PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) CÁC THÀNH PHẦN CỦA PHẢN ỨNG PCR 1. Primer (mồi) Mồi phải thỏa một số điều kiện cơ bản : (1) dài khoảng 18-24 base, (2) Tm của 2 primer gần nhau, (3) [G:G] 40-60%, (4) không hình thành primer dimer, (5) không phải là trình tự lặp lại. 2. DNA bản mẫu (template) Hàm lượng đủ nhưng không quá cao, tinh sạch – không chứa các chất ức chế phản ứng (SDS, chất ức chế từ mẫu (hemoglobin, sắc tố, ), heparin, ) 3. Nồng độ MgCl 2 Cần cho hoạt động của Taq polymerase ; hàm lượng quá cao sẽ tạo nhiều sản phẩm ký sinh, quá thấp thì làm giảm hiệu quả nhân bản của enzyme 4. dNTP Thành phần 4 loại dNTP phải cân bằng ; hàm lượng thường không đổi nhưng có thể thay đổi tùy điều kiện thực tế 5. Enzyme Được chọn tùy mục đích sử dụng : W Taq DNA polymerase ( Thermus aquaticus ) : thông dụng nhất, hoạt tính polymerase khá mạnh (35-100 nu/giây), có hoạt tính 5’3’ exonuclease Stoffel DNA polymerase : tính chòu nhiệt cao hơn, không có hoạt tính 5’-3’ exonuclease, hoạt động được ở phổ MgCl2 rộng  multiplex PCR Taq và Stoffel DNA polymerase thêm 1 3’dA vào sản phẩm PCR W Vent/DeepVent DNA polymerase ( Thermococcus litoralis ) : tính chòu nhiệt rất cao, nhân bản được những đọan DNA rất dài, có hoạt tính 3’-5’ exonuclease  tính trung thực cao hơn Taq pol 5-15 lần, tạo sản phẩm “đầu bằng” W Pfu DNA polymerase ( Pyrococcus furiosus ) : có cả 2 hoạt tính 5’-3’ và 3’-5’ exonuclease, tính trung thực cao hơn Taq pol 12 lần, thường dùng trong cycle sequencing W Tth DNA polymerase ( Thermus thermophilus ) : vừa có chức năng polymerase vừa có chức năng phiên mã ngược (RT)  dùng trong phản ưng RT-PCR W UlTma DNA polymerase ( Thermotoga maritima ) : tính chòu nhiệt rất cao, có hoạt tính 3’-5’ exonuclease  tính trung thực rất cao CÁC THÀNH PHẦN CỦA PHẢN ỨNG PCR (tiếp) 5. Chương trình PCR : W Nhiệt độ : biến tính – 94-95 q C ; lai < Tm của các primer ~ 5 q C ; kéo dài - 72 q C W Thời gian của từng chu kỳ tùy thuộc thiết bò và kích thước sản phẩm W Số lượng chu kỳ thường  40 Ví dụ : 1 chu kỳ - 95 q C – 5‘ 35 chu kỳ – 94 q C – 30” 55 q C – 30” 72 q C – 45” 1 chu kỳ – 72 q C – 10’ 6. Thiết bò : Những cải tiến máy luân nhiệt liên quan đến (1) microtiter plate 96 giếng, (2) các block nhiệt riêng biệt trong 1 máy, (3) block dùng cho lam kính để tiến hành in situ PCR. 7. Dụng cụ : Ống Eppendorf “thành mỏng” (thin-wall), đầu tip có phin lọc CÁC THÀNH PHẦN CỦA PHẢN ỨNG PCR (tiếp) NH Ư Õ NG HA Ï N CHE Á CỦA KỸ THUA Ä T PCR – CÁCH KHẮÊC PHỤC 1. Ngoại nhiễm cao do khả năng nhân bản DNA mạnh Ỵ Phân chia khu vực thí nghiệm, sử dụng đầu tip có phin lọc, găng tay thay thường xuyên, chiếu tia UV khu vực thí nghiệm, sử dụng hệ thống dUTP-ung, 2. Sai sót của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp Ỵ Lặp lại phản ứng PCR nếu cần thiết, sử dụng loại polymerase có tính trung thực cao như Pfu , DeepVent, UlTma polymerase. 3. Kết quả phụ thuộc rất lớn vào toàn bộ thao tác Ỵ Kỹ thuật viên cần được đào tạo tốt, tự động hóa, sử dụng hóa chất pha sẳn (kit) đã được chuẩn hóa 4. Thiết bò đắt tiền MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PCR 1. PCR : sử dụng 1 cặp mồi ; sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di 2. Nested / Semi-nested PCR : sử dụng 1 cặp mồi “ngoài” và 1 mồi/1 cặp mồi “trong” để tăng tính đặc hiệu và độ nhạy của phản ứng PCR 3. Multiplex PCR : sử dụng nhiều hơn 1 cặp mồi trong 1 phản ứng PCR để phát hiện đồng thời nhiều trình tự DNA của 1 tác nhân (A) hay nhiều tác nhân (B) (A) (B) MO Ä T SO Á PH Ư ƠNG PHA Ù P PCR (tie á p) 4. AP-PCR (Arbitrary Primed)/RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) : sử dụng tổ hợp các primer “ngẫu nhiên” để xác dònh “dấu ấn di truyền” của loài (1) (2) 5. RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) : nhân bản hai đầu mút 5’ và 3’ của 1 trình tự exon với 1 mồi đặc hiệu và 1 mồi “chung” 6. In situ PCR : thực hiện phản ứng PCR ngay trên mô/tế bào 7. PCR đònh lượng : đònh lượng sản phẩm PCR theo thời gian thực dựa trên mẫu dò phát hùynh quang AAAAAAAA TTTTTT AAAAA TTTTTTT RT-PCR Gồm 2 bước : 1. RT (Phiên mã ngược) : tạo cDNA 2. PCR : nhân bản cDNA Dùng để nhân bản RNA REAL-TIME PCR Dùng đònh lượng DNA hoặc RNA (real-time RT-PCR) Đònh lượng dựa trên số tín hiệu huỳnh quang/phản ứng mà máy đọc được Tác nhân đánh dấu thuộc hai nhóm : W Chất phát huỳnh quang liên kết với DNA mạch đôi (SYBR Green, Ethidium bromide) sẽ phát huỳnh quang W Chất phát hùynh quang dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu TaqMan probe KẾT QUẢ PCR REAL-TIME C A B 10 1 bản sao 10 1 bản sao Dựng đường chuẩn (standard curve) với một chất chuẩn có nồng độ đã biết. Hàm lượng của thành phần cần phát hiện được tính dựa trên đường chuẩn này Ct (Cycle threshold - chu kỳ ngưỡng) : chu kỳ PCR ở đó tín hiệu đặc hiệu vượt khỏi tín hiệu nền Ghi chú : đường màu đỏ là t1n hiệu nền [...]... The Single-Priming Method PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG 2 PRIMER ĐỘT BIẾN PHƯƠNG PHÁP KUNKEL dut : dUTPase ung : uracil-DNA-glycosylase PHƯƠNG PHÁP “TÁI SẮP XẾP DNA” (DNA SHUFFLING) Gồm các bước : • “Đục lỗ” DNA bằng Dnase I • Tiến hành PCR không có mồi : - Biến tính - Tái bắt cặp - Kéo dài Tạo ra những trình tự DNA “lai” (W.P Stemmer (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 1074 7-1 0751) CHUYỂN VẬT LIỆU DI TRUYỀN Ở... PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ MAXAM-GILBERT Các phản ứng giải trình tự : C : Hydrazine trong NaCl cắt base C G : G được methyl hóa bằng dimethylsulfate sau đó bò cắt bằng kiềm G + A : Formic acid cắt liên kết giữa base và đường T + C : Hydrazine cắt vòng pyrimidine Bước cuối : Piperidine cắt các base biến đổi KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ HÓA HỌC Kết quả của kỹ thuật phóng xạ tự ghi (autoradiography) PHƯƠNG PHÁP GIẢI... (Embryonic Stem Cell – tế bào mầm) CÂU HỎI PHẦN 6 1 Những yếu tố nào quyết đònh tính đặc hiệu ? độ nhạy của phương pháp PCR ? 2 Làm cách nào tăng tính đặc hiệu, độ nhạy của phương pháp PCR ? 3 Những cách hạn chế các nhược điểm của phương pháp PCR 4 Nêu một số ứng dụng của nested-,multiplex, AP-PCR, RACE, in situ PCR 5 Nêu cách thực hiện phản ứng real-time RT-PCR 6 Đường chuẩn là gì ? Xây dựng như thế nào... cần giải PHƯƠNG PHÁP SANGER (ENZYME HỌC) (DIDEOXY SEQUENCING METHOD) Nguyên lý : dựa trên sự tổng hợp DNA kết hợp với từng loại dideoxynucleotide Các bước chính : 2 Biến đổi hóa học đặc hiệu các base 1 Thu nhận trình tự DNA cần giải 3 Loại bỏ các base biến đổi 2 Nhân bản trình tự này với dNTP và từng loại ddNTP 4 Cắt mạch DNA ở vò trí bò loại bỏ base Điện di phân tách các trình tự DNA tạo thành của... polymerase thường thêm 1A vào đầu 3’ sử dụng T-vector để tạo dòng sản phẩm PCR Còn gọi là T-A cloning PCR “NGƯC“ Dùng nhân bản vùng nằm hai bên một vùng đã biết trình tự PCR „“TÁI TỔ HP“ Dùng để nối nhiều trình tự ngắn thành một trình tự dài, Ví dụ : nối promoter của gene A với vùng mã hóa của gene B GIẢI TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE (SEQUENCING) PHƯƠNG PHÁP MAXAM-GILBERT (HÓA HỌC) Nguyên lý : dựa trên sự phân... USA 91: 1074 7-1 0751) CHUYỂN VẬT LIỆU DI TRUYỀN Ở THỰC VẬT Sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có mang plasmid Ti tái tổ hợp để chuyển gene vào tế bào thực vật MỘT SỐ BIỆN PHÁP CHUYỂN VẬT LIỆU DI TRUYỀN Phương pháp bắn gene Phương pháp vi tiêm Phương pháp biến nạp Phương pháp dùng vector virus CHUYỂN GENE Ở ĐỘNG VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI TIÊM CHUYỂN GENE Ở ĐỘNG VẬT LIỆU PHÁP GENE Ở ĐỘNG VẬT : Chuyển... phương pháp ? 10 Có thể gây đột biến điểm không đònh hướng như thế nào ? 11 Có thể gây đột biến điểm đònh hướng như thế nào ? 12 Nêu một ứng dụng củ phương pháp “DNA Shuffling” 13 Cách chuyển vật liệu di truyền (VLDT) ở thực vật 14 Chuyển VLDT ở động vật : các cách tiếp cận và ưu nhược điểm của chúng . THÀNH PHẦN CỦA PHẢN ỨNG PCR 1. Primer (mồi) Mồi phải thỏa một số điều kiện cơ bản : (1) dài khoảng 1 8-2 4 base, (2) Tm của 2 primer gần nhau, (3) [G:G] 4 0 -6 0%, (4) không hình thành primer dimer,. có hoạt tính 3 -5 ’ exonuclease  tính trung thực cao hơn Taq pol 5-1 5 lần, tạo sản phẩm “đầu bằng” W Pfu DNA polymerase ( Pyrococcus furiosus ) : có cả 2 hoạt tính 5 -3 ’ và 3 -5 ’ exonuclease,. HO Ï C Kết quả của kỹ thuật phóng xạ tự ghi (autoradiography) PHÖÔNG PHAÙP GIAÛI TRÌNH TÖÏ SANGER GIAÛI TRÌNH TÖÏ TÖÏ ÑOÄNG MỘT SỐ BIỆN PHÁP GÂY ĐỘT BIẾN ĐIỂM ĐỊNH HƯỚNG The Single-Priming Method