1 CHIẾN LƯỢC NGHIÊN CỨU KHÁNG THỂ KHÁNG NHÂN GÓP PHẦN CHẨN ĐOÁN BỆNH TỰ MIỄN HỆ THỐNG Bệnh tự miễn hệ thống là các bệnh nguy hiểm, ảnh hưởng đến khả năng làm việc, sức khoẻ cũng như đe doạ cuộc sống của người bệnh. Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, người ta đã phát hiện được hơn 60 bệnh tự miễn và hơn 100 loại tự kháng thể. Các tự kháng thể này là những chỉ điểm sinh học giúp ích cho việc chẩn đoán bệnh tự miễn đặc hiệu cơ quan hoặc không đặc hiệu cơ quan. Tuy vậy, trong nhiều năm qua, bệnh tự miễn hệ thống ở nước ta chưa được nghiên cứu một cách có hệ thống do chưa xây dựng được hệ thống chẩn đoán huyết thanh học bằng các kỹ thuật miễn dịch như miễn dịch huỳnh quang, ELISA, miễn dịch chấm thấm,…dựa vào sự hiện diện của tự kháng thể có trong huyết thanh người bệnh. Việc ứng dụng những thành tựu về kỹ thuật miễn dịch học nhất là các kỹ thuật phát hiện kháng thể kháng nhân, kháng các cấu trúc tế bào nhằm chẩn đoán sớm và theo dõi điều trị các bệnh tự miễn trong bối cảnh bệnh đang có chiều hướng ngày càng gia tăng ở nước ta là rất quang trọng. Thuật ngữ kháng thể kháng nhân (AAN: Anticorps anti-nucleaires) là những globulin miễn dịch đặc hiệu đối với các cấu trúc khác nhau của nhân tế bào : axit nhân, histon, ribonucleoprotein,…. AAN có tỉ lệ dương tính cao ở mot số bệnh lí tự miễn hệ 2 thống, bệnh lupus ban đỏ hệ thống, xơ cứng bì, bệnh tổ chức liên kết phối hợp, hội chứng Sjogren. Tuy nhiên, một lượng nhỏ AAN cũng có thể gặp trong những bệnh nhiễm trùng, viêm, bệnh lí tân sinh (u), một số người khoẻ mạnh (người già) và cả việc dùng liều lượng một số thuốc. Như vậy, nghiên cứu AAN bằng huyết thanh học dựa vào các kỹ thuật miễn dịch được thực hiện như sau: 1. Thăm dò: Thông thường, xét nghiệm nền tản tìm kiếm sự hiện diện của AAN là miễn dịch huỳnh quang gián tiếp trên tế bào HEp-2. Tế bào HEp-2 là tế bào được ly trích từ các tế bào ung thư thanh quàn của người. Nhân tế bào rất lớn và hình thái dễ quan sát. Do được nuôi cấy nên tế bào HEp-2 xuất hiện trên tiêu bản ở nhiều giai đoạn phát triển khác nhau giúp xác định dễ dàng các kháng thể mà trên mảnh cắt tổ chức không cho phép. Tế bào HEp-2 được sử dụng như một cơ chất nen trong phương pháp này để phát hiện các loại kháng thể kháng nhân, kháng hạt nhân, kháng các thành phần của bào tương. Miễn dịch huỳnh quang gián tiểptên tế bào HEp-2 cung cấp 2 thông tin: đầu tiên, nó chỉ ra nồng độ. Nong độ quan sát được rất quan trọng bởi nó sẽ quyết định ở nồng độ nào được cho là dương tính hay còn gọi là ngưỡng dương tính. Ngưỡng dương tính cho phép xác định sự hiện diện AAN có tương quan với bệnh lí. Ngưỡng dương tính được ghi nhận hiện nay là 1/320. Nồng độ dưới 1/320 không có ý nghĩa lâm sàng. Trong các bệnh mô liên kết, nồng độ AAN rất cao có thể đạt 1/20.000 và cao hơn nữa. 3 Thông tin quan trọng thứ hai là dạng phát huỳnh quang và vị trí xuất hiện huỳnh quang trong tế bào. Thông tin này giúp định hướng một cách trực tiếp tình trang bệnh học và lựa chọn kỹ thuật bổ sung để chẩn đoán xác định các tự kháng thể. +Hình ảnh : Một số dạng phát huỳnh quang trên tế bào HEp-2. 2. Xác định: Sự xác định các tự kháng thể có thể thực hiện bằng các kỹ thuật khác nhau, như miễn dịch kết tủa khuếch tán kép trên thạch, ELISA, miễn dịch huỳnh quang gián tiếp, miễn dịch phóng xạ, miễn dịch chấm thấm. 2 loại AAN cần xác định rõ, các kháng hạt nhân, kháng DNA và các kháng thể kháng kháng nguyên nhân hoà tan gọi là kháng ENA (Extractable Nuclear Antigens). a. Các KT kháng hạt nhân là các KT phản ứng với phức hợp DNA-histon, đơn vị cơ bản của chất nhiễm sắc. Các KT này được biết từ 1948 vì chúng phụ trách sự tạo thành các tế bào LE miêu tả bởi Hargraves. Hiện nay chúng được phát hiện bằng ELISA hoặc miễn dịch chấm thấm. Gần 90% bệnh nhân LED cấp có KT kháng hạt nhân đặc biệt ở giai đoạn khởi phát bệnh. Các KT kháng hạt nhân gần như đặc hiệu 4 của LED nếu chúng được tìm kiếm bằng phương pháp đặc hiệu. Tìm KT kháng hạt nhân là xét nghiệm chính khi thực hiện chẩn đoán LED và KT xuất hiện sớm. Sự tìm kháng DNA là cần thiết, nhất là để theo dõi tiến triển của bệnh. Thật vậy, các kháng hạt nhân thường chỉ hiện diện ở giai đoạn đầu của bệnh và có xu hướng mất đi, chỉ để tồn tại lại các kháng DNA. b. Tìm kháng DNA là cần thiết, nhất là theo dõi tiến triển của bệnh. Nó có thể được thực hiện bằng các kỹ thuật khác nhau mà các kỹ thuật này không có cùng độ nhạy cảm và độ đặc hiệu. - Xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang gián tiếp trên Crithidia Luciliae: là kỹ thuật rất đặc hiệu trong chẩn đoán bệnh LED nhưng ít nhạy cảm bởi vì nó chỉ dương tính trong ½ bệnh LED và đặc biệt là trong giai đoạn hoạt động của bệnh. Hình ảnh: C.L trên miễn dịch huỳnh quang: - Xét nghiệm Farr cho biết số lượng tự KT và có độ nhạy cao hơn. Tuy nhiên nó cũng chỉ cho biết các kháng DNA cao quá mức. - ELISA là kỹ thuật nhạy cảm nhất, nhưng kém đặc hiệu nhất trong 3 kỹ thuật trên. Nó có sự biến thiên lớn giữa các kít thương mại. Bởi vậy ELISA được dùng để theo dõi bệnh. Các KT kháng histon không có lợi ích trong nghiên cứu LED do thuốc, như trước đây đã gợi ý, bởi vì nó cũng hiện diện trong bệnh LED thật sự. 5 c. Các KT kháng ENA được phát hiện bằng các kỹ thuật khác nhau. Kỹ thuật ELISA và miễn dịch chấm thấm là những kỹ thuật sử dụng nhiều nhất. Mới đây, xuất hiện phương pháp fluorimetriques en flux cho phép phát hiện nhiều KT đồng thời. Tất cả những kỹ thuật này cho phép thăm dò nhiều tự KT chỉ ở 1 phản ứng và cho biết một cách rõ nét các KT kháng RNP, kháng Sm, kháng SSA/R o, kháng SSB/ La, kháng Scl70, kháng PMScl và kháng Jo1, kháng PL7 và kháng PL12… là các KT đặc hiệu của bệnh mơ liên kết. d. Các KT rất hiếm gặp như PCNA, Mi2, PL7, PL12 chỉ có thể được tìm kiếm hiện nay bằng miễn dịch khuếch tán trên thạch (phương pháp Ouchterlony) hoặc Western-Blot. Đa số các kit của trung tâm thương mại là có thể sử dụng được, độ nhạy và độ đặc hiệu của các kit phụ thuộc vào tính tự nhiên và chất lượng của KN. Tóm lại: Chiến lược tìm kháng thể kháng nhân có thể thực hiện theo quy trình như sau: SƠ ĐỒ: MDHQGT trên tế bào Hep - 2 Âm tính Dương tính Nồng độ thấp  320 < 320 Phát quang trong bào tương Phát quang trong nhân Huỳnh quang đồng chất Huỳnh quang dạng hạt Dừng việc tìm kiếm bệnh mô liên kết 6 Tài liệu tham khảo: 1. Rene Louis Humbel (2003), “Stratégie d ’ etude des anticorps anti-nucleaires”, tạp chí Bio Tribune, số 7, pp. 17-18. 2. Geores Chyderiotis, Bach-Nga Phạm (2006), ‘’ Autoanticorps utiles au diagnostic et au suivi des maladies auto-immunes systemiques ’’ , tạp chí của nhóm EASI. Hoàng Thị Thúy Hương . AAN cần xác định rõ, các kháng hạt nhân, kháng DNA và các kháng thể kháng kháng nguyên nhân hoà tan gọi là kháng ENA (Extractable Nuclear Antigens). a. Các KT kháng hạt nhân là các KT phản ứng. phản ứng và cho biết một cách rõ nét các KT kháng RNP, kháng Sm, kháng SSA/R o, kháng SSB/ La, kháng Scl70, kháng PMScl và kháng Jo1, kháng PL7 và kháng PL12… là các KT đặc hiệu của bệnh mơ. 1 CHIẾN LƯỢC NGHIÊN CỨU KHÁNG THỂ KHÁNG NHÂN GÓP PHẦN CHẨN ĐOÁN BỆNH TỰ MIỄN HỆ THỐNG Bệnh tự miễn hệ thống là