CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM CHẨN ĐOÁN NẤM GÂY BỆNH (Mycosis diagnosis) Phương pháp xét nghiệm trực tiếp 1.1 Yêu cầu Xét nghiệm nấm gây bệnh tương tự xét nghiệm vi khuẩn gây bệnh Những bệnh nhân nghi ngờ nấm gây nên tiến hành xét nghiệm trực tiếp soi kính hiển vi ni cấy mơi trường thích hợp để xác định tính chất sinh hố học từ định rõ li nấm gây bệnh Trong cơng tác xét nghiệm nấm cần lưu ý điều kiện vệ sinh dụng cụ khơng khí xung quanh nới làm xét nghiệm , khơng khí bào tử sợi nấm tạp thường xuất Nếu không ý vệ sinh dễ lây nhiễm ảnh hưởng đến kết xét nghiệm Một số yếu tố có liên quan đến kết xét nghiệm + Bệnh phẩm : trước làm xét nghiệm bệnh nhân phải ngừng thuốc điều trị kháng nấm - tuần + Nếu khơng ngừng thuốc nấm tạm thời " bién mất" " thể lặn" làm cho kỹ thuật viên tìm không + Các thuốc mỡ tồn da khiến vi trường có nhiều hạt mỡ khó xem, làm cản trở tầm nhìn người quan sát + thuốc màu làm cho da bị nhuộm mau, xanh hay tím, đỏ, làm che khuất cấu trúc vi nấm + Người quan sát soi phải có định hướng sở tóm tắt lâm sàng 1.2 Xét nghiệm nấm ngồi da soi kính hiển vi 1.2.1 Bệnh phẩm để xét nghiệm trực tiếp nấm da tóc, lơng,vẩy da đầu, vẩy da mặt, chan, tay, bụng, bẹn, kẽ chân, móng tay,v.v vẩy da bệnh phẩm lấy từ nơi viêm nhiễm nghi có nấm, bệnh phẩm thường lấy phịng xét nghiệm nấm 1.2.2 Dụng cụ phương tiện Dao đầu nhọn, dao trích, kéo, kim, que cấy, phiến kính sạch, lame, gạc, cồn 70o C, đèn cồn để đốt Kính hiển vi 1.2.3 Dung dịch, hố chất + Dung dịch nhuộm gram để xét nghiệm trực tiếp nhuộm nấm hệ thống + Dung dịch KOH 20% để xét nghiệm nấm da + Để làm tiêu xét nghiệm trong, giữ tiêu lâu dài phục vụ xét nghiệm huấn luyện dung dịch KOH có thêm glycerin theo công thức sau dung dịch DMSO Dung dịch KOH 20% : - KOH 20 gam ; glycerin 20 ml + nước cất vừa đủ 100 ml - Dung dịch DMSO Nước cất 60 ml KOH 20 gam Dimetyslfoxide 40 ml 1.2.4 Phương pháp tiến hành + Lấy bệnh phẩm : dùng kính lúp có độ phóng đại từ 5-6 lần để quan sát nơi bị viêm nhiễm da tổn thương dùng cồn 70o sát khuẩn qua để laọi trừ bụi, chất bẩn Sau dùng dao hơ vô trùng đèn cồn, cạo lấy vẩy da hay chất sừng vào phiến kính hơ đèn cồn, lấy bệnh phẩm, tóc, lơng dùng kéo để cắt, cắt tóc lơng ngắn độ khoảng 0,1-1 cm dồn bệnh phẩm vào phiến kính + Khi lấy bệnh phẩm xong ta nhỏ 1-2 giọt dung dịch KOH 20% vào bệnh phẩm Sau đặt lên bệnh phẩm lame vô trùng, dùng đầu mũi dao ấn nhẹ xuống lame để dàn bệnh phẩm lam kính, để nhiệt độ phịng 45 phút soi hơ phiến kính bệnh phẩm đèn cồn, ta hơ hơ lại nhẹ nhàng cho nóng, không sủi bọt để nguội sau đem soi Chú ý : soi quan sát bệnh phẩm phải khắp vi trường để tìm sợi nấm Sợi nấm , đoạn sợi nấm hay bào tử đốt bộc lộ đám tế bào sừng tổ chức da đứng riêng rẽ tách rời khỏi tế bào da, cần phân biệt sợi nấm với sợi khác Sợi nấm thường cong queo, ngoằn ngoèo mềm mại có phân nhánh chiết quang hơn, thành sợi nấm thường dầy trông giống sợi " miến ăn" + Trả lời kết : - Soi có sợi nấm, đoạn sợi nấm có bào tử nấm - Hoặc : không thấy sợi nấm, đoạn sợi nấm không thấy có bào tử nấm Trường hợp cần xác định lồi nấm phải ni cấy phân lập định danh loài nấm 1.3 Xét nghiệm trực tiếp nấm " hệ thống" Nấm hệ thống thường nấm men hay nấm sợi gây bệnh tổ chức thể người, lấy bệnh phẩm nhuộm gram 1.3.1 Lấy bệnh phẩm : Phương tiện để xét nghiệm trực tiếp nấm hệ thống + Kính hiển vi có vật kính dầu + Dung dịch nhuộm gram gồm có dung dịch sau: - Dung dịch : crystalviolet Crystalvioet 2% Cồn etylíc 20% Oxalátamonium 0,8% - Dung dịch 2: Lugol Iod 1,3% KI 2% Polyvinylpyrrolydon 10% - Dung dịch :Alcol Alcohol etylic 95% 50% Aceton .50% - Dung dịch : Safranine Safranine 0, 25% Alcohol 95 .10 % Dầu bách hương để soi xy len để lau tiêu Thường khoa lấy bệnh phẩm trực tiếp từ bệnh nhân gửi đến phòng xét nghiệm nấm dụng cụ tăm bông, ống nghiệm, phương tiện vô trùng Bệnh phẩm đờm, dịch niêm mạc lưỡi, dịch họng, dịch phế quản, mủ tai, dử mắt, dịch não tuỷ, phân, dịch âm đạo, niệu đạo , máu nơi viêm nhiễm khác tổ chức thể hay da 1.3.2 Làm tiêu : Dùng que bơng que cấy có bệnh phẩm phết lên lam kính hơ vơ trùng đèn cồn ( để khô cố định nhiệt độ phòng) Chú ý : phết thành lớp mỏng phiến kính với đường kính khoảng 0,5 cm 1.3.3 Sau tiêu bệnh phẩm cố định xong nhiệt độ phòng hơ đèn cồn cố định nhiệt cồn metilic ta tiến hành nhuộm theo phương pháp nhuộm gram nhuộm vi khuẩn: nhỏ giọt dung dịch số để phút, rửa nước, cho 1-2 giọt dung dịch số để phút tráng nước, sau nhỏ vài giọt dung dịch 3, tráng tiêu nước sạch, nhỏ 1-2 giọt dung dịch số để yên phút Sau tráng tiêu cho hết màu đỏ, để khô tiêu soi tìm nấm 1.3.4 Kiểm tra soi tiêu bệnh phẩm đánh giá kết Tiêu nhuộm xong để khơ soi vật kính dầu, quan sát vi trường thấy mấn men thường bắt mầu tím ( gram dương ) có hình dạng hình cầu, hình van, có thấy dạng mọc chồi với màu tím đậm Nếu sợi nấm thường đoạn sợi mềm mại, cong queo, có thấy bào tử nấm Chú ý : cần phân biệt với tế bào khác có bệnh phẩm Trường hợp nghi ngờ phải chờ kết ni cấy Trong xét nghiệm nấm hệ thống người ta lưu ý đến kết ni cấy theo kinh nghiệm cho kết cao phương pháp soi trực tiếp Trong thực tế người ta thường kết hợp phương pháp Phương pháp nuôi cấy nấm da gây bệnh Phương pháp soi trực tiếp nấm từ bệnh phẩm cho ta biết bệnh phẩm có nấm hay khơng có nấm, muốn biết nấm thuốc lồi giống ta cần phải ni cấy số mơi trường thích hợp để nấm phát triển thành khuẩn lạc nấm, dựa vào đặc điểm đại thể vi thể để xác định loài Một số trường hợp phải dựa vào tính chất sinh hố học loại định lồi nấm theo khố phân loại Thường người ta lấy bệnh phẩm nghi nhiễm nấm vào số môi trường môi trường matala, môi trường sabouraud, môi trường czapex Dox, môi trường huyết tương 2.1 Nuôi cấy nấm da Người ta thường cấy vào mơi trường sabouraud có thành phần pépton 10 gam, glucoza 40 gam, chlorocit 100 mili gam, actidon 500 mg, thạch 20 gam, nước cất vừa đủ 1000 ml Trong môi trường có chlorocit nhằm mục đích ức chế số vi khuẩn, actidion ( cyclohexamit) kháng sinh có khả ức chế số tạp nấm thường có mặt khơng khí hay lây nhiễm vào bệnh phẩm Với môi trường ứng dụng để ni cấy định lồi nấm ngồi da Bệnh phẩm vẩy da lấy từ bệnh nhân cấy vào môi trường đạt tủ ấm 28o C khoảng 10- 14 ngày, nấm có bệnh phẩm phát triển hình thành khuẩn lạc màu sắc khuẩn lạc,thể chát khuẩn lạc tiếp tục làm tiêu quan sát vi thể kính hiển vi để xác định giống lồi nấm Một số trường hợp phải ni cấy tiếp mơi trường lựa chọn để xem tính chất, đặc điểm sinh hoá học dựa vào khoá phân loại để định loài nấm Trong việc định loài nấm gây bệnh da người ta thường dựa vào đặc điểm hình dạng quan sinh sản vơ tính hữu tính nấm 2.2 Ni cấy số loài dạng nấm men Trong việc xác định số loài nấm men loài candida, người ta thường cấy bệnh phẩm vào môi trường sabouraud, môi trường malata, mơi trường huyết tương có thêm kháng sinh, để nhiệt độ 28o C, thường sau vài ngày nấm phát triển thành khuẩn lạc, khuẩn lạc dạng nấm men thường giống khuẩn lạc vi khuẩn dạng kem, dựa vào tính chất khuẩn lạc, vài đặc điểm vi thể với tính chất sinh hố học tứng loại đồng hố, lên men đường khác mà người ta định loại Trong loại nấm men candida gây bệnh người ta thường thấy loài candida albicans chiếm ưu nhiều so với loài candida khác Gần sử dụng môi trường huyết tương đơn giản để nuôi cấy xác định nấm men candida nhanh chóng tiết kiệm mơi trường hố chất Thành phần môi trường huyết tương Huyết tương lấy từ máu người 100 ml bổ xung vào 100 mg clorocit đóng vào ống nghiệm vơ trùng , ống 0,5 ml, kiểm tra vô trùng vi khuẩn nấm Sau cấy bệnh phẩm trực tiếp vào môi trường đặt môi trường nhiệt độ 37o C sau 24 kiểm tra soi trực tiếp kính hiển vi có nấm candida xuất tế bào hình trứng, hính cầu thường có chồi nhỏ dạng hình số tám, đầu nhỏ ( hình lật đật), lồi candida albicans có xuất dạng chồi ống giống " mầm giá" Chẩn đoán nấm gây bệnh phương pháp huyết Nguyên lý : vi khuẩn, vi rút chẩn đốn số lồi nấm gây bệnh hệ thống người ta ứng dụng phương pháp chẩn đoán huyết Đặc biệt loài nấm gây bệnh hệ thống thể người hình thành kháng thể mà thơng qua huyết phát nấm, lồi nấm cấu trúc kháng nguyên khác nên tạo kháng thể đặc hiệu riêng biệt loài nấm candida albicans, aspergillus, histoplasma capsulatum, blastomyces dermatitidiss, nấm ngồi da ứng dụng phương pháp chưa phổ biến tính đặc hiệu kháng nguyên kém, mặt khác phụ thuộc vào khả đường thâm nhập mầm bệnh Trong chẩn đoán huyết nấm gây bệnh thường sử dụng phương pháp khuyếch tán thạch ( diffussion) phương pháp điện di miễn dịch ( Immunoelectrophoressis), phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA) Chẩn đoán nấm gây bệnh phương pháp gây bệnh động vật Đây phương pháp dùng chẩn đoán nấm gây bệnh Nguyên tắc phương pháp dùng động vật khoẻ mạnh làm thực nghiệm chuột lang, chuột nhắt trắng, thỏ Những trường hợp bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh nấm cần chẩn đoán xác định, người ta lấy bệnh phẩm từ nơi nghi ngờ nhiễm thể bệnh nhân, nghiền dụng cụ vơ trùng với nước muối sinh lý %o vơ trùng có chứa kháng sinh tạo thành hỗn dịch Sau tiêm hỗn dịch vào quan động vật : tinh hoàn, tĩnh mạch, ổ bụng, da v.v theo dõi động vật thời gian, sau mổ động vật quan sát quan tổ chức để kết luận làm tiêu xét nghiệm nấm ( giaỉ phẫu bệnh lý, soi trực tiếp , cấy nấm v.v ) Trường hợp bệnh phẩm vẩy da người ta cạo nhổ lơng động vật, dùng giấy ráp mịn cọ nhẹ đám da, sau áp bệnh phẩm vẩy da vào băng lại theo dõi hàng ngày Nếu bệnh phẩm có nấm da gây bệnh ngồi da động vật thực nghiệm.da PGS Nguyễn Ngọc Thụy ... mầm giá" Chẩn đoán nấm gây bệnh phương pháp huyết Nguyên lý : vi khuẩn, vi rút chẩn đốn số lồi nấm gây bệnh hệ thống người ta ứng dụng phương pháp chẩn đoán huyết Đặc biệt loài nấm gây bệnh hệ... diffussion) phương pháp điện di miễn dịch ( Immunoelectrophoressis), phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA) Chẩn đoán nấm gây bệnh phương pháp gây bệnh động vật Đây phương pháp dùng chẩn đoán. .. kinh nghiệm cho kết cao phương pháp soi trực tiếp Trong thực tế người ta thường kết hợp phương pháp Phương pháp nuôi cấy nấm da gây bệnh Phương pháp soi trực tiếp nấm từ bệnh phẩm cho ta biết bệnh