Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT *** LUẬN VĂN CAO HỌC Mã số chuyên ngành: 60420103 Đề tài: Nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh kháng tụ cầu vàng Staphylococcus aureus phân lập t t r Học viên: Lê Xuân Dân Lớp: CHST _ K15 Hướng dẫn: PGS.TS Ngô Đình Bính Hà Nội, 2013 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii Mục lục Mục lục i Danh mục các từ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình ix Mở đầu 1 Phần1. Tổng quan tài liệu 3 1.1. Xạ khuẩn. 3 1.1.1. Xạ khuẩn và sự phân bố trong tự nhiên. 3 1.1.2. Cấu tạo của xạ khuẩn. 3 1.1.3. Đặc điểm hình thái, quá trình sinh trưởng và phát triển của xạ khuẩn. 5 1.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa. 6 1.1.5. Sự hình thành bào tử. 6 1.2. Phân loại xạ khuẩn. 8 1.2.1. Lịch sử phân loại xạ khuẩn. 8 1.2.2. Theo đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy. 10 1.2.3. Theo đặc điểm hóa học. 11 1.2.4. Theo đặc điểm sinh lý, sinh hóa. 12 1.2.5. Theo phân loại số. 12 1.2.6. Theo sự phát sinh chủng loại. 13 1.2.7. Phân loại theo Chương trình xạ khuẩn quốc tế (ISP) 14 1.3. Một số sản phẩm trao đổi chất quan trọng của xạ khuẩn. 14 1.3.1. Kháng sinh và cơ chế hình thành chất kháng sinh của vi sinh vật 14 1.3.2. Phân lập xạ khuẩn sinh chất kháng sinh từ tự nhiên. 15 1.3.3. Các nhóm chất kháng sinh chính có nguồn gốc từ xạ khuẩn. 16 1.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn. 18 1.4. Tổng quan về vi khuẩn Staphylococcus aureus 19 1.4.1. Đặc điểm phân loại 19 1.4.2. Đặc điểm sinh vật học 20 1.4.2.1. Hình thái và tính chất nuôi cấy 20 1.4.2.2. Đặc tính và yếu tố độc lực 21 1.4.2.3. Khả năng đề kháng 23 1.4.2.4. Sự kháng kháng sinh 23 1.4.2.5. Khả năng gây bệnh 23 Phần 2 : Vật liệu và phương pháp 24 2.1. Vật liệu 24 2.1.1. Nguyên liệu 24 2.1.2. Môi trường .( g/l ) 24 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii 2.2. Phương pháp nghiên cứu. 27 2.2.1. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn. 27 2.2.1.1. Phân lập xạ khuẩn. 27 2.2.1.2. Phân lập vi khuẩn Staphilococcus aureus : 27 2.2.1.2. Các phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh 28 2.2.1.3. Tuyển chọn xạ khuẩn 28 2.2.1.4. Bảo quản chủng giống 29 2.2.2. Phân loại xạ khuẩn. 29 2.2.2.1. Đặc điểm hình thái 29 2.2.2.2. Đặc điểm nuôi cấy 29 2.2.2.3. Phương pháp xác định trình tự đoạn gene 16S rRNA 31 2.2.3. Nghiên cứu động thái của quá trình lên men 33 2.2.4. Tách chiết chất kháng sinh 33 2.2.4.1. Tách chiết chất kháng sinh từ sinh khối 33 2.2.4.2. Tách chiết chất kháng sinh từ dịch lọc 33 2.2.5. Xác định một số tính chất hoá lý và phân loại kháng sinh 33 2.2.5.1. Xác định độ bền nhiệt của dịch kháng sinh thô 33 2.2.5.2 Xác định pH khuyếch tán của kháng sinh thô 33 2.2.5.3. Phương pháp xác định giá trị Rf 34 Phần 3. Kết quả và thảo luận 36 3.1. Phân lập và tuyển chọn 36 3.1.1. Phân lập xạ khuẩn từ đất rừng ngập mặn 36 3.1.2. Phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus 37 3.1.2. Sàng lọc hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn phân lập. 40 3.2. Phân loại xạ khuẩn bằng phương pháp truyền thống 45 3.2.1. Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn TB10.2 45 3.2.2. Đặc điểm sinh lý sinh hoá 46 3.2.2.1. Khả năng chịu muôí. 46 3.2.2.2. Khả năng đồng hóa nguån đường 46 3.2.3. Mô tả đặc điểm phân loại 47 3.3. Phân loại bằng phương pháp sinh học phân tử 49 3.4. Nghiên cứu động thái lên men của chủng TB10.2 52 3.5. Nghiên cứu một số tính chất của dịch kháng sinh thô 54 3.5.1. Tách chiết chất kháng sinh 54 3.5.2. Độ bền nhiệt của dịch kháng sinh thô 54 3.5.3. Ảnh hưởng của pH đến độ khuyếch tán của dịch kháng sinh thô 55 3.5.4. Đặc điểm sắc kí của dịch kháng sinh thô của chủng xạ khuẩn chủng S. padanus TB10.2 trong một số hệ dung môi 56 Kết luận 58 Tài liệu tham khảo 59 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv Lời cảm ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Ngô Đình Bính là người thầy đã hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận án này. Tôi xin trân trọng cảm ơn phòng tập thể phòng Di truyền Vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học và bản luận án này. Tôi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam đã chia sẻ, động viên, giúp tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành tốt công việc nghiên cứu của mình. Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn, những người luôn bên tôi, động viên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Tác giả Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các đồng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực. Hà Nội, ngày tháng năm 2013 Tác giả Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi Danh mục các từ viết tắt KTKS Khuẩn ty khí sinh KTCC Khuẩn ty cơ chất RF Cuống bào tử thẳng hay lượn sóng (Rectus-Flexibilis) RA Cuống bào tử xoắn đơn hình móc câu (Retinaculum aperturm) DNA Deoxyribonucleic acide RNA Ribonucleic acide CSBT Cuống sinh bào tử BMBT Bề mặt bào tử PCR Polymerase chain reaction Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vii Danh mục bảng Bảng 3.1. Phân loại xạ khuẩn TB theo màu sắc KTKS 36 Bảng 3.2. Phân loại xạ khuẩn NĐ theo màu sắc KTKS 36 Bảng 3.3.Kết quả phân lập vi khuẩn S. aureus tại các phòng mổ và phòng thủ thuật. 37 Bảng 3.4. Phân loại xạ khuẩn phân lập ở Thái Bình theo nhóm màu và hoạt tính kháng sinh. 40 Bảng 3.5. Hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn phân lập tại Tỉnh Thái Bình kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus 41 Bảng 3.6. Hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn phân lập tại Thái Bình trong môi trường dịch thể kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus 41 Bảng 3.7. Phân loại xạ khuẩn phân lập tại rừng ngập mặn Tỉnh Nam Định theo nhóm màu và hoạt tính kháng sinh. 42 Bảng 3.8. Hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus 43 Bảng 3.9. Hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn trong môi trường dịch thể kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus 44 Bảng 3.10. Đặc điểm hình thái của chủng TB10.2 45 Bảng 3.11. một số đặc điểm hình thái của chủng xạ khuẩn TB110.2 45 Bảng 3.12. Khả năng đồng hóa các nguồn đường 46 Bảng 3.13. So sánh đặc điểm hình thái của chủng TB10.2 với chủng S. padanus 48 Bảng 3.14. so sánh trình tự 16S rRNA của chủng TB10.2 trên ngân hàng gen quốc tế 51 Bảng 3.15. Hoạt tính kháng sinh của chủng xạ khuẩn S. padanus TB10.2 trên các môi trường nghiên cứu 53 Bảng 3.16. Sự biến đổi pH, hoạt tính kháng sinh, sinh khối của chủng S. padanus TB10.2 trên môi trường Gauze-1 53 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ viii Bảng 3.17. Hoạt tính của dịch kháng sinh thô của chủng S. Padanus TB10.2 sau khi xử lý nhiệt với vi sinh vật kiểm định S. aureus (mm) 55 Bảng 3.18. Ảnh hưởng của pH tới sự khuyếch tán của chất kháng sinh . Error! Bookmark not defined. Bảng 3.19. Giá trị Rf của dịch kháng sinh thô trên một số hệ dung môi 57 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ix Danh mục hình Hình 1.1 Hình thể Staphylococcus aureus 20 Hình 1.2 Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus 22 Hình 2.1. Đĩa thạch Gradient pH 34 Hình 2.2. Băng sắc kí trên giấy 35 Hình 3.1. phân lập vi khuẩn S.aureus tại bệnh viện ĐK tỉnh Bắc Ninh 37 Hình 3.2a. kháng sinh đồ chủng vi khuẩn S.aureus của bệnh viện đa khoa tỉnh Bắc Ninh 38 Hình 3.2b. Kháng sinh đồ chủng vi khuẩn S.aureus do phòng Di truyềnVi sinh vật – Viện Công nghệ Sinh học cung cấp 39 Hình 3.3. hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn phân lập tại Tỉnh Thái Bình diệt vi khuẩn S. aureus 41 Hình 3.4. Hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn đất ngập mặn tỉnh Thái Bình 42 Hình 3.5. hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn phân lập tại Nam Định diệt vi khuẩn S. aureus 43 Hình 3.6. Hoạt tính kháng sinh của dịch nuôi cấy các chủng xạ khuẩn tuyển chọn tại đất rừng ngập mặn tỉnh Nam Định 44 Hình 3.7. Hình dạng và bề mặt bào tử chủng TB10.2 45 Hình 3.8. Khả năng đồng hoá các nguồn đường của chủng TB10.2. 47 Hình 3.9. Màu của KTKS (A) và màu của KTCC (B) của chủng TB10.2 trên môi trường Gause 1 sau 7 ngày nuôi. 48 Hình 3.10. Điện di DNA của chủng TB10.2 sau khi tách từ kit QIAamp DNA Mini Kit 50 Hình 3.11. Điện di sản phẩm PCR gen 16S rRNA của chủng TB10.2 50 Hình 3.12. Cây phát sinh chủng loại của chủng TB10.2 52 Hình 3.13. Động thái của quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces padanus TB10.2 trên môi trường Gauze-1. 54 1 Mở đầu Tụ cầu vàng là vi khuẩn thường xuất hiện ở các bệnh viện, chúng gây ra các mối đe dọa lớn cho bệnh nhân cũng như bệnh viện nếu không có công tác kiểm soát nhiễm khuẩn thực sự tốt. Chúng gây nhiễm trùng vết mổ làm ảnh hưởng đến tính mạng bệnh nhân. Bên cạnh đó, khả năng kháng kháng sinh của tụ cầu vàng rất lớn vì vậy cần nghiên cứu các sinh học diệt khuẩn có nguồn gốc từ các vi sinh vật đối kháng đã và đang được các nhà khoa học hướng đến và xạ khuẩn sinh kháng sinh là trung tâm trong vấn đề nghiên cứu này. Xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật nhân sơ (prokaryote) với số lượng loài lớn và phân bố ở nhiều vùng sinh thái khác nhau. Chúng ngày càng được biết đến rộng rãi với nhiều ứng dụng thực tế thông qua việc tạo ra các sản phẩm thứ cấp có giá trị cao như chất kháng sinh, chất chống ung thư, các chất kích thích sinh trưởng và nhiều hợp chất y dược khác. Ngoài ra, xạ khuẩn còn có khả năng sinh ra các enzyme ngoại bào nên được sử dụng rộng rãi làm các chế phẩm sinh học trong nông nghiệp và công nghệ xử lý rác thải. Thái Bình và Nam Định là hai tỉnh có diện tích đất rừng ngập mặn lớn của Bắc bộ. Việc nghiên cứu đa dạng sinh học vi sinh vật của đất rừng ngập mặn chưa được công bố nhiều, đặc biệt là các sản phẩm trao đổi chất của chúng. Vì vậy, để góp phần tìm hiểu về đa dạng sinh học xạ khuẩn ở đất rừng ngập mặn và hoạt tính chất kháng sinh của chúng đối với vi khuẩn tụ cầu vàng, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh kháng tụ cầu vàng Staphylococcus aureus phân lập t t r . */ Mục tiêu của đề tài: - Khảo sát sự phân bố, đặc điểm hình thái của xạ khuẩn trong các mẫu đất thu thập tại một số khu vực đất rừng ngập mặn thuộc 2 tỉnh Thái Bình và Nam Định. [...]... nng sinh trng, phỏt trin ca cỏc vi sinh vt khỏc Nú liờn quan cht ch vi u tranh sinh tn, l 14 nhõn t giỳp xỏc nh kh nng bin d v liờn quan n loi ca vi sinh vt Mt trong nhng th hin ca tớnh i khỏng l kh nng sinh cht khỏng sinh ca vi sinh vt cú th tn ti, sinh trng v phỏt trin c thun li hn, mt loi vi sinh vt no ú s a ra sn phm trao i cht ca mỡnh nhm to ra iu kin khụng thun li cho s phỏt trin ca cỏc loi sinh. .. khụng phi mi vi sinh vt u cú th sinh ra cht khỏng sinh v cỏc cht khỏng sinh u d b phõn hy, ng thi b mt kh nng i khỏng.Waksman l nh khoa hc i din cho gi thuyt ny [3] 1.3.2 Phõn lp x khun sinh cht khỏng sinh t t nhiờn phõn lp c cỏc chng x khun sinh cht khỏng sinh t t nhiờn, ta cn tuõn theo mt qui trỡnh tuyn chn nht nh v cú h thng Cỏc bc cn thit phõn lp v tuyn chn chng x khun sinh cht khỏng sinh : 15 1)... kh nng sinh trng tt 28ữ30oC Nhit ti u cho sinh tng hp cht khỏng sinh nm trong khong 18ữ28oC - pH mụi trng: nh hng ca pH mụi trng n sinh tng hp cht khỏng sinh l rt ln, pH thớch hp thng l trung tớnh Di pH cho phộp i vi chng sinh trng ln hn pH ti u cho hot tớnh sinh tng hp cht khỏng sinh Chng hn, i vi chng S aureofaciens, pH t 4,2ữ8,0 (ti u l 6,6ữ6,8) cho sinh trng v 5,5ữ6,5 (ti u l 5,8ữ6,0) cho sinh. .. khớ sinh (sau khi sinh bo t) - Hỡnh thỏi cung sinh bo t , - S hỡnh thnh melanin, - S hỡnh thnh sc t hũa tan, - Mu khun ty c cht, - S dng cỏc ngun hydrat cacbon Bn tiờu chun u c gi l nhúm th nht, cũn s to thnh sc t hũa tan v ng húa cỏc loi ng l nhúm th cp 1.3 Mt s sn phm trao i cht quan trng ca x khun 1.3.1 Khỏng sinh v c ch hỡnh thnh cht khỏng sinh ca vi sinh vt Trong t nhiờn (mụi trng sng), s sinh. .. dit cỏc vi sinh vt kim nh ca cỏc chng thun khit 3) Chn ly cỏc chng cú hot tớnh khỏng khun nghiờn cu tip: lờn men, tỏch chit v th hot tớnh khỏng khun ca cht khỏng sinh 4) Th c tớnh v hot ph khỏng khun ca cht khỏng sinh 5) Nu cht khỏng sinh l loi cn tỡm thỡ lờn men vi lng ln, tinh ch v thu hi chỳng 6) Xỏc nh tớnh cht húa lý v sinh hc Lm li cỏc thớ nghim nu cht khỏng sinh t yờu cu Cỏc cht khỏng sinh nht... thuc nhúm Gram(+) sinh ra Cht khỏng sinh tiờu biu l Aztreonom cú kh nng c ch vi khun Gram(-) - Xephalosporin: nhõn cu trỳc l axit 7- aminoxephalosporanic, do cỏc loi thuc chi Acremonium sinh ra 16 - Cacbapenem (thienamixin): loi cht khỏng sinh cú hot ph khỏng khun rng do Streptomyces cattleyx sinh ra Nú cú kh nng chng li c vi khun Gram(+) v Gram(-) 2 Nhúm polypeptit Cỏc cht khỏng sinh thuc nhúm ny... chung l cht khỏng sinh Cht khỏng sinh cú nhiu nh ngha khỏc nhau Theo Semiakin v Khokhlov, cht khỏng sinh l tt c cỏc sn phm trao i cht ca c th sng cú tỏc dng c ch v tiờu dit cỏc vi sinh vt khỏc (vi khun, virut, protozoa, t bo ung th,) mt cỏch chn lc, ngay c nng thp Nhiu nh khoa hc ó a ra cỏc gi thuyt v s hỡnh thnh cỏc cht khỏng sinh t vi sinh vt Cú 2 gi thuyt v s to thnh cht khỏng sinh Theo gi thuyt... tng hp khỏng sinh - Mụi trng nhõn ging: Quỏ trỡnh sinh tng hp cht khỏng sinh khụng nhng ph thuc vo cỏc iu kin lờn men m nú cũn ph thuc vo cht lng ca bo t, ging sinh dng Mụi trng nhõn ging thng kộm dinh dng hn mụi trng lờn men Tuy nhiờn, cng cú trng hp mụi trng nhõn ging giu dinh dng hn thỡ kh nng hỡnh thnh cht khỏng sinh cao hn Vớ d, chng S anreofaciens LSB-2201 cú kh nng sinh cht khỏng sinh nhiu nht... protein Tuy nhiờn, lng photphat vụ c cú trong cao ngụ s lm gim kh nng sinh tng hp khỏng sinh ca x khun - Ngun photphat vụ c: Nu nng photphat ban u cao, nú s lm tng lng axit nucleic trong khun ty Do ú, pha sinh trng ca khun ty s b kộo di, pha tng hp khỏng sinh rỳt ngn li, lm tng ATP trong t bo, dn n quỏ trỡnh sinh tng hp cht khỏng sinh s gim hoc ngng li Nu photphat d tha, nú cng s gõy c ch tng hp cỏc... Streptomyces, kh nng sinh cht khỏng sinh ca chỳng cú mi quan h n s hỡnh thnh bo t Nhiu trng hp, khi b kớch thớch hỡnh thnh bo t, hiu sut sinh cht khỏng sinh b gim i Khi nghiờn cu t bin v chn chng x khun sn xut oxytetraxiclin, streptomixin, ngi ta thy nu s 7 hỡnh thnh bo t kộm thỡ kh nng to cht khỏng sinh li tng lờn c im ny ca x khun l rt quan trng khi nghiờn cu chn lc chng x khun sn xut cht khỏng sinh [6] 1.2 . mẫu đất từ các vùng đất ngập mặn thuộc tỉnh Thái Bình và Nam Định. - Phân lập và thuần khiết xạ khuẩn từ các mẫu đất, - Kiểm tra hoạt tính kháng sinh của các chủng đã phân lập được với vi sinh. hoạt tính chất kháng sinh của chúng đối với vi khuẩn tụ cầu vàng, chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh kháng tụ cầu vàng Staphylococcus aureus phân lập t t r . */ Mục. chủng xạ khuẩn phân lập tại Thái Bình trong môi trường dịch thể kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus 41 Bảng 3.7. Phân loại xạ khuẩn phân lập tại rừng ngập mặn Tỉnh Nam Định theo nhóm màu và