BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐÀO THỊ KIM OANH TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT ACID HYDROXAMIC HƯỚNG ỨC CHẾ ENZYM HISTON DEACETYLASE LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐÀO THỊ KIM OANH TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT ACID HYDROXAMIC HƯỚNG ỨC CHẾ ENZYM HISTON DEACETYLASE LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH HÓA DƯỢC MÃ SỐ: 62.72.04.03 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Hải Nam GS.TS. Sang-Bae Han HÀ NỘI 2013 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án Đào Thị Kim Oanh ii LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực cùng đồng nghiệp, gia đình và bạn bè. Đầu tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sự biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Hải Nam, GS.TS. Sang-Bae Han, những người thầy đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu cả ở Việt Nam và Hàn Quốc. Tôi xin chân thành cảm ơn các đồng nghiệp tại bộ môn Hóa dược đã ủng hộ, động viên tôi trong quá trình nghiên cứu. Trong thời gian thực hiện luận án, tôi đã nhận được sự phối hợp, giúp đỡ của các cá nhân, đơn vị trong và ngoài trường. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị Phòng thí nghiệm trung tâm – Trường đại học Dược Hà Nội, Khoa hóa học – Trường đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, Phòng cộng hưởng từ - Viện hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Phòng khối phổ - Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, các bạn nghiên cứu sinh của bộ môn Dược lý, Khoa Dược, Trường đại học Quốc gia Chungbuk (Cheongju, Hàn Quốc). Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban giám hiệu, Phòng đào tạo sau đại học, các bộ môn và phòng ban chức năng – Trường đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập và hoàn thành luận án này. Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới chồng và hai con trai, người thân, bạn bè đã luôn là những người động viên, là động lực giúp tôi phấn đấu hoàn thành luận án. Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu mà mọi người đã dành cho tôi. Đào Thị Kim Oanh iii MỤC LỤC Trang Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ, sơ đồ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Histon deacetylase 2 1.1.1. Histon acetyltransferase 4 1.1.2. Histon deacetylase 4 1.1.2.1. Phân loại 5 1.1.2.2. Cấu trúc của HDAC và cơ chế phản ứng deacetyl hóa 7 1.1.3. Mối liên quan giữa ung thư và sự bất thường hoạt động của HAT hoặc HDAC 10 1.2. Các chất ức chế HDAC 11 1.2.1. Phân loại 11 1.2.2. Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC 14 1.2.3. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC 17 1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về các chất ức chế HDAC 18 1.3.1. Các peptid vòng 19 1.3.2. Dẫn chất benzamid 20 1.3.3. Các acid béo mạch ngắn 21 1.3.4. Các dẫn chất ceton 22 1.3.5. Các hydroxamat và dẫn chất 22 1.3.5.1. Thay đổi cầu nối 24 1.3.5.2. Thay đổi nhóm khóa hoạt động 29 1.3.5.3. Thay đổi nhóm chức hydroxamic 34 1.4. Các phương pháp tạo liên kết amid và tổng hợp acid hydroxamic 39 1.4.1. Các phương pháp tạo liên kết amid 39 1.4.1.1. Acyl halid 40 1.4.1.2. Acyl azid 41 iv 1.4.1.3. Acylimidazol 41 1.4.1.4. Anhydrid 42 1.4.1.5. Ester 43 1.4.2. Các phương pháp tổng hợp acid hydroxamic 45 1.4.2.1. Tổng hợp acid hydroxamic từ ester 45 1.4.2.2. Tổng hợp acid hydroxamic từ acid carboxylic 45 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 47 2.1. Nguyên liệu 47 2.2. Thiết bị 48 2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 49 2.3.1. Nội dung nghiên cứu 49 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu 49 2.3.2.1. Phương pháp tổng hợp 49 2.3.2.2. Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết 51 2.3.2.3 Phương pháp phân tích cấu trúc 52 2.3.2.4. Phương pháp thử hoạt tính sinh học 53 2.3.2.5. Docking 56 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 57 3.1. Tổng hợp hóa học và phân tích dữ liệu phổ 57 3.1.1. Các dẫn chất N 1 -(benzo[d]thiazol-2-yl)-N 4 -hydroxysuccinamid và N 1 -(benzo[d]thiazol-2-yl)-N 5 -hydroxyglutaramid 57 3.1.1.1. Kết quả tổng hợp 57 3.1.1.2. Kết quả phân tích phổ của các dẫn chất 3a - f và 5a - f 63 3.1.2. Các dẫn chất N 1 -(benzo[d]thiazol-2-yl)-N 6 -hydroxyadipamid và N 1 -(benzo[d]thiazol-2-yl)-N 8 -hydroxyoctandiamid 66 3.1.2.1. Kết quả tổng hợp 66 3.1.2.2. Kết quả phân tích phổ của các dẫn chất 7a - f và 9a - h 73 3.1.3. Tổng hợp chất N 1 -(thiazol-2-yl)-N 8 -hydroxyoctandiamid ( 23 ) 76 3.1.4. Các dẫn chất N 1 -(benzo[d]thiazol-2-yl)-N 4 -(3-(hydroxyamino)-3- oxopropyl)succinamid và N 1 -(benzo[d]thiazol-2-yl)-N 5 -(2-(hydroxy amino)-2-oxoethyl)glutaramid 77 v 3.1.4.1. Kết quả tổng hợp 77 3.1.4.2. Kết quả phân tích phổ của các dẫn chất 1 1a - d và 13a - f 82 3.1.5. Các dẫn chất N 1 -(3-(hydroxyamino)-3-oxopropyl)-N 4 - phenylsuccinamid và N 1 -(2-(hydroxyamino)2-oxoethyl)-N 5 -phenyl glutaramid 85 3.1.5.1. Kết quả tổng hợp 85 3.1.5.2. Kết quả phân tích phổ của các dẫn chất 17a - c, f, h và 20a - h 93 3.1.6. Tổng hợp N 1 -(4-clorophenyl)-N 6 -(3-(hydroxyamino)-3-oxopropyl) adipamid (26) 97 3.2. Hoạt tính sinh học 102 3.2.1. Tác dụng ức chế HDAC 102 3.2.2. Hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro 105 3.2.3. Hoạt tinh kháng tế bào ung thư in vivo 107 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 110 4.1. Tổng hợp hóa học 110 4.1.1. Tác nhân acyl hóa là anhydrid acid 110 4.1.2. Tác nhân acyl hóa là acid carboxylic 111 4.1.3. Tác nhân acyl hóa là ester 117 4.2. Khẳng định cấu trúc 118 4.2.1. Phổ hồng ngoại 118 4.2.2. Phổ khối lượng 120 4.2.2.1. Phân tích cụm pic ion phân tử 121 4.2.2.2. Cơ chế phá mảnh của phân tử theo cấu trúc dự kiến 122 4.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 126 4.2.3.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các acid hydroxamic mang khung benzothiazol 126 4.2.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các acid hydroxamic mang vòng phenyl 134 4.2.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của acid hydroxamic mang vòng thiazol 137 4.3. Hoạt tính sinh học 138 4.3.1. Các acid hydroxamic mang khung benzothiazol 138 4.3.2. Các acid hydroxamic mạch alkyl có liên kết amid 143 vi 4.3.3. Docking 147 4.3.4. Hoạt tính kháng tế bào ung thư in vivo 148 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 151 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT  (ppm) Độ dịch chuyển hóa học (phần triệu) 13 C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 ( 13 C-Nuclear Magnetic Resonance) 1 H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-Nuclear Magnetic Resonance) AcOH Acid acetic ADN Acid desoxyribonucleic AsPC-1 Dòng tế bào ung thư tụy người BCL2 B-cell lymphoma 2 CBFb Core-binding factor subunit beta CBP Cyclic-AMP response element-binding protein CDI Carbonyl diimidazol CTPT Công thức phân tử DCC Dicyclohexyl carbodiimid DCM Dicloromethan DMEM Dulbecco’s modified Eagle medium DMF Dimethylformamid DMSO-d 6 Dimethylsulfoxid deutri hóa ESI Ion hóa phun bụi điện tử (Electron Spray Ionization) FBS Huyết thanh bào thai bò (Fetal bovine serum) FDA Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm mỹ HAT Histon acetyltransferase HATU N-[(dimethylamino)-1H-1,2,3-triazol[4,5-b]pyridin-1ylmethylen]-N- methylmethanaminium hexafluorophosphat HDAC Histon deacetylase HDIs Các chất ức chế HDAC HDLP Histone deacetylase-like protein HMBC Phổ tương tác đa liên kết dị nhân HOBt 1-hydroxybenzotriazol HSQC Phổ tương tác dị nhân qua một liên kết IC 50 Nồng độ ức chế 50% IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectrometry) i Dịch chuyển điện tích J Hằng số tương tác (Hz) MCF-7 Tế bào ung thư vú người MeOH Methanol MOZ Monocytic leukemia zinc-finger protein viii MS Phổ khối lượng (Mass Spectrometry) MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid NCI-H460 Tế bào ung thư phổi người PBS Đệm phosphat (Phosphat buffered saline) PC-3 Tế bào ung thư tiền liệt tuyến người PCl 3 Phosphor triclorid PCl 5 Phosphor pentaclorid POCl 3 Phosphor oxyclorid PVDF Màng polyvinyliden difluorid rH Dịch chuyển hydro  RAR Receptor acid retinoic ROS Reactive oxygen species RPMI Môi trường nuôi cấy tế bào SAHA Acid suberoylanilid hydroxamic SDS-PAGE Gel SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfat polyacrylamid gel electrophoresis) Sin 3 Protein ức chế phiên mã SMMHC Tế bào cơ (Smooth muscle myosin heavy chain) SW620 Tế bào ung thư đại tràng người TSA Trichostatin A t o C Nhiệt độ nóng chảy WAF1 Chất ức chế kinase phụ thuộc cyclin ZBG Nhóm gắn ion Zn 2+ [...]... chất ức chế HDAC được chia thành 5 nhóm dựa theo cấu trúc hóa học, trong đó các dẫn chất acid hydroxamic được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu nhiều nhất do cấu trúc đơn giản dễ tổng hợp, hoạt tính ức chế HDAC mạnh Hội nhập với xu hướng nghiên cứu của thế giới và tìm kiếm chất ức chế HDAC có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt, luận án Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số. .. một số dẫn chất acid hydroxamic hướng ức chế enzym histon deacetylase được thực hiện với 2 mục tiêu: 1 Thiết kế và tổng hợp được khoảng 40 - 50 dẫn chất acid hydroxamic mới hướng ức chế HDAC 2 Thử tác dụng ức chế HDAC và tác dụng kháng tế bào ung thư của các chất tổng hợp được 1 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 HISTON DEACETYLASE Các nghiên cứu về ung thư đã xác định căn nguyên của bệnh không chỉ do cơ chế di... BOP 44 10 Sơ đồ 1.10 Tổng hợp một số dẫn chất amid ngược của SAHA 45 11 Sơ đồ 1.11 Tổng hợp acid biaryl hydroxamic 46 12 Sơ đồ 1.12 Tổng hợp các acid phenylthiazol hydroxamic 46 13 Sơ đồ 3.1 Tổng hợp các dẫn chất 3a-f, 5a-f 57 14 Sơ đồ 3.2 Tổng hợp N1-(6-nitrobenzo[d]thiazol-2-yl)-N5- 63 hydroxyglutaramid (5f) 15 Sơ đồ 3.3 Tổng hợp các dẫn chất 7a-f và 9a-h 66 16 Sơ đồ 3.4 Tổng hợp N1-(thiazol-2-yl)-N8-hydroxyoctandiamid... đồ 3.5 Tổng hợp các dẫn chất 11a-d và 13a-f 77 18 Sơ đồ 3.6 Tổng hợp các dẫn chất 17a-c, f, h và 20a-h 86 19 Sơ đồ 3.7 Tổng hợp N1-(4-clorophenyl)-N6-(3-(hydroxyamino)-3- 97 oxopropyl)adipamid (26) 20 Sơ đồ 4.1 Tổng hợp các chất trung gian 2a-f, 4a-f, 15a-c, 15f, 15h, 110 18a-h 21 Sơ đồ 4.2 Tổng hợp các acid hydroxamic 3a-f và 5a-f 111 22 Sơ đồ 4.3 Tổng hợp acid hydroxamic 3a-f bằng tác nhân hoạt hóa... đồ 4.10 Tổng hợp các aryltriazolylhydroxamat 117 30 Sơ đồ 4.11 Tổng hợp một số dẫn chất -alkoxy của SAHA 117 31 Sơ đồ 4.12 Cơ chế phản ứng tổng hợp các acid hydroxamic dãy 7, 9, 117 11, 13, 17 và 20, chất 23, 26 từ ester 32 Sơ đồ 4.13 Sơ đồ phá mảnh của chất 7a 123 33 Sơ đồ 4.14 Sơ đồ phá mảnh của chất 20f 125 xv ĐẶT VẤN ĐỀ Những tiến bộ trong các ngành khoa học cơ bản như di truyền học, sinh học phân... protein histon mà rất nhiều protein không histon cũng bị ảnh hưởng bởi hoạt tính của các HDAC Thuật ngữ các chất ức chế HDAC để chỉ các chất có khả năng ức chế HDAC nhóm I, II và IV [45,89] 1.1.2.2 Cấu trúc của HDAC và cơ chế phản ứng deacetyl hóa Việc xác định cấu trúc của HDAC rất cần thiết để xác định cơ chế tác dụng của HDAC, đồng thời dựa vào cấu trúc HDAC để thiết kế công thức cho các chất ức chế. .. chất ức chế HDAC 13 2 Bảng 1.2 Các chất ức chế HDAC đã và đang được thử lâm sàng 19 3 Bảng 1.3 Tác dụng ức chế HDAC2 và độc tính tế bào của dẫn chất 28 -alkoxy (AH10) 4 Bảng 3.1 Kết quả phân tích phổ khối của các chất 3a-f, 5a-f 64 5 Bảng 3.2 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các chất 3a-f, 5a-f 64 6 Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của các chất 5a-f 66 7 Bảng 3.4 Kết quả phân tích phổ khối của. .. quan đến cơ chế kháng ung thư của các chất ức chế HDAC Ngoài tác dụng trực tiếp lên sự phát triển và sống sót của tế bào ung thư, các chất ức chế HDAC còn tác dụng gián tiếp đến sự phát triển khối u Các chất ức chế HDAC có thể hoạt hóa phức hợp hòa hợp mô (MHC) nhóm I và II liên quan đến phiên mã, những phân tử đồng kích thích CD40, CD80 và CD86, phân tử gắn vào khoảng gian bào ICAM1, và các interferon... chất 9g 132 24 Bảng 4.3 Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của chất 23 137 25 Bảng 4.4 Tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào in vitro của các 140 chất 7a-f 26 Bảng 4.5 Tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào in vitro của các 141 chất 9a-h 27 Bảng 4.6 Năng lượng liên kết với trung tâm hoạt động của HDAC 147 28 Bảng 4.7 Kết quả ức chế sự phát triển khối u in vivo của chất 9g ở 149 các liều khác nhau với dòng... acid pyridin-thiophen -hydroxamic 33 32 Hình 1.32 Các dẫn chất biphenyl sulfamid 34 33 Hình 1.33 Một số dẫn chất sulfamid khác 34 34 Hình 1.34 Các dẫn chất sulfamid không mang cầu nối amid 35 35 Hình 1.35 Một số dẫn chất trithiocarbonat 35 36 Hình 1.36 Một số trithiocarbonat khác và chất tương tự 36 37 Hình 1.37 Các dẫn chất thiol 36 38 Hình 1.38 Từ disulfid đến KD5170 37 39 Hình 1.39 Sự thủy phân và . xu hướng nghiên cứu của thế giới và tìm kiếm chất ức chế HDAC có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt, luận án “Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số dẫn chất acid hydroxamic hướng ức chế. DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐÀO THỊ KIM OANH TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT ACID HYDROXAMIC HƯỚNG ỨC CHẾ ENZYM HISTON DEACETYLASE. DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐÀO THỊ KIM OANH TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT ACID HYDROXAMIC