Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm Trang 9 Bài 2: ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP MICRO - KJELDAHL 1. Mục đích Phương pháp Micro - Kjeldahl thường được dùng để xác định tổng lượng nitơ trong nguyên liệu 2. Nguyên tắc Dưới tác dụng của H 2 SO 4 đậm đặc ở nhiệt độ cao, các hợp chất chứa hữu cơ bị phân hủy và bị oxy hóa đến CO 2 và H 2 O còn nitơ chuyển thành NH 3 và tiếp tục kết hợp với H 2 SO 4 tạo thành muối amoni sulfat. 3. Nguyên liệu, thiết bị, dụng cụ, hóa chất * Nguyên liệu  Mẫu bột đậu phộng đã sấy khô đến mất ẩm hoàn toàn * Thiết bị  Hệ thống cất đạm  Bếp điện  Tủ hút * Dụng cụ  Bình Kjeldahl  Pipette 10ml  Becher  Erlen  Muỗng inox  Dĩ a nhựa  Bình định mức 250ml  Phễu thủy tinh  Burette 25ml  Giá burette  Kẹp burette  Bình xịt nước cất  Ống bóp cao su * Hóa chất  H 2 SO 4 đđ  NaOH 45%  Hỗn hợp CuSO 4 : K 2 SO 4 theo tỉ lệ 1:3  H 2 SO 4 0,1N  Chỉ thị methyl red (hay phenolphtalein) Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm Trang 10 4. Tiến hành * Vô cơ hóa mẫu - Cân chính xác khoảng 3g mẫu rắn đã tách ẩm hoàn toàn (sấy 100 – 105 0 C đến khối lượng không đổi). - Gói mẫu bằng giấy lọc không tro. - Chuyển mẫu vào bình vô cơ hóa (bình Kjeldahl). - Thêm vào bình vô cơ hóa 10ml H 2 SO 4 đậm đặc và 0,2g hỗn hợp CuSO 4 : K 2 SO 4 theo tỉ lệ 1:3. - Đặt bình vô cơ hóa lên bếp đun và đun đến khi dung dịch trong suốt và có màu xanh ngọc (không cặn) thì dừng quá trình vô cơ mẫu. Để nguội. - Tiến hành định mức lên 250ml * Lắp hệ thống cất đạm theo sơ đồ A: Bình đun tạo hơi nước B: Bình thu dịch thải C: Bình cất (chứa dung dịch vô cơ đã pha loãng và NaOH đậm đặc) D: Phễu dẫn chất thử và NaOH vào bình cất C E: Hệ thống sinh hàn F: Bình thu NH 3 P, P 1 , P 2 : Các khóa dẫn * Chuẩn bị vận hành hệ thống cất đạm - Cho nước vào bình đun (1/2 – 2/3V) thể tích của hệ thống sinh hàn (mở van nước). - Đóng các khóa của hệ thống. - Sử dụng đèn cồn để đun nóng bình đun. - Khi nước ngưng tụ ở đầu ra của hệ thống sinh hàn thì tiến hành quy trình rửa. Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm Trang 11 - Cho nước cất vào phễu, nạp mẫu và mở khóa để nước vào bình cất. - Tắt đèn cồn, nước ở bình cất sẽ chuyển vào bình xả, mở khóa bình xả để xả nước ra ngoài. - Lặp lại quy trình rửa ít nhất hai lần. * Cất đạm - Chuẩn bị bình thu NH 3 chứa 10ml dung dịch H 2 SO 4 0,1N, 2 giọt chỉ thị methyl red (hay phenolphtalein) và nhúng ngập đầu ra của ống sinh hàn. - Mở đèn cồn để đun nóng bình đun. - Mẫu đã vô cơ hóa và pha loãng được cho vào phễu nạp mẫu (khoảng 10ml). - Mở khóa phễu nạp mẫu từ từ để đưa mẫu vào bình cất. - Rửa phễu nạp mẫu 3 lần bằng nước cất vô đạm. - Cho 10ml NaOH 45% vào phễu nạp m ẫu, mở khóa từ từ lưu ý không xả hết. - Rửa phễu nạp mẫu 3 lần (cho từ từ vào không xả hết). - Thực hiện quá trình cất trong 10 phút. * Chuẩn độ, tính kết quả Hạ bình thu NH 3 khỏi đầu ra ống sinh hàn và thực hiện trong 5 phút. Lấy bình thu NH 3 ra và tiến hành chuẩn độ. Hàm lượng đạm tổng X (%) được tính theo công thức: (%) . 100 (0014,0 )1,01,0 mv VfvV m mNthNaOHNtrNaOH  f : hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH V NaOH 0,1 tr (trắng) : thể tích NaOH 0,1N để chuẩn độ mẫu trắng (ml) v NaOH 0,1N th (thật) : thể tích NaOH 0,1N để chuẩn độ mẫu thật (ml) v m : thể tích mẫu đưa vào cất (10 ml) V m : thể tích mẫu định mức (250 ml) m : khối lượng mẫu đưa vào vô cơ hóa (g) * Xác định hệ số hiệu chỉnh nồng độ f Lấy 10ml H 2 SO 4 0,1N vào erlen, thêm 2 giọt chỉ thị phenolphtalein đem chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt thì ngưng. Tính nồng độ thực tế của NaOH, sử dụng hệ thức hiệu chỉnh nồng độ: C 1 .V 1 = C 2 .V 2 f: là tỉ số giữa nồng độ thực tế và nồng độ theo lý thuyết của NaOH Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm Trang 12 Bài 3: ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN THEO PHƯƠNG PHÁP LOWRY 1. Nguyên tắc Hầu hết các protein đều chứa Tyrosin và Tryptophan. Hàm lượng của những acid amin này tùy thuộc vào loại protein. Vì vậy, những protein cùng một loại với nhau có hàm lượng các acid amin này giống nhau. Khi cho protein tác dụng với thuốc thử Folin sẽ tạo thành một phức chất có màu. Cường độ màu của phức này tỉ lệ với hàm lượng Tyrosin và Tryptophan (cũng là hàm lượng protein). Vì thế, ta có thể dùng phương pháp so màu để xác định hàm lượng protein. 2. Dụng cụ và hóa chất * D ụng cụ  Buret 25ml  Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml chính xác  Bình định mức 50ml  Erlen 250ml * Hóa chất  Dung dịch albumin 0,1% : cân chính xác 0,1g albumin pha với nước cất thành 100ml.  Dung dịch A: cân 2g Na 2 CO 3 hòa tan trong NaOH N/10 thành 100ml  Dung dịch B: cân 0,5g CuSO 4 .5H 2 O hòa tan trong dung dịch citrat natri 1% tạo thành 100ml.  Dung dịch C: (chỉ pha để dùng trong ngày) là hỗn hợp của hai dung dịch A và B được pha theo tỷ lệ 49:1  Thuốc thử Folin : thuốc thử này đã pha sẵn, cách đều chế như sau: o Cân: 100g Natri tungstat và 25g Natri molybdate thật tinh khiết. Thêm vào đó 700ml nước cất và 50ml acid orto phosphoric 85%. Khuấy cho hòa tan và thêm vào đó 100ml acid clohydric đậm đặc. Tiếp tục khuấy rồi cho vào đó một bình cấu nút nhám 2 lít. Đun hoàn lưu trong 10 giờ. o Sau khi đun cho vào đó 150g Lithium sulfat. Khuấy cho đến khi tan hoàn toàn rồi đổ vào đó thêm 5 – 10ml brom 1/3 (hoặc 2 – 3ml Brom lỏng). Khuấy đều và đun sôi trong tủ hút khí độc trong 15 phút. Làm lạnh ở nhiệt độ thường. Cho vào bình định mức 1 lít và thêm nước cất cho đủ. Lắc kỹ và lọc (nếu dung dịch không trong). Dung dịch có màu vàng chanh, nếu chuyển sang màu xanh là không dùng được. Bảo quản trong chai thủy tinh màu. 3. Thực hành * Dựng đường chuẩn Ta thực hiện đường chuẩn với một loại protein tinh khiế t có sẵn, thường là albumin của bò đã đông khô theo bảng sau để có được các dung dịch albumin chuẩn có nồng độ protein từ 0 đến 250  /ml: Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm Trang 13 Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5 Nồng độ protein µg/ml 0 50 100 150 200 250 Dung dịch albumin 0,1%(ml) 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 Nước cất (ml) 10 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 Hút 0,4ml dung dịch protein có nồng độ khác nhau từ các ống nghiệm vừa pha ở trên theo thứ tự từ 0 đến 5 vào bảy ống nghiệm sạch khác nhau (gồm hai ống thử không và năm ống từ 1 đến 5). Thêm vào đó 2ml dung dịch C. Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Sau đó thêm vào 0,2ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5 – 10 phút, thêm nước cất cho đủ 5ml. Đem đo mật độ quang ở bước sóng 750nm hay 500nm. Xử lý số liệu thu đượ c theo phương pháp bình phương cực tiểu.Vẽ biểu đồ biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang (  OD) theo nồng độ protein chuẩn (  /ml). * Xác định hàm lượng protein trong mẫu Hút 0,4ml dung dịch protein cần xác định cho vào một ống nghiệm sạch và sấy khô. Thêm vào đó 2ml dung dịch C. Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Sau đó thêm vào 0,2ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5 – 10 phút, thêm nước cất cho đủ 5ml. Đem đo mật độ quang ở bước sóng 750nm hay 500nm. (Nên làm 3 ống nghiệm để lấy trung bình). * Tính toán Từ đường chuẩn so sánh mật độ quang của ống nghiệm chứa mẫ u protein. Từ đó suy ra hàm lượng protein của nguyên liệu là a (  /ml). Lượng protein (M) có trong 1g nguyên liệu được tính theo công thức: m na M .10. 3  mg protein/1g Với a: là hàm lượng protein (  /ml dung dịch) n: là hệ số pha loãng m: khối lượng nguyên liệu lấy phân tích (g) Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm Trang 14 Bài 4: NITROGEN – NITRITE 1. Nguyên tắc - Nitrite được xác định bằng phương pháp so màu, màu do phản ứng từ các dung dịch tham chiếu và mẫu sau khi tác dụng với acid sulfanilic và naphthylamine ở môi trường pH bằng 2 – 2,5 tạo thành hợp chất đỏ tím của acid azobenzol naphthylamine sulfonic. - Phương pháp diazo thích hợp khi hàm lượng N – NO 2 – từ 1 – 25mg/l. Hình 4.1: Cơ chế phản ứng tạo màu 2. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất * Dụng cụ, thiết bị - Bình định mức 10ml - Pipet 1ml, 5ml, 10ml. - Bầu hút an toàn - Spectrophotometer. * Hóa chất - Dung dịch chuẩn: dung dịch lưu trữ NO 2 - 1000ppm: hòa tan 1,5 g NaNO 2 khan trong nước cất và định mức thành 1 lít. - Dung dịch NO 2 - chuẩn 10ppm: lấy 10ml dung dịch chuẩn 1000ppm + nước cất định mức thành 1 lít. Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm Trang 15 - Dung dịch sulfanilic: cân 0,6g acid sulfanilic + 70ml nước nóng để nguội + 20ml HCl đậm đặc, pha loãng thành 100ml với nước cất. - Dung dịch naphthylamine chlohydrate: cân 0,6g naphthylamine chlohydrate + 50ml nước cất + 1ml HCl đậm đặc + nước cất thành 100ml. Pha dùng ngay hoặc giữ ở nhiệt độ thấp. 3. Thực hành - Chuẩn bị mẫu và dung dịch tham chiếu đồng thời STT ống nghiệm 1 2 3 4 5 M 1 M 2 Dd NO 2 chuẩn (10ppm) (ml) 0 1 2 3 4 Mẫu (ml) 8 8 Dung dịch sulfanilic (ml) 0,5 Đợi 10 phút Dung dịch naphthylamine 0,5 Đợi 20 phút H 2 O (ml) 9 8 7 6 5 1 1 C (mg/l) 0 Cx Cx - Thêm vào mẫu các dung dịch theo đúng thứ tự trong bảng. - Đo độ hấp thu A ở bước sóng 520nm. 4. Cách tính - Từ đường chuẩn đo độ hấp thu. - Sử dụng phương pháp bình phương cực tiểu để lập phương trình y = ax + b, vẽ giản đồ A = f(C). Từ trị số độ hấp thu của mẫu A m suy ra nồng độ C m . C m (NO 2 - ) = 8.1000 .1000.10. fC x (ppm) f: độ pha loãng của mẫu trước khi hiện màu 5. Câu hỏi chuẩn bị 1.1. Phân tích một mẫu nước ngầm, kết quả hàm lượng nitrite cao, có thể kết luận gì? 1.2. Nitrogen thường tồn tại ở dạng nào trong nước mặt, nước ngầm? Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm Trang 16 BÀI 5: ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ACID DINITROSALICYLIC (DNS) 1. Nguyên tắc Phương pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử acid dinitrosalicylic.Phản ứng xảy ra trong môi trường kiềm và có gia nhiệt. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết v ới thuốc thử acid dinitrosalicylic sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu. 2. Nguyên liệu, thiết bị, hóa chất * Nguyên liệu  Chuối sứ chín * Thiết bị  Máy quang phổ  Bếp điện hoặc bể điều nhiệt * Dụng cụ  Ống nghiệm  Giá ống nghiệm  Becher 500 ml  Becher 250 ml  Becher 100 ml  Kẹp ống nghiệm  Bình xịt nước cất  Bóp cao su  Cối chày sứ  Dĩa nhựa  Dao  Muỗng Inox  Pipette 5 ml  Pipette 1 ml  Phễu thuỷ tinh  Bình định mức 100 ml  Cuvet nhựa  Giấy lọc  Erlen 250 ml  Erlen 100 ml  Đũa khuấy * Hóa chất  Thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS): Nước cấ t : 1416 ml Acid dinitrosalicylic ( C 7 H 4 N 2 O 7 ) : 10,6 g Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm Trang 17 NaOH : 19,8 g Sau khi hòa tan thêm vào dung dịch gồm: Muối seignette (KNaC 4 H 4 O 6 .4H 2 O) : 306 g Phenol (C 6 H 5 OH) : 7,6 ml Natri metabisulfit (Na 2 S 2 O 5 ) : 8,3 g  Glucose 0,1%  Acetat chì 10 %  Na 2 HPO 4 bão hòa  Acid trichloroacetic 10%,  NaOH 5% ,  Chỉ thị methyl red  Chỉ thị phenolphtalein  Na 2 CO 3 bão hòa.  Cồn 70 – 80 o .  Giấy lọc 3. Tiến hành * Xử lý mẫu Tùy vào đối tượng nghiên cứu mà cách chuẩn bị dung dịch dùng để định lượng đường có khác nhau:  Nguyên liệu không chứa nhiều tinh bột Dùng nước nóng trích ly đường. Cân 1–2g mẫu nếu là nguyên liệu khô (cây, lá hoặc quả khô) hoặc 5 – 10g nếu là nguyên liệu tươi có hàm ẩm cao (rau, quả tươi). Cho vào cối sứ nghiền thật nhỏ (có thể nghiền với bột thủ y tinh hay cát sạch). Trích ly nhiều lần bằng 30ml nước cất nóng 70 – 80 o C. Chuyển lượng dịch vào bình định mức, bỏ phần bã.  Nguyên liệu chứa protein (dứa,…) Trích ly dung dịch (V<50ml), đem kết tủa protein và các tạp chất bằng dung dịch acid trichloroacetic 10% (hoặc Acetat chì 10 %), sau đó trung hòa bằng dung dịch NaOH 5% với chỉ thị methyl red (màu đỏ chuyển sang vàng) hoặc Na 2 HPO 4 bão hòa.  Nguyên liệu chứa nhiều acid hữu cơ (dứa, chanh, khế,…) Trong quá trình trích ly đường, sacarose có thể bị thủy phân một phần do sự có mặt của acid hữu cơ có sẵn trong nguyên liệu, do đó khi xác định đường khử phải trung hòa acid hữu cơ bằng dung dịch NaOH 5% hay Na 2 CO 3 bão hòa. Nghiền nhuyễn nguyên liệu trong cối sứ với một ít nước cất. Nhỏ 3 giọt chỉ thi đỏ methyl red hoặc phenolphtalein và cho từ từ từng giọt NaOH 5% đến khi xuất hiện màu hồng nhạt. Tiếp tục trích ly bằng nước ấm như trên  Nguyên liệu chứa nhiều tinh bột (chuối, khoai lang, ) Trích ly đường bằng 30ml rượu 70 – 80 o . Trong trường hợp này không cần kết tủa protein vì lượng protein chuyển vào dung dịch không đáng kể. Mẫu đã qua xử lý thêm nước cất tới vạch định mức 100ml, lọc qua giấy lọc vào cốc. Nước qua lọc là dung dịch mẫu cần phân tích. Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm Trang 18 * Dựng đồ thị chuẩn Glucose Ống số Ống đối chứng 1 2 3 4 5 Mẫu Dd glucose chuẩn 0,1% (ml) - 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 - Dd mẫu (ml) - - - - - - 1,0 Nước cất (ml) 3,0 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 2,0 Thuốc thử DNS (ml) 1,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 OD 540nm Đun (đun cách thủy) các ống nghiệm đúng 5 phút Làm nguội đến nhiệt độ phòng, đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 540nm * Lưu ý  Phản ứng tạo thành trong môi trường kiềm vì vậy những mẫu có chứa acid phải được trung hòa trước khi đem phân tích.  Phương pháp này đặc hiệu cho tất cả các đường khử.  Các mẫu đã đun có thể để được một thời gian (20 phút) trước khi đo. Các mẫu không đun sẽ bị thủy phân dần dần.  Những dung dịch đường đậm đặc phả i được pha loãng sao cho màu dung dịch mằm lọt trong khoảng dãy màu ống 1 đến 5 4. Xử lý kết quả  Xây dựng đường chuẩn glucose y = f(x) với trục tung (y) là mật độ quang, trục hoành (x) là hàm lượng glucose (mg) bằng phương pháp bình phương cực tiểu.  Dựa vào đường chuẩn, tính nồng độ X (mg/ml) glucose trong dung dịch mẫu 5. Tính toán Hàm lượng glucose trong nguyên liệu được tính theo công thức: 100 1000. XV G m  f mẫu (%) Với: m : lượng mẫu đem thí nghiệm (g) V : thể tích định mức dung dịch thí nghiệm (100ml) X : nồng độ đường khử trong dung dịch mẫu tính theo glucose (mg/ml) f mẫu : hệ số pha loãng mẫu (nếu có) . protein (  /ml dung dịch) n: là hệ số pha loãng m: khối lượng nguyên liệu lấy phân tích (g) Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm Trang 14 Bài 4: NITROGEN – NITRITE 1. Nguyên tắc -. Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm Trang 9 Bài 2: ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP MICRO - KJELDAHL 1. Mục đích Phương pháp Micro - Kjeldahl thường. bị 1.1. Phân tích một mẫu nước ngầm, kết quả hàm lượng nitrite cao, có thể kết luận gì? 1.2. Nitrogen thường tồn tại ở dạng nào trong nước mặt, nước ngầm? Tài liệu thực hành Phân tích thực