuẩn chất lượng của vacxin cúm A/H1N1 Mỗi lô vacxin cúm A/H1N1 trong quá trình sản xuất... chất lượng của tiêu chuẩn cũng như các chỉ tiêu đề ra cho tiêu chuẩn đó Mỗi quy trình hay phương pháp đưa ra đều phải trải qua rất nhiều nghiên cứu để phát triển và hoàn thiện nó Để biết được quy trình đề xuất có đáp ứng được yêu cầu dự kiến và đạt tiêu chuẩn của một quy trình phân tích hay không thì nó phải được thẩm định, đánh giá [6] Cơ sở để đánh giá một quy trình phân tích dựa vào các tiêu chuẩn sau:... một chất phân tích khi có mặt các thành phần khác có thể có trong mẫu thử Việc xác định tính đặc hiệu cần thiết được tiến hành trong khi thẩm định các phép thử định tính, xác định tạp chất và định lượng Thông thường các thành phần gồm các tạp chất, sản phẩm phân hủy, chất nền Quy trình dùng để xác định tính đặc hiệu phụ thuộc vào mục tiêu đã định của phương pháp phân tích Một phương pháp phân tích kém... nghiệm Quy trình phân tích được chia thành 3 loại: Thử định tính, thử tinh khiết và thử định lượng [7] Thẩm định quy trình phân tích là một quá trình tiến hành thiết lập bằng thực nghiệm các thông số đặc trưng của phương pháp để chứng minh rằng phương pháp đáp ứng yêu cầu phân tích dự kiến Nói cách khác, việc thẩm định một quy trình phân tích yêu cầu chúng ta phải chứng minh một cách khoa học rằng khi... qua quá trình kiểm định chất lượng rất chặt chẽ 14 Các tiêu chí kiểm tra đều dựa trên các tiêu chuẩn hiện hành của Bộ Y tế Việt Nam và các quy định của TCYTTG cho vacxin cúm dùng cho người Đối với vacxin cúm sản xuất trên trứng gà có phôi, tiêu chuẩn chất lượng (vacxin cúm A/H1N1/09) được TCYTTG khuyến cáo như bảng sau 11: Bảng 1.1: Tiêu chuẩn chất lượng của vacxin cúm A/H1N1/09 11 TT Chỉ tiêu Phương... pháp phân tích đang nghiên cứu Kết quả đánh giá độ thô là kết quả đánh giá dãy các thông số phản ánh 20 tính thích hợp của hệ thống phải được thiết lập để đảm bảo duy trì được tính hiệu lực của phương pháp phân tích bất kỳ khi nào sử dụng [5] Sau đây là bảng liệt kê các chỉ tiêu được xem là quan trọng nhất cho việc thẩm định các loại phương pháp phân tích khác nhau: Bảng 1.2: Các chỉ tiêu thẩm định các. .. độ chính xác giữa các phòng thí nghiệm (các nghiên cứu phối hợp giữa các phòng thí nghiệm thường được áp dụng để tiêu chuẩn hóa phương pháp) Độ tái lặp được xác định bằng cách so sánh kết quả giữa các phòng thí nghiệm Độ tái lặp được tiến hành đánh giá trong trường hợp tiêu chuẩn hóa phương pháp phân tích, ví dụ như đối với các quy trình trong Dược điển Những số liệu này không nằm trong hồ sơ đăng ký . kê các chỉ tiêu được xem là quan trọng nhất cho việc thẩm định các loại phương pháp phân tích khác nhau: Bảng 1.2: Các chỉ tiêu thẩm định các phương pháp phân tích [3] Loại quy trình phân tích. (thẩm định định kỳ) [5]. 1.4.2. Các yêu cầu thực hiện để thẩm định quy trình phân tích. Trong công tác xây dựng tiêu chuẩn, phải xây dựng các quy trình phân tích hay còn gọi là quy trình. định, tái thẩm định 15 1.4.2 .Các yêu cầu thực hiện để thẩm định quy trình phân tích. 16 1.5 .Các chỉ tiêu hóa học trong vacxin và phương pháp định lượng. 21 1.5.1.Protein và phương pháp định lượng