29 TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 52, 2009 NGHIÊN CỨU THU NHẬN GIAO TỬ VÀ PHÔI CÁ CH ẠCH (Misgurnus anguillicaudatus) MỘT TẾ BÀO Trần Quốc Dung Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế TÓM TẮT Cá chạch là loài cá nước ngọt. Không như các loài cá khác, chúng đẻ trứng suốt từ mùa xuân cho đến mùa thu. Vì vậy, cá chạch được sử dụng làm đối tượng nghiên cứu chuyển gen trong các phòng thí nghiệm. Để làm chủ thời gian chuyển gen vào phôi cá đang phát triển thì thụ tinh nhân tạo là một bước bắt buộc trong kỹ thuật vi tiêm. Cá chạch đực và cái được phân biệt bằng cách dựa vào sự khác biệt hình thái của vây ngực. Sau khi gây kích thích bằng hormone qua đêm, trứng thành thục và tinh dịch được thu nhận từ cá bố mẹ. Thụ tinh nhân tạo được tiến hành trong đĩa Petri với tỉ lệ 100 µl tinh dịch/100 trứng. Kết quả nghiên cứu cho thấy kích thích sinh sản nhân tạo bằng cách tiêm não thùy thể cá chép hai lần vào xoang thân và thụ tinh nhân tạo bằng phương pháp thứ ba (vừa lấy trứng vừa lấy tinh dịch) cho hiệu quả tốt hơn. Từ khoá: Misgurnus anguillicaudatus, não thùy thể cá chép, thụ tinh nhân tạo, vi tiêm. I. Mở đầu Cá ch ạch (Misgurnus anguillicaudatus) thuộc lớp Cá chạch, là cá nước ngọt. Ở n ước ta, cá chạch là loài cá rất thường gặp ở các ao, hồ, kênh mương, đồng ruộng Khác v ới các loài cá khác, cá chạch đẻ trứng suốt từ mùa xuân đến mùa thu. Do vậy, chúng được sử dụng trong các phòng thí nghiệm để nghiên cứu chuyển gen [7, 9]. Với m ục đích làm chủ thời gian chuyển gen vào phôi cá đang phát triển thì thụ tinh nhân tạo là m ột bước bắt buộc trong kỹ thuật vi tiêm [10]. Để góp phần vào việc hoàn thiện ph ương pháp nghiên cứu chuyển gen vào cá chúng tôi tiến hành nghiên cứu thu nhận giao t ử và phôi một tế bào chuNn bị cho kỹ thuật vi tiêm DNA vào cá chạch. II. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu - Cá ch ạch (Misgurnus anguillicaudatus) (Hình 1) sử dụng trong các thí nghiệm nghiên c ứu được thu thập ở Nghĩa Ðô, Cầu Giấy, Hà Nội. - Não thùy th ể cá chép do Công ty Dịch vụ và Nuôi trồng thuỷ sản trung ương (Ng ọc Khánh, Ba Đình, Hà Nội) cung cấp. - Ph ương pháp thu nhận giao tử và thụ tinh nhân tạo được tiến hành theo Chung Lân và cs (1969): 30 + Phân biệt đực, cái: Dựa vào vây ngực (Hình 2). + Ch ọn cá bố mẹ: chọn cá khỏe mạnh đang ở độ tuổi thành thục sinh dục. + Li ều lượng tuyến yên cá chép dùng để tiêm cho cá chạch là 0,5 cái cho mỗi con cái, l ượng tiêm cho cá đực bằng nửa cá cái. + Ph ương pháp tiêm: tiêm vào xoang thân và tiêm bắp thịt + S ố lần tiêm: tiêm một lần và tiêm hai lần. Với cách tiêm hai lần thì lần đầu được tiêm vào buổi trưa, lần thứ hai vào hai giờ sáng để điều khiển cá đẻ lúc rạng đông. Hình 1: Cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) + Th ụ tinh nhân tạo: thụ tinh khô với 4 phương pháp khác nhau. Ph ương pháp 1: sau khi lấy trứng, cho tinh dịch đã lấy sẵn vào cốc nhỏ có nước mu ối sinh lý (lượng nước muối sinh lý gấp 10 lần tinh dịch) lắc đều, rồi tưới đều lên tr ứng. Ph ương pháp 2: đổ tinh dịch đã hòa với nước muối sinh lý vào khay thụ tinh sau đó cho trứng vào, lắc nhẹ khay thụ tinh làm cho trứng và tinh trùng sớm tiếp xúc với nhau. Phương pháp 3: vừa lấy trứng vừa lấy tinh dịch. Trong khi lấy trứng thì đồng th ời có một số người khác lấy tinh dịch và tưới nhanh vào trứng. Ph ương pháp 4: lấy trứng trước, lấy tinh dịch sau. Sau khi lấy trứng, trực tiếp vu ốt ngay tinh dịch của cá đực vào trứng. B ất kỳ áp dụng phương pháp nào, sau khi đã trộn lẫn tinh dịch với trứng cũng c ần dùng lông gà khuấy nhẹ để thúc đNy quá trình thụ tinh. Vây ng ực cá đực Vây ng ực cá cái Hình 2: Vây ng ực cá chạch đực và cá chạch cái 31 III. Kết quả và thảo luận 3.1. S ố lần tiêm não thùy thể cá chép Ð ể chủ động thu nhận trứng, tinh dịch và thụ tinh nhân tạo, cá chạch được kích thích sinh s ản bằng cách tiêm não thùy thể cá chép (bảo quản trong dịch thể). Hiện nay, trong ph ương pháp kích thích sinh sản cá nuôi người ta có thể tiêm một lần hoặc hai lần. Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm so sánh hiệu quả kích thích sinh sản bằng cách tiêm m ột lần và tiêm hai lần để chọn ra phương pháp cho kết quả tốt, phù hợp với các điều ki ện nghiên cứu trong phòng thí nghiệm. B ảng 1: Hiệu quả kích thích sinh sản cá chạch bằng số lần tiêm não thùy thể cá chép Đợt thí nghi ệm Tiêm 1 l ần Tiêm 2 lần Số cá kích thích (con) S ố cá cho tr ứng (con) T ỉ lệ cá cho tr ứng (%) Tỉ lệ tr ứng n ở (%) S ố cá kích thích (con) S ố cá cho tr ứng (con) Tỉ lệ cá cho tr ứng (%) Tỉ lệ tr ứng n ở (%) 1 13 5 38,46 67,00 13 7 53,84 69,00 2 8 5 62,50 65,00 8 6 75,00 72,00 3 9 6 66,66 68,00 9 9 100,00 78,00 4 16 10 62,50 72,00 16 14 87,50 85,00 5 14 7 50,00 76,00 14 10 71,42 89,00 6 12 6 50,00 80,00 12 10 83,33 91,00 Trung bình 72 39 55,02 71,33 72 56 78,52 80,67 Kết quả ở bảng 1 cho thấy, tỉ lệ đẻ trứng và tỉ lệ nở của cá chạch được tiêm một l ần trung bình đạt 55,02% (từ 38,46 - 66,66%) và 71,33% (từ 65,00 - 80,00%); tiêm hai l ần là 78,52% (từ 53,84 - 100%) và 80,67% (từ 69,00 - 91,00%). Như vậy, tỉ lệ cho tr ứng và tỉ lệ nở của cá chạch được tiêm hai lần đạt 142,71% và 113,09% so với tỉ lệ cho tr ứng và tỉ lệ nở của cá chạch tiêm một lần. Kết quả này cho thấy hiệu quả kích thích sinh s ản cá chạch bằng cách tiêm não thùy thể cá chép hai lần cao hơn cách tiêm m ột lần. Như chúng ta đã biết, quá trình thành thục của trứng từ cuối giai đoạn IV chuy ển sang giai đoạn V cần có một thời kỳ quá độ. Do đó, trong trường hợp sử dụng cách tiêm m ột lần toàn bộ lượng thuốc, nhìn chung, nhất định sẽ có ảnh hưởng không t ốt, tạo nên những phản ứng sinh lý vội gấp, cơ năng sinh dục không được điều hòa, như có hi ện tượng bụng cá phình lên quá nhanh, quá to làm giảm tỉ lệ cho trứng và tỉ lệ nở. H ơn nữa, dùng cách tiêm hai lần còn có thể coi lần tiêm thứ nhất là lần sát hạch cuối cùng để lựa chọn cá bố mẹ thành thục. 32 3.2. Vị trí tiêm não thùy thể cá chép V ề phương pháp tiêm cá thì hiện nay có hai cách tiêm: tiêm vào xoang thân và tiêm vào b ắp thịt. Kết quả kích thích sinh sản nhân tạo cá chạch bằng hai phương pháp tiêm khác nhau được trình bày ở bảng 2. B ảng 2: Hiệu quả kích thích sinh sản cá chạch bằng các phương pháp tiêm khác nhau Đợt thí nghi ệm Tiêm vào xoang thân Tiêm vào bắp thịt Số cá được tiêm (con) S ố cá cho tr ứng (con) T ỉ lệ cá cho tr ứng (%) T ỉ lệ tr ứng n ở (%) S ố cá được tiêm (con) S ố cá cho tr ứng (con) T ỉ lệ cá cho tr ứng (%) T ỉ lệ tr ứng n ở (%) 1 10 7 70,00 79,00 10 6 60,00 80,00 2 6 4 66,66 85,00 6 4 66,66 82,00 3 12 8 66,66 72,00 12 5 41,66 68,00 4 8 7 87,50 70,00 8 7 87,50 65,00 5 10 8 80,00 89.00 10 7 70,00 85,00 6 8 6 75,00 84,00 8 5 62,50 80,00 Trung bình 54 40 74,30 79,83 54 34 64,72 76,67 Bảng 2 cho thấy tỉ lệ cá cho trứng và tỉ lệ nở của cá chạch được tiêm não thùy th ể cá chép bằng phương pháp tiêm vào xoang thân là 74,30% (từ 66,66 - 87,50%) và 79,83% (t ừ 70,00 - 89,00%); của cá chạch được tiêm não thùy thể cá chép bằng phương pháp tiêm b ắp thịt tương ứng là 64,72% (từ 41,66 - 87,50%) và 76,67% (từ 65,00 - 85,00%). Nh ư vậy, tỉ lệ cá cho trứng và tỉ lệ nở của cá chạch được tiêm não thủy thể cá chép vào xoang thân đạt 117,64% và 104,13% so với cá chạch được tiêm não thùy thể cá chép vào b ắp thịt. Kết quả này cho thấy kích thích sinh sản cá chạch bằng phương pháp tiêm vào xoang thân cho hi ệu quả tương đối chắc chắn hơn phương pháp tiêm vào b ắp thịt. 3.3. Phương pháp thụ tinh nhân tạo B ảng 3: Kết quả thụ tinh nhân tạo cá chạch theo các phương pháp thụ tinh khác nhau Ph ương pháp th ụ tinh Đợt thí nghi ệm S ố trứng thụ tinh (cái) Số trứng nở (cái) Tỉ lệ nở (%) Ph ương pháp 1 1 2 3 4 5 100 100 100 100 100 76 68 71 65 82 76,00 68,00 71,00 65,00 82,00 ∑ = 500 ∑ = 362 =x 72,40 33 Phương pháp 2 1 2 3 4 5 100 100 100 100 100 69 72 78 64 75 69,00 72,00 78,00 64,00 75,00 ∑ = 500 ∑ = 358 =x 71,60 Phương pháp 3 1 2 3 4 5 100 100 100 100 100 86 92 72 80 78 86,00 92,00 72,00 80,00 78,00 ∑ = 500 ∑ = 408 =x 81,60 Ph ương pháp 4 1 2 3 4 5 100 100 100 100 100 83 69 74 78 75 83,00 69,00 74,00 78,00 75,00 ∑ = 500 ∑ = 379 =x 75,80 Trứng và tinh dịch được thu nhận vào đầu chu kỳ sáng để tiến hành thụ tinh nhân t ạo với tỉ lệ 100 µl tinh dịch/100 trứng. Kết quả thụ tinh nhân tạo cá chạch theo các ph ương pháp khác nhau được trình bày ở bảng 3. Nhìn vào b ảng 3 ta thấy các phương pháp thụ tinh nhân tạo 1, 2, 3 và 4 cho tỉ lệ nở l ần lượt là 72,40%; 71,60%; 81,60% và 75,80%. Như vậy, phương pháp thụ tinh thứ 3 cho t ỉ lệ nở cao nhất. Trong hai phương pháp thụ tinh 1 và 2 đều lấy tinh trùng trước, thời gian ti ến hành thụ tinh dài. Ở phương pháp thụ tinh 4 lấy trứng trước và vuốt ngay tinh d ịch của cá đực vào trứng nên có thể giảm bớt thời gian lấy tinh dịch. Trong khi đó, đối v ới phương pháp thụ tinh 3, vừa lấy trứng vừa lấy tinh dịch, do đó, thời gian thụ tinh là ng ắn nhất. Mặt khác, các thí nghiệm này được tiến hành vào mùa nóng (tháng 5, 6, 7) nên tr ứng sau khi ra khỏi cơ thể mẹ mất khả năng thụ tinh rất nhanh. Thời gian thụ tinh càng dài t ỉ lệ trứng mất khả năng thụ tinh càng lớn do đó tỉ lệ nở càng giảm. Tóm lại, trong 4 ph ương pháp thụ tinh nhân tạo nói trên, phương pháp thứ 3 cho hiệu suất cao nhất. IV. K ết kuận - Kích thích sinh s ản nhân tạo cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) bằng ph ương pháp tiêm não thùy thể cá chép hai lần cho hiệu quả cao hơn tiêm một lần và ph ương pháp tiêm vào xoang thân cho hiệu quả cao hơn tiêm vào bắp thịt. - Trong các ph ương pháp thụ tinh nhân tạo, phương pháp 3 (vừa lấy trứng vừa l ấy tinh dịch) cho hiệu quả thu nhận phôi cá chạch một tế bào cao nhất. 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Văn Cường, Vũ Văn Diễn, Nguyễn Kim Độ, Nguyễn Thị Diệu Thúy, Quyền Đình Thi, Trần Quốc Dung, Tạo cá chuyển gen hormone sinh trưởng người, Kỷ yếu Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 9-10/12/1999. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, (1999), 1429-1437. 2. Trần Quốc Dung, Nghiên cứu chuyển gen hormone sinh trưởng người vào cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) bằng vi tiêm, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, 2001. 3. Trần Quốc Dung, Quyền Đình Thi, Nguyễn Thị Diệu Thúy, Nguyễn Văn Cường, Đặng Hữu Lanh, Tinh sạch và đánh giá sơ bộ gen hormone sinh trưởng người để chuyển vào cá vàng và cá chạch, Tạp chí Di truyền học và Ứng dụng, Số 2, (1999), 39-44. 4. Trần Quốc Dung, Vũ Văn Diễn, Nguyễn Kim Độ, Quyền Đình Thi, Nguyễn Thị Diệu Thúy, Nguyễn Văn Cường, Đặng Hữu Lanh, Tạo cá chạch mang gen hormone sinh trưởng người, Tạp chí Sinh học, 21(3) (1999), 24-28. 5. Nguyễn Kim Độ, Nguyễn Văn Cường, Nguyễn Thị Diệu Thúy, Trần Quốc Dung, Kết quả nghiên cứu khử màng chorion của phôi giai đoạn một tế bào chun bị cho kỹ thuật vi tiêm vào cá chạch Misgurnus anguillicaudatus, Kỷ yếu Viện Công nghệ sinh học, Trung tâm KHTN và CNQG, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, (1997), 267-272. 6. Nguyen Kim Do, Nguyen Van Cuong, Nguyen Thi Dieu Thuy, Tran Quoc Dung, Some results on generation of transgenic animal: Fish by methallothionein human growth hormone (MThGH) gene microinjection, Proceedings, third Asian Symposium of Korean Society of Animal Reproduction, Korea 11-14/12/1997, (1997), 108-114. 7. Chung Lân, Lý Hữu Quảng, Trương Tùng Đào, Lưu Gia Chiếu, Trần Phấn Xương (Người dịch: Dương Tuấn, Nguyễn Kim Độ, Trần Nguyệt Thu, Trần Nhất Anh), Sinh vật học và sinh sản nhân tạo các loài cá nuôi, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 1969. 8. Patrick J. Babin, Joan Cerda, Esther Lubzens, The Fish Oocyte: From Basic Studies to Biotechnological Applications, Published by Singer, The Netherlandsm, 2007. 9. Nguyễn Khoa Diệu Thu, Văn Thị Hạnh, Nguyễn Hằng, Xây dựng phương pháp thu nhận giao tử và phôi một tế bào chun bị cho kỹ thuật vi tiêm DNA vào cá vàng Carassius auratus, Tạp chí Khoa học và Công nghệ XXXII, 2 (1994), 6-11. 10. Zhu Z., Generation of fast growing transgenic fish: Method and mechanism, Transgenic fish, World Scientific, (1993), 93-119. 35 THE COLLETION OF GAMETES AND MONOCELLULAR EMBRYOS OF LOACH (Misgurnus anguillicaudatus) Tran Quoc Dung College of Pedagogy, Hue University SUMMARY Loach is a fresh water fish species. Unlike other fish species, loach spawns from spring to fall. It has been used in the laboratory for the study of transgenesis. In order to control the time course of gene introduction into developing fish embryo, artificial fertilzation is required. Females and males are identified by the morphology of the pectoral fin. After an overnight hormonal induction, the mature eggs and milt were striped from parent fish. About one hundred eggs were collected in Pestri dish and mixed with 100 µl milt. The outcomes show that fish injected intraperitoneally two times by carp pituitary with the third artificial fertilization way (collect eggs and milt at the same time) are better. Keywords: Misgurnus anguillicaudatus, carp pituitary, artificial fertilization, microinjection. . chúng tôi tiến hành nghiên cứu thu nhận giao t ử và phôi một tế bào chuNn bị cho kỹ thu t vi tiêm DNA vào cá chạch. II. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu - Cá ch ạch (Misgurnus anguillicaudatus). Nguyễn Khoa Diệu Thu, Văn Thị Hạnh, Nguyễn Hằng, Xây dựng phương pháp thu nhận giao tử và phôi một tế bào chun bị cho kỹ thu t vi tiêm DNA vào cá vàng Carassius auratus, Tạp chí Khoa học và Công. ng ực cá đực Vây ng ực cá cái Hình 2: Vây ng ực cá chạch đực và cá chạch cái 31 III. Kết quả và thảo luận 3.1. S ố lần tiêm não thùy thể cá chép Ð ể chủ động thu nhận trứng, tinh dịch và