Tóm tắt luận án tiến sĩ sinh học phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương việt nam

22 570 0
Tóm tắt luận án tiến sĩ sinh học phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương việt nam

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

B GIÁO D C VÀ ÀO T O I H C THÁI NGUYÊN NGUY N TH THÚY HƯ NG PHÂN L P, T O LIÊN QUAN T BI N I M GEN P5CS N TÍNH CH U H N VÀ TH NGHI M CHUY N VÀO CÂY U TƯƠNG VI T NAM Chuyên ngành: Di truy n h c Mã s : 62.42.70.01 TÓM T T LU N ÁN TI N S SINH H C THÁI NGUYÊN - 2011 CÁC CƠNG TRÌNH C A TÁC GI Ã CƠNG B LIÊN QUAN N LU N ÁN Nguy n Th Thuý Hư ng, Chu Hoàng M u, Hà T n Th , inh Th Kim Phương, Tr n Th Trư ng (2006), “Sưu t p, phân lo i ánh giá ch t lư ng h t c a m t s gi ng u tương a phương t i t nh Sơn La”, T p chí Nơng nghi p phát tri n Nông thôn, s 11 kỳ I tháng 6/2006 28-32 Chu Hoàng M u, Nguy n Th Thuý Hư ng (2006), “Thành ph n axit amin kh ch u h n c a m t s gi ng u tương a phương c a t nh Sơn La”, T p chí Nơng nghi p phát tri n Nơng thơn, s 20 kì II tháng 10/2006 2226 Nguy n Th Thúy Hư ng, Chu Hoàng M u, Lê Văn Sơn, Nguy n H u Cư ng, Lê Tr n Bình, Chu Hồng Hà (2008), " ánh giá kh ch u h n phân l p gen P5CS c a m t s gi ng u tương (Glycine max L.Merrili)", T p chí công ngh sinh h c, 6(4): 459-466 Nguy n Th Thúy Hư ng, Tr n Th Ng c Di p, Nguy n Thu Hi n, Chu Hoàng M u, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2009), "Phát tri n h th ng tái sinh invitro u tương (Glycine max L.Merrili) ph c v chuy n gen", T p chí khoa h c cơng ngh i h c Thái Nguyên 52 (4): 82-88 Nguy n Th Thúy Hư ng, Chu Hoàng M u, Lê Văn Sơn, Nguy n H u Cư ng, Lê Tr n Bình, Chu Hồng Hà (2009), "T o gen mã hóa Enzym P5CS (Pyroline - - carboxylate synthase) mang t bi n lo i b hi u ng c ch ph n h i b ng k thu t PCR" H i ngh cơng ngh sinh h c tồn qu c năm 2009: 191 - 193 Nguy n Th Thuý Hư ng, Chu Hoàng M u, Lê Văn Sơn, Nguy n H u Cư ng, Chu Hoàng Hà (2010), "Tách dòng ánh giá ho t ng c a promoter c m ng khô h n rd29A t Arabidopsis thaliana", T p chí Cơng ngh sinh h c 8(4): 1805-1810 Nguy n Th Thuý Hư ng, Chu Hoàng M u, Lê Văn Sơn, Nguy n H u Cư ng, Chu Hoàng Hà (2010), "T o thu c chuy n gen P5CS t bi n lo i b hi u ng ph n h i ngư c, làm tăng hàm lư ng protein kh ch ng ch u khơ h n H i ngh tồn qu c v khoa h c s s ng Bio-Hà N i 2010", T p chí cơng ngh sinh h c, (3A): 539-544 Chu Hoang Mau, Nguyen thi Thuy Huong, Nguyen Tuan Anh, Chu Hoang Lan, Le van Son, Chu Hoang Ha ( 2010) Characteristic of the gene encoding pyrroline - - carboxylate synthase (P5CS) in Vietnamese sobean cultivar (Glycine max L.Merrill) 2010 International Conference on Biology, Environment and Chemistry (ICBEC 2010) IEEE: 319-323 M U tv n Cây u tương (Glycine max (L.) Merrill) m t nh ng tr ng quan tr ng khơng ch Vi t Nam mà cịn i v i nhi u qu c gia th gi i Tình tr ng h n hán nh hư ng t i tình hình s n xu t u tương khơng ch Vi t Nam mà c nh ng nư c s n xu t u tương hàng u th gi i u tương tr ng thu c nhóm có kh ch u h n Vi t Nam, nhi u gi ng u tương có kh ch ng ch u h n ã c ch n t o thành công ang c tri n khai canh tác m t s a phương Tuy nhiên phương pháp ch n gi ng truy n th ng t n nhi u th i gian, ph c t p c n ph i có qu n th l n không n nh Nh ng c i m c a phương pháp truy n th ng có th kh c ph c b ng vi c áp d ng k thu t m i c a công ngh sinh h c K thu t chuy n gen th c v t thông qua vi khu n Agrobacterium tumefaciens ã c nhà khoa h c th gi i ng d ng t c nh ng k t qu r t có tri n v ng u tương Vi t Nam, nhóm nghiên c u c a Tr n Th Cúc Hòa t i Vi n Nghiên c u lúa ng b ng Sông C u Long ã thành công vi c t o gi ng u tương m i mang tính kháng sâu b nh, nhiên cho n cơng trình nghiên c u v chuy n gen ch u h n vào u tương v n chưa c quan tâm úng m c Xu t phát t nh ng lý ti n hành tài lu n án ti n sĩ là: “Phân l p, t o t bi n i m gen P5CS liên quan n tính ch u h n th nghi m chuy n vào Vi t Nam” u tương M c tiêu nghiên c u 2.1 So sánh trình t gen mã hóa P5CS c a gi ng a phương thu c nhóm ch u h n t t ch u h n T o c t bi n lo i b hi u ng c ch ph n h i b i prolin 2.2 T o c vector chuy n gen mang c u trúc liên quan n tính ch u h n u tương 2.3 T o u tương mang c u trúc gen liên quan n c tính ch u h n 3 N i dung nghiên c u 3.1 Phân tích c i m sinh lý, hóa sinh c a m t s gi ng u tương tr ng t i khu v c mi n B c 3.2 Phân l p xác nh trình t gen mã hóa enzyme 1-pyrroline-5 carboxylate synthetase (P5CS) 3.3 T o t bi n lo i b hi u ng c ch ph n h i (feedback inhibition) b i prolin b ng phương pháp t o t bi n i m 3.4 Phân l p promoter c m ng dư i i u ki n khô h n rd29A t Arabidopsis thaliana Phân tích ho t ng c a promoter d a vào ho t ng c a gen GUS dòng thu c chuy n gen 3.5 Thi t k c u trúc mang gen P5CS t bi n c promoter rd29A chuy n c u trúc vào thu c i u n b i 3.6 Phân tích ch tiêu hóa sinh kh ch ng ch u c a dòng thu c i u ki n gây h n nhân t o 3.7 Bi n n p c u trúc mang gen P5CS vào u tương thông qua vi khu n Agrobacterium tumefaciens Phân tích s có m t c a gen bi n n p Nh ng óng góp m i c a lu n án 4.1 Gen P5CS c phân l p c trình t t hai gi ng u tương Vi t Nam (DT84 SL5), có kích thư c 2148 nucleotit, mã hóa 715 axit amin 4.2 ã t o t bi n i m nh hư ng b ba có v trí th 125 c a gen P5CS c a gi ng SL5, thay th Asp b ng Ala trình t protein, lo i b hi u ng c ch ph n h i (feedback inhibition) 4.3 Promoter rd29A ã c phân l p thành cơng t A.thaliana, có kích thư c 1298bp mang trình t c trưng g m nhân t cis thu c nhóm MYB, DRE, AMYBOX nhân t c trưng c a promoter nhân t c m ng i u ki n khô h n 4.4 Thi t k thành công c u trúc c a promtor rd29A :: GUS c u trúc rd29A::P5CSM Các c u trúc ã c ánh giá thu c i u ki n h n 4.5 T i ưu c quy trình tái sinh chuy n gen thông qua mô nách m m u tương Bư c u chuy n thành công c u trúc gen rd29A::P5CSM vào gi ng u tương DT84 thu dương tính PCR i v i gen chuy n c m t s dòng Ý nghĩa khoa h c th c ti n 5.1 V khoa h c, lu n án cơng trình Vi t Nam ã ánh giá c kh ch ng ch u h n c a gi ng u tương i u ki n gây h n nhân t o, phân l p thay i c u trúc gen P5CS d a vào phương pháp gây t bi n có nh hư ng b ng ph n ng PCR Các k t qu phân tích gen P5CS kh ng nh r ng s khác v kh ch u h n c a gi ng u tương khác nhi u y u t quy nh, nhiên ho t ng c a gen P5CS gi vai trò quan tr ng i v i tính ch u h n tr ng 5.2 V th c ti n, nh ng k t qu ánh giá ho t ng c a c u trúc chuy n gen mang promoter rd29A i u n ho t ng c a gen P5CS ã b gây t bi n lo i b hi u ng ph n h i b i prolin thu c ã kh ng nh ý nghĩa th c ti n c a lu n văn Kh ch ng ch u c c i thi n rõ r t dòng thu c chuy n gen mang c u trúc m b o tính kh thi c a vi c ng d ng c y trúc chuy n gen i tư ng tr ng khác nh m c i thi n m t nh ng tính tr ng r t quan tr ng ch ng ch u h n K t qu ban u vi c thi t l p quy trình chuy n gen u tương s ti n quan tr ng ti n trình t o gi ng u tương m i có tính ch u h n cao C u trúc c a lu n án Lu n án g m 113 trang, c chia thành ph n: Ph n M u g m có trang; Chương 1: T ng quan tài li u, 34 trang; Chương 2: V t li u Phương pháp, 15 trang; Chương 3: K t qu Th o lu n, 46 trang; Phân K t lu n ngh : trang; Các cơng trình ã cơng b c a tác gi : trang Tài li u tham kh o: 11 trang; Lu n án có 29 b ng s li u, 43 hình 108 tài li u tham kh o b ng ti ng Vi t ti ng Anh Chương T NG QUAN TÀI LI U Lu n án ã tham kh o t ng k t 64 tài li u, ó có 10 tài li u ti ng vi t, 51 tài li u ti ng Anh a ch trang web v v n liên quan, : (1) Gi i thi u v b n u tương (Glycine max (L.) Merill), giá tr kinh t giá tr s d ng c a sinh c a c tính ch ng ch u h n c a u tương; (2) Cơ s sinh lý, hóa u tương; (3) Prolin vai trò c a enzym P5CS ng sinh t ng h p prolin; (4) Promoter vai trò i u n ho t ng c a gen i u ki n h n; (5) Nh ng nghiên c u nâng cao kh ch u h n c a u tương Prolin c bi t n m t nh ng ch t óng vai trị quan tr ng q trình i u ch nh áp su t th m th u th th c v t s ng i u ki n b t l i h n, m n (Delauney and Verma, 1993) Tác d ng b o v c u trúc n i bào i phân t t bào g p i u ki n b t l i v áp su t th m th u; b o v c u trúc protein nâng cao ho t tính c a nhi u lo i enzyme khác nhau; ch ng oxy hóa v i ch c phân c t g c oxy ph n ng (reactive oxygen residues) b t ho t g c oxy t (singlet oxygen quencher) (Szavados tg, 2009) th c v t, trình sinh t ng h p prolin c ki m soát b i ho t tính c a hai gen mã hóa cho enzym P5CS Hai gen có tương ng r t cao v trình t mã hóa bi u hi n l i r t khác nh ng i u ki n khác C hai gen P5CS u ho t ng mô phân sinh c a hoa, ch y u cung c p prolin cho trình phát tri n c a hoa (Mattioli tg, 2009) Nghiên c u Arabidopsis nhà khoa h c ã ch ng minh c m i quan h ch t ch gi a ho t ng c a enzme P5CS s tích lũy prolin i u ki n b x lý m n; hi u ng c ch ngư c c a prolin t i ho t tính c a P5CS b nh hư ng i u ki n b t l i Khi chuy n gen P5CS ã b gây t bi n lo i b hi u ng c ch ngư c b i prolin vào thu c nhà khoa h c ã nh n r ng dòng thu c chuy n gen tăng cư ng tích lũy prolin nhi u g p l n so v i dòng thu c c chuy n gen P5CS ki u d i G n ây, gen P5CS phân l p thành công t lúa c chuy n tr l i lúa nh m tăng cư ng ho t ng c a gen nhà khoa h c ã nh n th y r ng tính ch u m n ch u l nh c c i thi n rõ r t Promoter rd29A m t trình t b c m ng bi u hi n dư i i u ki n b t l i khô h n, m n, l nh ã c nhi u nhà khoa h c quan tâm M t s nghiên c u ã phát hi n c trình t promoter rd29A ch a vùng có ho t tính cis vùng c m ng ABA (ABRE) vùng c m ng m t nư c (DRE)/C repeat (CRT) C vùng u liên quan n s bi u hi n gen bi u hi n dư i i u ki n b t l i c a môi trư ng (Yamaguchi-Shinozaki Shinozaki, 1993) Nhi u phịng thí nghi m th gi i ã phân l p ki m tra ho t ng c a promoter rd29A nhi u loài A thaliana, thu c lúa mì (Sun Chen, 2002) C u trúc promoter RD29A i u n gen ch th GUS c chuy n vào khoai tây, mía Ho t tính c a GUS u c phát hi n chuy n gen dư i i u ki n b t l i c a môi trư ng nuôi c y (Zhang et al., 2005) Có nhi u bi n pháp c i thi n kh ch u h n c a tr ng, nh ng hi n áp d ng k thu t chuy n gen nh m tăng cư ng kh ch u h n c a th c v t ang c quan tâm nghiên c u Có th nh n nh r ng tính kh thi ti m ng d ng phương pháp chuy n gen th c v t bi n pháp nâng cao kh ch u h n c a u tương t i Vi t Nam r t cao Chương V T LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 2.1 V t li u, hóa ch t, thi t b V t li u th c v t: 16 gi ng a phương DT84; gi ng thu c 326 (Nicotiana tabacum), Arabidopsis thaliana Hóa ch t nghiên c u: Vector tách dòng pBT, vector pBI101 dùng m c ích thi t k vector chuy n gen, vector pTN 289 dùng c p m i dùng chuy n gen Các nhân b n gen P5CS promoter RD29A c thi t k d a trình t gen P5CS promoter RD29A ăng kí GeneBank v i mã s : AY492005, AB428730 Các lo i hóa ch t dùng cho thí nghi m nuôi c y mô sinh h c phân t c mua t hãng hóa ch t: Merk, Bioneer, Fermentas Phịng Cơng ngh t bào th c v t, Vi n Công ngh sinh h c cung c p 2.2 Phương pháp nghiên c u 2.2.1 Phương pháp sinh lý, hố sinh Bình ánh giá nhanh kh ch u h n theo phương pháp c a Lê Tr n ng tác gi năm 1998 - nh lư ng protein tan c th c hi n theo phương pháp Lowry nh lư ng lipit c mô t tài li u c a Ph m Th Trân Châu Hàm lư ng thành ph n axit amin h t theo Ph m Văn Chi tg (1997) - Hàm lư ng prolin c xác nh b ng phương pháp Bates tg (1973) - Phương pháp tính tốn x lý s li u theo Nguy n H i Tu t Ngô Kim Khôi (1996) 2.2.2 Các phương pháp s d ng nuôi c y in vitro Các phương pháp s d ng nuôi c y in vitro theo Topping ,1988 i v i cây Arabidopsis, thu c u tương tái sinh qua a ch i t nách m m h t chín quy trình chuy n gen vào nách m m h t chín c ti n hành d a phương pháp c a Olhoft tg (2001) có c i ti n 2.2.3 Phương pháp sinh h c phân t Thi t k m i d a vào trình t ã cơng b GenBank Quy trình tách chi t DNA t ng s ( i v i Arabidopsic thu c lá) Phương pháp tách chi t RNA t ng s : S d ng b kit Trizol Regents (c a hãng Invitrogen) tách chi t RNA t ng s t m u u tương theo ch d n c a nhà s n xu t Phương pháp tách chi t, tinh s ch DNA RNA - Phương pháp t ng h p cDNA RNA t ng s c s d ng nhân gen b ng phương pháp t ng h p cDNA, cDNA c t ng h p theo quy trình RevertAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas) - Ph n ng PCR Chu trình nhi t c a ph n ng PCR: Gen P5CS c khu ch i b ng k thu t PCR v i c p m i c hi u theo chu trình nhi t sau: 94ºC/5 phút;: 94ºC/30 giây, Tm /45 giây, 72ºC/1 phút 30 giây; 72ºC/10 phút, 35 chu kì Ti n hành ph n ng PCR v i nhi t 620C) tìm nhi t g nm i khác (t 50 - c hi u - Phương pháp OE - PCR ( Overlap Extention) Chu trình nhi t c a ph n ng PCR: 94ºC/5 phút; 94ºC/30 giây, Tm /45 giây, 72ºC/1 phút 30 giây; 72ºC/10 phút, chu kì Sau chu kỳ l y s n ph m t vào b sung 1µl BamHI 1µl SaclI th c hi n ti p ph n ng theo chu trình nhi t sau: 94ºC/5 phút; 94ºC/30 giây, Tm /45 giây, 72ºC/1 phút 30 giây; 72ºC/10 phút, 30 chu kì - Phương pháp tách dịng: Tách chi t plasmid tái t h p c th c hi n theo Sambrook tg (2001) tinh s ch b ng Plasmid Miniprep Kit (Qiagen) Phương pháp s d ng enzym c t h n ch th c hi n theo Sambrook tg (2001) - Phương pháp PCR tr c ti p t khu n l c (colony-PCR) - Thi t k c u trúc rd29A :: GUS rd29A :: P5CSM - Các phương pháp phân tích bi n n p Ki m tra s có m t c a gen chuy n b ng phương pháp hóa sinh Cây thu c chuy n gen sau s ng nhà kính c x lý h n nhân t o b ng PEG (Jun tg 20001) Hàm lư ng enzym Gus ti p t c c xác nh b ng phương pháp c a Tefferson tg (1987) Chương K T QU VÀ TH O LU N 3.1 K t qu sưu t p ánh giá gi ng u tương a phương c a t nh Sơn La 3.1.1 c i m hình thái, hóa sinh c a h t u tương a phương huy n u tương Phát hi n 16 gi ng 11 huy n th khác c a t nh Sơn La Hàm lư ng protein c a gi ng dao ng kho ng 29,72%-52,75% protein/kh i lư ng khô Hàm lư ng lipit dao ng t 9,9% - 18,65% Gi ng DT84 cho hàm lư ng lipit cao nh t 18,65%, n SL3 (17,34%) 3.1.2 K t qu nghiên c u ánh giá kh ch u h n c a gi ng u tương i v i gi ng SL5 hàm lư ng prolin tăng cao nh t sau gây h n c ngày (tăng 377,44%) Gi ng DT84 có t l tăng hàm lư ng prolin c ba th i i m u th p nh t (101,06; 129,26 146,81%) K t qu nghiên c u phù h p v i nghiên c u c a tác gi loài tr ng khác lúa (Nguy n H u Cư ng tg), (Do tg ), (Choudhary tg 2005), h u (Curtis tg 2004), (Chen tg 2009) 3.2 Phân l p gen P5CS t bi n i m lo i b c ch ngư c 3.2.1 K t qu phân l p gen P5CS 3.2.2 K t qu khu ch RNA t ng s i, tách dòng xác nh trình t gen P5CS ã c tách chi t t ng h p cDNA t SL5 DT84 B n o n gen P5CS c nhân lên b ng PCR c ki m tra b ng i n di gel agarose 0,8% K t qu hình 3.3 cho th y, o n thu c có kích thư c tương ng v i kích thư c tính tốn theo lý thuy t thu c gen P5CS hoàn ch nh, hai s n ph m PCR c tr n l n c s d ng làm khuôn cho ph n ng PCR v i c p m i P5CSfor/P5CSrev theo phương pháp OE-PCR S n ph m PCR thu c có kích thư c kho ng 2100 bp ( Hình 3.4) M M 4 2100bp 1500bp 1000bp Hình 3.3 K t qu nhân hai o n gen P5CS t gi ng u tương DT84 SL5 1, 3: gi ng DT84; 2, 4: gi ng SL5; M: Thang DNA chu n kb K t qu Hình 3.4 K t qu PCR ghép n i hai o n gen P5CS t gi ng u tương DT84 SL5 1, 3: gi ng DT84; 2, 4: gi ng SL5; M: Thang DNA chu n kb c trình t gen cho th y, s n ph m gen tách dòng t m u nghiên c u có kích thư c 2148 nucleotide, mã hoá 715 axit amin 128 c a P5CS c ba gi ng s c ch ho t v trí 125 u axit amin Asp Phe ây hai v trí gây ng c a enzym P5CS tăng hàm lư ng c a prolin t bào (Zhang tg 1995), (Hong tg 2000) 3.2.3 T o t bi n i m lo i b hi u ng c ch ngư c l p t P5CS phân u tương K t qu hình 3.10 cho th y, o n thu c có kích thư c tương ng v i kích thư c tính tốn theo lý thuy t S n ph m OE-PCR thu c có kích thư c kho ng 2100bp (hình 3.11) Kích thư c tương ng v i kích thư c c a gen P5CS g c M M A B 2100bp 1800bp 400bp Hình 3.10 i n di s n ph m PCR V i c p m i P5CS M125for2/SacI-P5C; V i c p m i P5CS for / P5CS rev ; M : Thang DNA chu n kb Nhưng c Hình 3.11 Ph n ng n i hai o n gen theo phương pháp OE-PCR v i c p m i BamHI-P5CS Sacl P5CS A, B : 1+2, M:thang DNA chu n kb bi t xác gen có t o c c trình t gen K t qu 310 320 t bi n i m hay không c n ph i c th hi n 330 340 hình 3.13 350 360 370 380 | | | | | | | | | | | | | | | | MSL5 AACAGCCTTATGGCTCTTTATGATGTTTTGTTTAGTCAGCTGGATGTGACATCTGCTCAGCTTCTTGTGACGGCCAATGA N SL5 S L M A L Y D V L F S Q L D V T S A Q L L V T A N D A N S L M A L Y D V L F S Q L D V T S A Q L L Hình 3.13 Phân tích, so sánh trình t nucleotit phát hi n V T D N D t bi n t i v trí nucleotit 374 c a gen P5CS Trình t gen mã hố cho protein P5CS c a trình t chúng tơi nh n th y nucleotit A u tương, qua k t qu c v trí 374 c a mã b ba GAC c thay th b ng nucleotit C c a mã b ba GCC tương ng trình t protein axit amin v trí 125 Asp c thay b ng Ala 3.3 Phân l p ki m tra ho t ng c a promotor rd29A c m ng khô h n 3.3.1 Phân l p promoter rd29A Trên s trình t gen rd29A ã cơng b ngân hàng gen th gi i, c p m i rd29A -HindIII / rd29A -BamHI ã c thi t k có trình t b ng 3.7 C p m i s tách c promoter có kích thư c 1290 bp, n m trư c codon m u c a gen ch c rd29A B ng k thu t PCR, promoter rd29A ã c phân l p t A thaliana s d ng c p m i c hi u S n ph m c ki m tra gel agarose cho th y có m t băng nh t v i kích thư c kho ng 1300 bp, tương ương kích thư c tính tốn theo lý thuy t Hình 3.15 i n di s n ph m PCR c t h n ch vector pBT/ rd29A M) Marker; 1) s n ph m PCR; 2) s n ph m c t b ng BamHI/HindIII S n ph m PCR c g n vào vector tách dòng pBT c bi n n p vào E coli DH5α K t qu ch n dòng b ng colony-PCR c t plasmid b ng enzym h n ch BamHI/HindIII cho th y s n ph m có kích thư c tương ương kích thư c ã tính tốn theo lý thuy t (hình 3.15) Như v y s n ph m PCR ã c ghép n i thành cơng vào vector tách dịng pBT 10 3.3.2 Phân tích trình t promoter rd29A bi t xác s n ph m PCR ã ti n hành c trình t nucleotide K t qu thu c so sánh v i trình t gen Ngân hàng gen cho th y s n ph m promoter rd29A c a A.thaliana Khi phân tích trình t thu c cho th y promoter phân l p có chi u dài 1290 bp, ch a box trình t c n thi t cho promoter i u hòa bi u hi n gen TATA; CCAAT box- vùng giàu GC (GGGCCAATAG), Cap signal vùng liên quan qu trình phiên mã (-10 -35) Ngồi ch a vùng liên quan n c m ng i u ki n khô h n DRE, ABRE (hình 3.16) K t qu phù h p v i công b c a Wu tg (2008) Shinozaki tg (2007) Sau ã tách dòng xác ph n m m chuyên d ng nh trình t promoter rd29A s d ng phân tích trình t o n promoter ã tách dòng c K t qu nh n th y r ng o n trình t promoter rd29A phân l p nghiên c u có ch a nhân t cis thu c nhóm MYB, DRE, AMYBOX Các nhân t cis ã c kh ng nh c hi u cho promoter i u n bi u hi n c a gen dư i i u ki n b t l i h n, m t nư c m n ã phân l p thành công promoter rd29A, o n gen dài 1290bp ch a nhân t cis c hi u, s d ng o n gen thi t k vector phân tích trình bi u hi n c a promoter dư i i u ki n h n gaatgagaaggatgtgccgtttgttataataaac -10 agccacacgacgtaaacgtaaaatgaccacatgatgggccaatagacatggaccga CCAAT box vùng giàu GC ctactaataatagtaagttacattttaggatggaataaatatcaTACCGACATcag DRE-1 ttttgaaagaaaagggaaaaaaagaaaaaataaataaaagatatacTACCGACATg -35 DRE-2 agttccaaaaagcaaaaaaaaagatcaagccgacacagacacgcgtagagagcaaaatgactttgacgtcacaccacgaaaacagacg cttcatACGTGTCcctttatctct ABRE ctcagtctctctataaacttagtgagaccctcctctgttttactcacaaatatgca Cap signal TATA box aactagaaaacaatcatcaggaataaagggtttgattacttctattgga Hình 3.16 Phân tích trình t promoter rd29A 11 3.3.3 Thi t k vector chuy n gen mang c u trúc rd29A ki m tra kh i u n c a promoter thu c, promoter rd29A c thi t k vào vector pBI101 i u n s bi u hi n gen ch th GUS K t qu ki m tra b ng PCR c t b ng enzym h n ch BamHI/SacI cho th y vector tái t h p thu c ch a o n promoter rd29A (hình 3.18) có kích thư c mong mu n Hình 3.18 i n di s n ph m PCR c t h n ch vector pBI101/ rd29A M) Marker; 1-2) s n ph m PCR; 3-4) s n ph m c t b ng BamHI/SacI Vector tái t h p thu c bi n n p vào ch ng vi khu n Agrobacterium C58, ây s nguyên li u cho chuy n gen vào th c v t, ánh giá kh i u n c a promoter b ng m c bi u hi n GUS dư i i u ki n x lý h n 3.3.4 T o thu c chuy n gen mang c u trúc rd29A :: GUS M nh thu c môi M nh ngâm M nh môi trư ng c m ng GM sau d ch huy n trư ng c ng sinh ngày phù vi khu n sau ngày 12 M nh môi trư ng GM + 50 mg/l Kanamycine + 400 mg/l Cefotaxime sau tháng C m ch i Cây môi môi trư ng GM + trư ng RM + 50 50 mg/l mg/l Kanamycine + Kanamycine + 400 400 mg/l mg/l Cefotaxime sau Cefotaxime tháng sau tháng Ra b u tr u: cát Trong b u t Ra nhà lư i Hình 3.19 Hình nh chuy n c u trúc promotor rd29A vào thu c ánh giá ho t ng c a promtor RD29A thu c chuy n gen K t qu thu c 51 dịng thu c tái sinh mơi trư ng ch a kanamycin Ki m tra 22 dòng b ng ph n ng PCR v i c p m i c hi u rd29A -HindIII/ rd29A -BamHI cho th y có 21 dịng mang gen chuy n rd29A ánh giá ho t ng i u n s bi u hi n gen GUS c a promoter rd29A, chúng tơi ch n ng u nhiên dịng dương tính v i PCR ti n hành x lý h n nhân t o b ng 10% PEG (polyethylene glycol) K t qu cho th y dư i i u ki n thi u nư c bi u hi n GUS dòng thu c chuy n gen m nh rõ ràng so v i dịng chuy n gen khơng x lý ch ng (hình 3.20) 13 i 800 Lư ng M U (p m o l/m in m g) 700 600 500 400 300 200 100 DCT DCS 3T 3S 4T 4S 5T 5S M u Hình 3.20 Bi u hi n gen GUS chuy n gen A: Cây i ch ng khơng chuy n gen có x lý h n; B: Cây chuy n gen không x lý h n; C: Cây chuy n gen sau x lý h n 24 gi Hình 3.21 Ho t tính c a enzym GUS dịng thu c chuy n gen mang promoter rd29A i u ki n h n nhân t o C: m u i ch ng không chuy n gen; 3, 4, 5: dòng chuy n gen, T: trư c x lý h n, S: sau x lý h n Ho t tính c a enzym GUS cịn c xác nh thông qua ph n ng chuy n hóa ch t (MUG) Enzym GUS xúc tác cho ph n ng chuy n hóa MUG thành MU, ho t tính c a gen enzym GUS m nh MU c t o nhi u MU c phát hi n b ng phép o h p th bư c sóng 378 nm ( Fior tg 2009) Lư ng MU o c sau x lý h n cao so v i trư c x lý h n t - 13 l n ( hình 3.21) Nh ng s li u hồn tồn th ng nh t v i cơng b c a (Zhang tg 2005) 3.4 ánh giá kh tăng cư ng kh ch u h n c a thu c chuy n gen mang c u trúc rd29A:: P5CSM 3.4.1 Thi t k vector chuy n gen mang c u trúc rd29A:: P5CSM K t qu c t P5CSM rd29A :: GUS b ng BamHI SacI Và th c hi n ph n ng ghép n i b ng enzym T4 ligaza bi n n p s n ph m ghép n i vào t bào kh bi n E.coli ch ng DH5α, 14 M - + M 1.3kb A 12kb 3,4kb B Hình 3.23 i n di s n ph m clony- PCR c t h n ch vector pBT rd29A:: P5CSM K t qu c a ph n ng c t b ng enzym gi i h n colony-PCR (Hình 3.23) ã kh ng nh ch c ch n c dịng khu n l c u có ch a vector chuy n gen, nghĩa ã thi t k thành công c u trúc gen chuy n mang gen ch u h n rd29A:: P5CSM c ghép n i thành cơng vào vector tách dịng pBT K t qu bi n n p vector chuy n gen rd29A:: P5CSM vào A tumefaciens K t qu PCR c i n di ki m tra gel agarose 0,8% cho th y: có dịng khu n l c c l a ch n cho k t qu dương tính v i ph n ng PCR v i băng nh t có kích thư c kho n 1300 bp i u ch ng t t ã bi n n p thành công vector rd29A:: P5CSM vào bào A tumefaciens Như v y ã t o c ch ng A tumefaciens pGV2260 mang plasmid tái t h p rd29A:: P5CSM ây ngu n nguyên li u ph c v cho m c ích chuy n gen t o tr ng ch ng ch u h n 3.4.2 T o thu c chuy n gen mang c u trúc rd29A:: P5CSM C u trúc chuy n gen pBI101 mang promoter rd9A i u n ho t ng c a gen P5CS c chuy n vào m nh thu c gi ng K326 15 M - + Hình 3.25 K t qu PCR dòng chuy n gen b ng c p m i rd29A for /rd29Arev M: Marker DNA 1kb; 1-9: Các dòng chuy n gen; (-) i ch ng âm; (+) i ch ng dương Hình 3.25 cho th y, s 33 dòng ki m tra thu c 30 dịng cho ph n ng dương tính, gi ng xu t hi n m t v ch AND có kích thư c kho ng 1,4kb ây kích thư c tương ng c a promoter rd29A i u ch ng t dịng có mang c u trúc rd29A:: P5CSM mong mu n 3.4.3 ánh giá kh ch u h n c a dòng thu c chuy n gen Các m u c a dòng thu c chuy n gen i ch ng ã c thu trư c gây h n sau gây h n 3, 5, ngày Các m u c tách chi t ki m tra hàm lư ng prolin K t qu trình bày b ng 3.7 hình 3.25 Sau gây h n nhân t o, hàm lư ng prolin tăng r t m nh so v i trư c gây h n t t c dòng nghiên c u, chuy n gen Sau ngày gây h n, prolin c bi t dịng i ch ng khơng chuy n gen tăng 206.8%, ó v i chuy n gen tăng t 259,5-451,8% (cao nh t dòng H33 th p nh t dịng H11) 16 Hình 3.27 Các dòng thu c sau 20 ngày h n nhân t o (A) sau ph c h i (B) i ch ng không chuy n gen, H11, H15, H26, H33: dòng WT: chuy n gen 3.5 K t qu t o u tương chuy n gen 3.5.1 K t qu tái sinh t o a ch i gi ng u tương DT84 3.5.1.1 T i ưu th i gian kh trùng h t So sánh hai phương pháp kh trùng (b ng khí clo b ng Javen), nh n th y phương pháp kh trùng b ng khí clo ã t ưu th hơn, v y chúng tơi l a ch n phương pháp kh trùng th i gian kh trùng 16 gi kh trùng h t thu nguyên li u cho thí nghi m ti p theo 3.5.1.2 nh hư ng c a BAP n kh t o a ch i t m m h t chín Các m u sau gây t n thương c t b nh sinh trư ng, chúng c t o a ch i lo i môi trư ng (SIM0-SIM7) ch a n ng t 0mg/l (SIM4) n 2,5 mg/l Như v y l a ch n n ng BAP BAP mg/l b sung vào môi trư ng t o a ch i s d ng k t qu cho thí nghi m ti p theo 3.5.1.3 nh hư ng c a hocmon sinh trư ng GA3,t i kh kéo dài ch i Các c m ch i t o môi trư ng SIM4 c chuy n sang môi trư ng (SEM0-SEM3) có b sung GA3 v i n ng 17 tương ng 0,5 mg/l, mg/l 1,5 mg/l Nh ng k t qu thu c nh n th y s ph i h p gi a GA3 (0,5 mg/l) thích h p cho trình kéo dài ch i K t qu phù h p v i m t s k t qu nghiên c u c a tác gi khác ã công b (Olhoft tg 2007), Olhoft tg 2001) 3.5.1.4 nh hư ng c a IBA n hi u qu t o r N ng ã nghiên c u nh n th y 0,1 mg/l n ng c a IBA chúng tơi thích h p nh t cho vi c r u tương in vitro gi ng DT84 3.5.1.5 Xác nh giá th thích h p cho in vitro Th nghi m lo i giá th khác là: tr u hun, tr u hun:1 cát vàng h n h p tr ng có bán s n Hai y u t c ánh giá thí nghi m t l s ng c a ch t lư ng Căn c vào ch t lư ng k t qu nh n th y v i t l giá th tr u hun: cát vàng phù h p Sau hai tu n chuy n 3.5.2 K t qu bư c t u chuy n gen GUS vào u tương DT84 T l bi u hi n t m th i gen gus thu c 67,5% T l m u s ng sót sau tu n mơi trư ng ch n l c 15,21% 3.5.3 K t qu chuy n c u trúc gen ch u h n vào u tương Thí nghi m c ti n hành lơ thí nghi m v i t ng s 1262 m u c s d ng cho chuy n gen, có 564 s m u t o ch i, 101 s m u kéo dài ch i, trình ch n l c kháng sinh có 28 s ng sót r tr ng lư i ki m tra s có m t c a gen chuy n, sau kho ng tháng, m u c a dòng T0 c ti n hành thu K t qu nhà tách chi t DNA t ng s i n di s n ph m PCR cho th y ã thu nh n c dương tính v i ph n ng PCR 18 M Hình 3.36 Ki m tra WT - + u tương T0 chuy n gen b ng PCR M: Thang DNA chu n 1kb; (-): i ch ng âm; WT: Cây không chuy n gen; -4: Các dịng T0 c phân tích; (+): Dịng 11 Hình 3.37 Cây i ch ng dương (plasmid) Dòng 23 Dòng 17 u tương T0 chuy n gen K T LU N VÀ NGH K t lu n 1.1 Gi ng u tương a phương sưu t p c có s a d ng phong phú v hình thái, kích thư c kh i lư ng h t Phân tích v ch tiêu hóa sinh cho th y gi ng u tương h n cao so v i gi ng a phương có ch t lư ng kh ch u i ch ng ã xác nh c m i liên quan gi a t l tăng hàm lư ng prolin kh ch u h n c a gi ng u tương ph m vi nghiên c u 1.2 Trình t gen P5CS c a hai gi ng u tương DT84 SL5 ã c phân l p g m có 2148 nucleotit, mã hóa 715 axit amin 19 1.3 ãt o t bi n b ba có v trí th 125 c a gen P5CS c a gi ng u tương SL5, thay th Asp b ng Ala trình t protein 1.4 Promoter rd29A ã c phân l p thành công t Promotor rd29A có chi u dài 1298bp mang trình t A.thaliana c trưng g m nhân t cis thu c nhóm MYB, DRE, AMYBOX nhân t c trưng c a promoter nhân t c m ng i u ki n khô h n 1.5 Kh ho t ng c a promtor rd29A ã c ánh giá thu c chuy n gen Trong i u ki n thi u nư c, promoter rd29A ã i u n gen ch th GUS bi u hi n m nh rõ ràng dòng thu c chuy n gen c x lý b i h n nhân t o so v i dịng chuy n gen khơng x lý 1.6 i ch ng i v i dòng thu c chuy n gen mang c u trúc rd29A:: P5CSM , có hi n tư ng tăng cao hàm lư ng prolin sau gây h n nhân t o, d n n kh s ng sót cao i ch ng (không chuy n gen) Kh ph c h i c a dòng chuy n gen nhanh i ch ng 1.7 T i ưu c quy trình tái sinh chuy n gen thơng qua mô nách m m u tương Bư c P5CSM vào gi ng PCR u chuy n thành công c u trúc gen rd29A:: u tương DT84, thu c m t s dịng dương tính i v i gen chuy n ngh 2.1 Ti p t c nghiên c u, phân tích dịng u tương chuy n gen ch u h n ph c v cho ch n t o gi ng 2.2 M r ng s d ng c u trúc promoter rd29A:: GUS rd29A:: P5CSM vào i tư ng tr ng khác 20 ... vector chuy n gen mang c u trúc liên quan n tính ch u h n u tương 2.3 T o u tương mang c u trúc gen liên quan n c tính ch u h n 3 N i dung nghiên c u 3.1 Phân tích c i m sinh lý, hóa sinh c a m... sĩ là: ? ?Phân l p, t o t bi n i m gen P5CS liên quan n tính ch u h n th nghi m chuy n vào Vi t Nam? ?? u tương M c tiêu nghiên c u 2.1 So sánh trình t gen mã hóa P5CS c a gi ng a phương thu c nhóm... u tương m i mang tính kháng sâu b nh, nhiên cho n cơng trình nghiên c u v chuy n gen ch u h n vào u tương v n chưa c quan tâm úng m c Xu t phát t nh ng lý ti n hành tài lu n án ti n sĩ là: “Phân

Ngày đăng: 14/07/2014, 13:31

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

Tài liệu liên quan