Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT  LÊ HOÀNG ĐỨC NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KHÁNG THỂ ĐƠN CHUỖI CHẾ TẠO KIT PHÁT HIỆN NHANH VIRUS CÚM A/H5N1 CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM MÃ SỐ: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội, Tháng 11-2013 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT  LÊ HOÀNG ĐỨC NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KHÁNG THỂ ĐƠN CHUỖI CHẾ TẠO KIT PHÁT HIỆN NHANH VIRUS CÚM A/H5N1 CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM MÃ SỐ: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS. TS. CHU HOÀNG HÀ Hà Nội, Tháng 11-2013 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Chu Hoàng Hà – Trưởng phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Phó viện trưởng Viện Công nghệ sinh học đã định hướng nghiên cứu, đồng thời tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành luận văn này. Tôi xin được cảm ơn TS. Lê Văn Sơn, Phó trưởng phòng Công nghệ ADN ứng dụng và TS. Phạm Bích Ngọc, Phó trưởng phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới sự giúp đỡ của ThS. Hoàng Hà cùng tập thể cán bộ phòng Công nghệ Tế bào thực vật và phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học đã dành cho tôi trong suốt quá trình làm luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn Phòng Đào tạo, Ban lãnh đạo Viện Sinh thái & Tài nguyên sinh vật, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, các thầy cô giáo đang công tác tại Viện Công nghệ sinh học và Viện Sinh thái & Tài nguyên sinh vật đã tạo điều kiện và tận tình giảng dạy cho tôi trong suốt khóa học. Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và gửi lời cảm ơn chân thành tới những người thân trong gia đình và bạn bè – những người luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Hà Nội, ngày tháng năm 2013 Lê Hoàng Đức Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Lê Hoàng Đức Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Tổng quan về virus cúm A 3 1.1.1. Giới thiệu về bệnh cúm 3 1.1.2. Cấu trúc chung của virus cúm A 3 1.1.3. Cấu trúc hệ gen của virus cúm A 4 1.1.4. Lịch sử bệnh cúm A 6 1.1.5. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 trên thế giới và tại Việt Nam 7 1.1.6. Các phương pháp chẩn đoán virus cúm A/H5N1 10 1.2. Kháng thể đơn chuỗi và kỹ thuật phage display 11 1.2.1. Kháng thể 11 1.2.2. Kháng thể đơn chuỗi 12 1.2.3. Một số nghiên cứu ứng dụng của kháng thể đơn chuỗi 13 1.2.4. Kỹ thuật phage display 14 1.2.4.1. Giới thiệu chung về kỹ thuật phage display 14 1.2.4.2. Filamentous phage M13 14 1.2.4.3. Tạo thư viện phage display 16 1.3. Kỹ thuật ngƣng kết ứng dụng trong chẩn đoán 18 1.3.1. Hạt latex 19 1.3.2. Một số nghiên cứu ứng dụng hạt latex trong chẩn đoán 20 CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1. Vật liệu 21 2.2. Hóa chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu 23 2.2.1. Hóa chất 23 2.2.2. Thiết bị máy móc 27 2.2.3. Địa điểm nghiên cứu 27 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 27 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2.3.1. Phương pháp biến nạp vào vi khuẩn E. coli chủng HB 2151 bằng sốc nhiệt 27 2.3.2. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony PCR) 28 2.3.5. Phương pháp tinh sạch kháng thể đơn chuỗi sử dụng sắc ký ái lực 30 2.3.6. Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 31 2.3.5. Phương pháp lai Western blot 32 2.3.6. Phương pháp đo nồng độ protein bằng máy đo quang phổ 33 2.3.7. Phương pháp chế tạo bộ kit phát hiện nhanh virus cúm A/H5N1 dựa trên tính ngưng kết của hạt latex đã gắn protein lên bề mặt 34 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1. Biểu hiện và tinh sạch kháng thể đơn chuỗi VH10 38 3.1.1. Tạo chủng E. coli HB2151 biểu hiện kháng thể VH10 tái tổ hợp 38 3.1.2. Tối ưu các điều kiện biểu hiện kháng thể đơn chuỗi VH10 43 3.1.3. Tinh sạch kháng thể đơn chuỗi VH10 46 3.2. Thử nghiệm tạo kit phát hiện nhanh cúm A/H5N1 theo nguyên lý ngƣng kết miễn dịch 47 3.2.1. Chuẩn hóa lượng kháng thể gắn lên bề mặt hạt latex 47 3.2.2. Xây dựng phương pháp chẩn đoán virus cúm A/H5N1 bằng phán ứng ngưng kết hạt latex 49 3.3. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và thử nghiệm bộ kit latex 52 3.3.1. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ kit latex 52 3.3.2. Đánh sự hoạt động của bộ kit latex với các mẫu thực địa 55 CHƢƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 KẾT LUẬN 57 KIẾN NGHỊ 58 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT bp : base pair cDNA : Complementary DNA DNA : Deoxirybonucleotide acid E. coli : Escherichia coli EDAC : 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) carbodiimide EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid IPTG : Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Kb : Kilo base kDa : Kilo Dalton LB : Luria-Bertani OD : Optical Density PBS : Phosphate buffered saline PCR : Polymerase Chain Reaction PVDF : Polyvinylidene difluoride RNA : Ribonucleotide acid scFv : Single-chain variable fragment SDS : Sodium Dodecyl Sulfate SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis TAE : Tris-acetate-EDTA TBS : Tris Buffered Saline TEMED : N,N,N´,N´-tetramethylethylenediamine WHO : World Health Organization Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. (A) Các dạng hình thái của virus cúm A được nhuộm âm tính trên kính hiển vi điện từ truyền qua. (B) Cấu trúc vủa virus cúm A 4 Hình 1.2. Các vật chủ tự nhiên và khả năng lây nhiễm giữa các loài vật chủ của virus cúm A 6 Hình 1.3. Sơ đồ các chuỗi của một kháng thể 11 Hình 1.4. Các protein cấu thành virion của M13 15 Hình 1.5. Chu kỳ sống của phage M13 trong E. coli 15 Hình 2.1. Sơ đồ vector pTI2+/VH10 21 Hình 2.2. Quy trình gắn protein lên bề mặt hạt latex 33 Hình 3.1. Kết quả biến nạp vào tế bào E.coli HB 2151 38 Hình 3.2. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR dùng mồi đặc hiệu (pTI-NcoI-F và pTI- NotI-R) từ dòng khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc. 38 Hình 3.3. Hình ảnh điện di protein tổng số của tế bào E. coli HB2151 mang gen mã hóa cho các cấu trúc kháng thể đơn chuỗi VH10 40 Hình 3.4. Kết quả lai Western blot kiểm tra protein tổng số của tế bào E. coli HB2151 mang vector pTI2+/VH10 với kháng thể anti polyhistidin. 41 Hình 3.5. Hình ảnh điện di protein VH10 được biểu hiện ở các nhiệt độ khác nhau. 42 Hình 3.6. Hình ảnh điện di protein VH10 được cảm ứng biểu hiện ở các nồng độ IPTG khác nhau 43 Hình 3.7. Hình ảnh điện di protein VH10 được cảm ứng biểu hiện ở các thời gian khác nhau 44 Hình 3.8. Hình ảnh điện di kiểm tra tính tan của protein VH10 45 Hình 3.9. Hình ảnh điện di protein VH10 sau khi tinh sạch bằng cột sắc ký ái lực His-tag. 45 Hình 3.10. Phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên H5 với hạt latex được gắn với 100, 200 và 400 g kháng thể đơn chuỗi VH10. 46 Hình 3.11. Mô hình kiểm tra tính ngưng kết của hạt latex đã gắn protein lên bề mặt 48 Hình 3.12. Kết quả phản ứng ngưng kết soi dưới kính hiển vi có độ phóng đại 10×10. 49 Hình 3.13. Hình ảnh bộ kit latex chẩn đoán virus cúm gia cầm H5N1 50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Thống kê số lượng người bị nhiễm và chết do cúm A/H5N1 từ năm 2003-2013 8 Bảng 2.1. Danh sách các mẫu bệnh phẩm sử dụng trong nghiên cứu 22 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng colony PCR 23 Bảng 2.3. Công thức pha gel cô và gel tách 25 Bảng 2.4. Công thức tính độ nhạy và độ đặc hiệu 33 Bảng 3.1. Kết quả thử nghiệm bộ kit latex với các mẫu nước trứng 50 Bảng 3.2. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ kit latex 52 Bảng 3.3. Kết quả đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp ngưng kết hồng cầu 52 Bảng 3.4. Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu với kháng nguyên H5 của bộ kit latex 53 Bảng 3.5. Kết quả thử nghiệm bộ kit latex phát hiện virus cúm A/H5N1 với các mẫu thực địa 54 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẶT VẤN ĐỀ Cúm gia cầm (Avian influenza) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính ở mọi loài chim, kể cả gia cầm và thủy cầm, do các phân type (subtype) của nhóm virus cúm A (Influenza virus A) thuộc họ Orthomyxoviridae gây nên. Virus cúm A được chia thành các phân nhóm dựa trên hai glycoprotein bề mặt là hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). HA được chia thành 16 phân nhóm (từ H1 đến H16) và NA được chia thành 9 phân nhóm (từ N1 đến N9). Trong số 16 phân nhóm của virus cúm A, các chủng trong phân nhóm H5 và H7 có thể gây ra thể cúm gia cầm độc lực cao, có khả năng lây lan mạnh, tử vong nhanh ở những loài lông vũ cảm nhiễm. Hầu hết các virus cúm gia cầm có ảnh hưởng đến người thường gây ra các triệu chứng đường hô hấp nhẹ hoặc viêm kết mạc mắt, trừ một ngoại lệ là chủng H5N1. Virus cúm A/H5N1 là thể độc lực cao (HPAI, highly pathogenic avian influenza) gây bệnh nặng với tỷ lệ tử vong cao ở người trong các vụ dịch diễn ra vào năm 1997 và năm 2003. Theo số liệu của Tổ chức y tế thế giới (WHO), từ năm 2003 đến tháng 6 năm 2013 đã có 375 người tử vong do cúm gia cầm trong số 630 ca nhiễm H5N1 tại 15 nước. Tại Việt Nam, dịch cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 bắt đầu xuất hiện từ những tháng cuối năm 2003, đã có 62 ca tử vong trong số 125 người nhiễm cúm gia cầm. Đồng thời, bệnh cúm gia cầm cũng là nguyên nhân làm hàng chục triệu con gia cầm bị chết hoặc bị tiêu huỷ gây thiệt hại kinh tế nặng nề cho ngành chăn nuôi. Hệ gen của virus cúm A/H5N1 có cấu trúc đặc trưng của hệ gen virus cúm A là RNA sợi đơn âm (ss(-)RNA) có độ dài tổng số khoảng 13.500 ribonucleotide, bao gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt mã hóa cho 11 protein khác nhau của virus. Trong đó, tên gọi của virus H5N1 dựa trên 2 protein quyết định tính kháng nguyên là hemagglutinin nhóm 5 (H5) và neuraminidase nhóm 1 (N1). [...]... A1 547 Homo A1 249 Allantoic fluid 5 A1 548 Homo A1 440 Allantoic fluid 6 A1 549 Homo A1 932 Allantoic fluid 7 A1 586 Homo A1 416 Allantoic fluid 8 A1 567 Homo A1 928 Allantoic fluid 9 A1 562 Swab A1 974 Allantoic fluid 10 A1 563 Swab A1 938 Allantoic fluid 11 A1 564 Swab A1 833 Allantoic fluid 12 A1 565 Swab A1 832 Allantoic fluid 13 A1 566 Swab A1 747 Allantoic fluid 14 N156 Swab A1 813 Allantoic fluid 15 N157 Swab A1 814... đơn chuỗi chế tạo kit phát hiện nhanh virus cúm A/ H5N1 Mục tiêu nghiên cứu: - Biểu hiện và tinh sạch được kháng thể đơn chuỗi VH10 tái tổ hợp đặc hiệu với kháng nguyên bề mặt H5 c a virus cúm A/ H5N1 trong E coli - Thử nghiệm chế tạo kit phát hiện nhanh virus cúm A/ H5N1 theo nguyên lý ngưng kết miễn dịch Nội dung nghiên cứu: - Nghiên cứu tối ưu các điều kiện biểu hiện kháng thể đơn chuỗi VH10 tái tổ... nghiên cứu chế tạo bộ kit phát hiện nhanh virus cúm A/ H5N1 d a trên nguồn kháng thể đơn chuỗi ở trong nước CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu - Cấu trúc vector pTI2+ ch a đoạn gen mã h a cho kháng thể đơn chuỗi VH10 từ vùng biến đổi c a chuỗi nặng Kháng thể VH10 đã được sàng lọc trong thư viện bằng kỹ thuật phage display, có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên HA c a virus. .. ở ph a đầu amin và ba vùng cố định nằm ở ph a đầu cacboxyl ký hiệu là CH1, CH2, CH3 Hai vùng biến đổi c a chuỗi nặng và chuỗi nhẹ nằm kề nhau tạo thành vị trí kết hợp kháng nguyên hay paratop do vậy đảm bảo tính a dạng c a phân tử kháng thể [16] 1.2.2 Kháng thể đơn chuỗi Kháng thể đơn chuỗi hay mảnh kháng thể là sự kết hợp c a những vùng khác nhau c a chuỗi nặng (VH) và chuỗi nhẹ (VL) thông qua một... tinh sạch kháng thể đơn chuỗi VH10 - Nghiên cứu chế tạo bộ kit phát hiện virus cúm A/ H5N1 theo nguyên lý ngưng kết miễn dịch - Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu c a bộ kit phát hiện nhanh virus cúm A/ H5N1 và thử nghiệm bộ kit với các mẫu thực đ a Số h a bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về virus cúm A 1.1.1 Giới thiệu về bệnh cúm Bệnh cúm là bệnh... nhanh các trường hợp nghi nhiễm cúm A/ H5N1 ở Việt Nam gặp rất nhiều khó khăn về mặt kỹ thuật Hiện nay, d a trên sự tồn tại c a kháng nguyên bề mặt H5, người ta có thể xác định nhanh và chính xác sự có mặt c a virus H5N1 bằng cách sử dụng kháng thể đơn chuỗi đặc hiệu với protein kháng nguyên này Từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: Nghiên cứu ứng dụng kháng thể đơn chuỗi chế tạo. .. do virus cúm gây ra Virus cúm thuộc họ Orthomyxoviridae bao gồm 4 nhóm: virus cúm A (Influenza A virus) , virus cúm B (Influenza B virus) , virus cúm C (Influenza C virus) và Thogotovirus Trong đó: Nhóm virus cúm A (Influenza A virus) thường gây nhiễm cho các loài vật như cá voi, hải cẩu, gia súc, gia cầm và các loài chim di cư hoang dã, sau đó tiếp xúc với con người và gây bệnh cho người [38] Nhóm virus. .. các chuỗi c a một kháng thể [71] Chú thích: Fab: Vùng bám kháng nguyên; Fc: Vùng cố định; Fv: Vùng biến đổi; scFv: Kháng thể đơn chuỗi kết hợp từ vùng biến đổi c a chuỗi nặng và chuỗi nhẹ Chuỗi nhẹ có trọng luợng phân tử 25 kDa, ch a khoảng 211 – 221 axit amin Có hai loại chuỗi nhẹ là kappa (Қ) và lambda (λ) Mỗi phân tử Ig chỉ ch a hoặc hai chuỗi nhẹ Қ hoặc hai chuỗi nhẹ λ mà không bao giờ ch a cả hai... Số h a bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Phương pháp chẩn đoán virus H5N1 d a trên nguyên tắc ngưng kết miễn dịch đòi hỏi nguồn kháng thể đơn dòng Phát hiện sự có mặt c a virus H5N1 theo phương pháp này d a trên phản ứng ELISA Hiện nay, các kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho kháng nguyên H5 và kháng nguyên M1 đã được chế tạo thành công và được ứng dụng trong chẩn đoán virus cúm A/ H5N1. .. DNA nối - Đoạn DNA mã h a cho kháng thể đơn chuỗi sẽ được cài vào trong một vector phagemid và phagemid tái tổ hợp này sẽ được biến nạp vào tế bào vi khuẩn E coli thông qua phương pháp biến nạp bằng sốc nhiệt hay xung điện [44], [45] 1.2.3 Một số nghiên cứu ứng dụng c a kháng thể đơn chuỗi Hiện nay, kháng thể đơn chuỗi scFv đã được ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực Năm 1999, Harper và cộng sự đã nghiên . hành thực hiện đề tài: Nghiên cứu ứng dụng kháng thể đơn chuỗi chế tạo kit phát hiện nhanh virus cúm A/ H5N1 . Mục tiêu nghiên cứu: - Biểu hiện và tinh sạch được kháng thể đơn chuỗi VH10. với kháng nguyên bề mặt H5 c a virus cúm A/ H5N1 trong E. coli. - Thử nghiệm chế tạo kit phát hiện nhanh virus cúm A/ H5N1 theo nguyên lý ngưng kết miễn dịch. Nội dung nghiên cứu: - Nghiên cứu. tối ưu các điều kiện biểu hiện kháng thể đơn chuỗi VH10 tái tổ hợp ở E. coli và tinh sạch kháng thể đơn chuỗi VH10. - Nghiên cứu chế tạo bộ kit phát hiện virus cúm A/ H5N1 theo nguyên lý ngưng