ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHỌN TẠO GIỐNG LÚA CHẤT LƯỢNG CAO Ở TỈNH AN GIANG I. Những thông tin chung - Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Thị Lang - Cộng tác viên: TS. Bùi Chí Bửu, ThS. Nguyễn Thạch Cân, KS. Trịnh Thị Lũy, KS. Trịnh Hoàng Khải, KS. Phạm Thị Bé Tư, KS. Nguyễn Thị Tâm, KS. Bùi Thị Dương Khiều, KS. Nguyễn Thuần Khiết, KS. Lê Thùy Nương, KS. Võ Trường An, Nguyễn Đình Loan, KS. Phạm Thanh Minh, ThS. Trương Bá Thảo, ThS. Trần Thanh Sơn, KS. Đào Hoa Lý, KS. Tầng Phú An. - Cơ quan quản lý: Sở Khoa học Công nghệ và Môi trường tỉnh An Giang - Cơ quan chủ trì: Viện nghiên cứu lúa đồng bằng sông Cửu Long - Đơn vị thực hiện: Bộ môn Di truyền giống lúa - Thời gian thực hiện: tháng 1/2002 - 12/2003 II. Tính cấp thiết của đề tài Cây lúa là cây lương thực chiếm vị trí quan trọng cho các nước đang phát triển, đặc biệt là Việt Nam. Cây lúa ở tỉnh An Giang đạt được năng suất đáng kể có nơi trung bình năm đạt 10tấn/ha/năm như các Huyện Châu Phú, An Phú và Chợ Mới tỉnh An Giang. Tuy nhiên chất lượng giống lúa là mục tiêu quan trọng cần chú ý. Trong các tính trạng về phẩm chất cơm, hàm lượng amylose được xem là tính trạng có ý nghĩa quyết định đến sự mềm cơm hoặc ngược lại. Hàm lượng amylose cao có tính trội không hoàn toàn so với hàm lượng amylose thấp, nó do một gen điều khiển kèm theo một số modifiers (gen phụ có tính chất cải tiến). Phẩm chất dinh dưỡng được quan tâm nhiều là protein và vitamin A. Đây là các yếu tố cơ bản trong hàm lượng dinh dưỡng của cây lúa nói riêng và các cây trồng nói chung. Kiểu hình chấp nhận được và sự thể hiện của hạt gạo (grain appearance) là đặc điểm quan trọng cung cấp thông tin cần thiết giúp cho người chọn giống định hướng việc tạo giống lúa đạt với thị hiếu của người tiêu thụ. Đặc điểm chiều dài hạt gạo, độ trong của phôi nhũ, tỉ lệ bạc bụng là những yếu tố cần xem xét trước tiên. Tính trạng bạc bụng biến đổi rất mạnh do ảnh hưởng của môi trường. Những tiến bộ kỹ thuật về chuyển nạp gen, ứng dụng marker phân tử trong chọn lọc giống lúa cho phép chúng ta nghĩ đến một giống lúa dạng hình mới đột phá ngưỡng năng suất hiện nay, có khả năng chống chịu sâu bệnh hại ổn định, chống chịu phèn, khô hạn tốt, có phẩm chất gạo tốt về xay chà, phẩm chất cơm, phẩm chất dinh dưỡng. Những tiến bộ kỹ thuật hiện nay và tương lai gần cho phép chúng ta thực hiện việc đa dạng sinh học trong sản xuất lương thực. Nhìn vào thị trường tiêu thụ lúa gạo hiện nay, chúng ta cần phải đầu tư hơn nữa trong việc nâng cao chất lượng gạo, thông qua nhiều con đường để rút ngắn được thời gian và cung cấp kịp thời các giống mới cho tỉnh. Bên cạnh chất lượng, cần chú ý đến tình hình sâu bệnh, sâu bệnh hằng năm diễn biến thất thường. Đặc biệt trong năm 2003 dịch rầy nâu, bệnh cháy lá ảnh hưởng không nhỏ đến sản xuất cả nước và tỉnh nhà nói riêng. Trong phạm vi đề tài này nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học về marker phân tử, nuôi cấy mô tế bào kết hợp với công nghệ chọn giống tạo giống truyền thống để rút ngắn thời gian chọn giống mới có phẩm chất tốt và phục vụ cho sản xuất. III. Mục tiêu và nội dung đề tài 1. Mục tiêu - Ứng dụng công nghệ sinh học và khảo nghiệm đồng ruộng để chọn một đến hai giống lúa mới cho tỉnh An Giang - Cung cấp giống lúa tác giả cho Trung tâm giống tỉnh An Giang 2. Nội dung - Ứng dụng marker phân tử trong chọn dòng lúa có phẩm chất cao - Ứng dụng nuôi cấy túi phấn, xử lý biến dị soma trong chọn tạo dòng lúa có phẩm chất cao bao gồm lúa thơm đặc sản - Nghiên cứu chọn dòng triển vọng theo hướng lúa đặc sản và nâng cao chất lượng giống lúa có phẩm chất cao. - Khảo nghiệm và chọn lọc các giống có phẩm chất tốt, năng suất cao phù hợp cho từng vùng sinh thái. - Tập huấn nâng cao kiến thức cán bộ nông nghiệp, giới thiệu các phương pháp mới trong nghiên cứu và quản lý giống cây trồng - Cung cấp giống lúa tác giả cho tỉnh IV. Phương pháp nghiên cứu 1. Địa điểm - Viện Nghiên cứu lúa đồng bằng sông Cửu Long - Trung tâm Nghiên cứu và Sản xuất giống tỉnh An Giang - Nông dân tham gia thí nghiệm 2. Phương pháp nghiên cứu - Nuôi cấy tế bào soma: bốc vỏ hạt gạo và rửa trong cồn 70% trong 1 phút và chlorox 45% với 1-2 giọt Tween trong 20- 30 phút, rửa hạt với nước cất 5 lần. Ủ hạt trong môi trường (MS) (Murashige and Skoog ) với 2mg 2,4D/l, để môi trường trong tối, sau 3-4 tuần , tách mô sẹo từ phôi và ủ trong môi trường MS cho chúng phát triển, ủ trong tối 27 o C. Cấy mô sẹo sau 3 - 4 tuần rồi chuyển qua môi trường dung dịch Yoshida. - Phương pháp nuôi cấy túi phấn: hạt lai F1 được gieo làm hai đợt cách nhau 1 tháng trồng trong nhà lưới. Bông lúa non được thu khi khoảng cách từ gốc lá đồng đến gốc lá thứ nhất từ 5 - 10cm và xử lý lạnh 10 0 C trong 10 ngày. Hạt phấn lúc nầy ở giai đoạn cuối đơn phân và thích hợp cho nuôi cấy.Túi phân được tách ra khổi vỏ trấu, xử lý cồn 70 độ trong 1 phút, 0,1% HgCl 2 trong 15 phút và rửa sạch nhiều lần bằng nước cất tiệt trùng. Túi phấn của các cây trồng trong đợt đầu sau đó được nuôi trong môi trường N 6 có bổ sung kích thich sinh trưởng. Mô sẹo hình thành đường kính 2 - 3mm được tái sinh trong môi trường MS có bổ sung 1mg/l BAP, 1mg/l NAA ở 25 o C và 12 giờ chiếu sáng. Cây tái sinh được nhân vô tính trên môi trường MS có bổ sung 2mg/l BAP. Một nữa số cây trong cùng dòng được tạo ra trên môi trường MS không chất kích thích sinh trưởng. Cây có bộ rễ phát triển được trồng trong môi trường dinh dưỡng Yoshida. Các dòng cho hạt lép được giữ trong phòng được xử lý colchicine ở nồng độ 0,05% trong 10 giờ hoặc trong tối 5 giờ. - Marker sử dụng đánh giá đa dạng nguồn gen dùng microsatellite với các bước ly trích DNA, đánh giá chất lượng DNA, thiết kế PCR, chọn Primer, chạy điện di và đánh giá kết quả - Thực hiện các thí nghiệm quan sát sơ khởi, thí nghiệm so sánh năng suất hậu kỳ ở Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long và Trung tâm nghiên cứu sản xuất giống tỉnh An Giang. Thí nghiệm chọn tạo giống lúa được bố trí theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lập lại, dùng phương pháp cấy ở mật độ 15 x 20cm x 1 tép/bụi, phân bón theo công thức 100 - 30 -30kg NPK/ha vụ Đông xuân và 80-40-30kg NPK/ha vụ Hè thu. - Thực hiện các thí nghiệm khu vực hóa giống lúa ở các vùng đất có điều kiện canh tác khác nhau trong tỉnh Thí nghiệm khu vực hóa giống lúa được áp dụng kỹ thuật sạ ở mật độ 150kg/ha, mỗi lô 20m 2 . Mẫu năng suất được gặt là 10m 2 . - Thu thập các chỉ tiêu nông học:ngày trổ, chiều cao, số bông/bụi, số hạt chắc/bông, trọng lượng 1000 hạt và năng suất. - Phân tích chất lượng xay chà: 200g mẫu lúa được sấy khô ở ẩm độ hạt 14%, được đem xay trên máy McGill Polisher no. 3 của Nhật. Các thông số về tỉ lệ gạo lức, tỉ tệ gạo trắng, tỉ lệ gạo nguyên được thực hiện theo phương pháp của Govindewami và Ghose (1969) - Hình dạng và kích thước hạt được đo bằng máy Baker E-02 của Nhật và phân loại theo thang điểm IRRI (1996) - Độ bạc bụng được cho điểm theo SES (IRRI 1996) - Hàm lượng amylose được phân tích trên máy so màu, theo phương pháp của Sadavisam và Manikam (1992) - Độ trở hồ được đo bằng phương pháp lan rộng và độ trong suốt của hạt gạo với dung dịch KOH 1,7% trong 23 giờ ở 30 o C. - Độ bền thể gel được phân tích theo phương pháp của Tang và ctv. (1991) và phân loại theo tiêu chuẩn SES (IRRI 1996) - Phân tích số liệu: phân tích sự ổn định theo mô hình Eberhart và Russel. Mô hình được bổ sung bằng chương trình AMI chạy trên BSTAT của McLaren. Phân tích đa dạng hóa nguồn gen theo phần mềm Popgene. Đo khoảng cách di truyền là đo biến động giữa kiểu hình giữa quần thể, quyết định liên quan giữa kiểu hình và kiểu gen giữa các giống, phân tích cấp bậc các khoảng cách nầy. Khoảng cách đo bằng công thức chung của Nei‘S. Dùng Popgen xem như công cụ đo khoảng cách và mối liên hệ của chúng thông qua dominant và codominant của các giống. V. Kết quả đạt được 1. Chọn tạo các giống lúa có năng suất cao trung bình trên 7 tấn/ha ở vụ Đông xuân và trên 5 tấn/ha ở vụ Hè Thu như AS996, OM3536, OM2822, OM3235, OM2705, OM2517 và OM2717, OM2718, OM4495. Giống OM 3536 có năng suất cao, tương đương với đối chứng IR64, giá trị ổn định qua nhiều điểm và mùa vụ, chất lượng gạo đạt nhiều yếu tố tính trạng như độ mềm cơm, thơm nhẹ, ngắn ngày dễ canh tác. Giống lúa AS996 còn có tên gốc là OM2431-996 được khảo nghiệm với ý nghĩa ban đầu khai thác tính chống chịu phèn của giống lúa hoang Oryza rufipogon. Kết quả thanh lọc nhôm 30ppm cho thấy chiều dài rễ tương đối (RRL) của AS996 và OM1490 khác biệt có ý nghĩa ở mức 0,05 so với đối chứng Cà Đung Đỏ. Điều nầy cho thấy giống AS 996 ngoài cho năng suất cao mà còn phù hợp cho các vùng phèn, mặn. Giống OM2395, OM2705, OM 2822, OM3235 có năng suất cao ổn định qua cả 2 vụ, cần bổ sung kịp thời cho vùng thâm canh. 2. Ứng dụng gen mùi thơm được đánh giá trên 1000 quần thể giống lúa Nàng Nhen thơm của tỉnh An Giang cho thấy mức độ biến động của gen nầy rất lớn. Dựa vào đánh giá nầy có thể phân ra thành bốn nhóm, nhóm 1: không thơm chiếm 60%, nhóm 2: thơm nhẹ chiếm 37%, nhóm 3: thơm trung bình chiếm 3% và nhóm 4: thơm mạnh chiếm 0,001%. Số dòng thơm được chọn lọc và ứng dụng vào sản xuất 3. Chương trình tập huấn cho 25 cán bộ kỹ thuật của tỉnh An Giang cũng được thực hiện đào tạo trong thời gian 1 tuần với các nội dung chọn giống, công nghệ sinh học, đột biến, phòng trừ tổng hợp, sinh thái côn trùng, đất phân, canh tác, vi sinh học đất, và phần thống kê sinh học trong tính toán số liệu. Tập huấn cho 520 nông dân trong đó nam là 512 người còn lại 8 nông dân là nữ, thời gian 6 ngày ở các huyện với các nội dung chọn giống, đánh giá và chọn giống ngoài đồng, tiêu chuẩn và chất lượng hạt giống, hệ thống giống lúa ba cấp, tiêu chuẩn sản xuất giống, phòng trừ tổng hợp IPM, sạ thưa theo hàng, sử dụng bảng so màu lá lúa giúp cho việc bón phân. Kết quả sau khi phỏng vấn các bác nông dân cho thấy họ cần nhiều giới thiệu kỹ thuật mới. Bảng 1: Phân tích phẩm chất xay chà các giống lúa có triển vọng Giống Lức (%) Trắng (%) Nguyên (%) Bạc bụng cấp 9 (%) Dài (mm) Rộng (mm) OM2718 78,7 67,1 36,3 13,1 7,1 2,11 OM4495 79,1 67,2 43,7 8,5 6,9 2,11 OM2717 79,1 66,8 38,0 9,9 7,1 2,03 OM3536 76,7 63,9 34,6 3,2 7,1 2,10 OM2507 80,3 67,7 39,1 14,8 7,2 2,15 OM 2492 78,0 63,0 39,7 13,5 7,1 2,13 OM 4498 79,0 66,6 28,8 14,7 14, 2,09 OM 4408 77,6 61,8 31,9 17,3 7,1 2,03 IR64 77,7 63,8 35,3 7,8 7,1 2,11 Bảng 2: Phân tích phẩm chất cơm các giống các giống lúa có triển vọng Giống Protein (%) Trở hồ (cấp) Bền gel (mm) Amylose (%) OM2718 7,7 2,8 38,5 26,1 OM4495 8,5 3,1 40,4 24,5 OM2717 8,8 2,8 37,5 26,1 OM3536 10,0 5,4 49,6 22,3 OM2507 8,1 6,6 36,2 27,7 OM 2492 7,2 2,8 38,6 25,2 OM 4498 8,45 3,1 38,3 24,7 OM 4408 8,9 5,6 36,8 25,9 IR64 8,8 3,1 43,9 24,7 VI. Kết luận và kiến nghị 1. Kết luận - Tăng năng suất lúa và chất lượng lúa gạo là yếu tố quan trọng trong công tác chọn tạo giống lúa hiện nay ở An Giang. - Ứng dụng công nghệ mới kết quả bước đầu chọn tạo giống OM3566 được chọn từ biến dị soma của Jamine85, OM3405 được chọn lọc từ nuôi cấy túi phấn và 02 giống OM4495 và OM4498 từ marker phân tử cho năng suất cao cả hai vụ Đông Xuân và Hè Thu. - Kết quả thí nghiệm cho thấy giống có năng suất và chất lượng gạo cao là AS996, OM3536, OM2822, OM3235, OM2705 và OM2517. Giống OM3536 cần được chú ý khai thác mùi thơm và phẩm chất gạo ngon Giống AS996 năng suất cao phù hợp vùng đất nhiễm phèn - Dạng hạt gạo, độ trở hồ ổn định tốt nhất trong cả hai vụ Đông xuân và Hè thu. Trái lại, amylose tỏ ra kém ổn định trong vụ Hè thu so với Đông xuân. 2. Kiến nghị Một số giống mới cần được khảo nghiệm bổ sung cho các vụ tiếp theo là OM2822, OM2718, OM4498, OM4408 ngắn ngày sẽ phục vụ yêu cầu sản xuất vùng ngập lũ của An Giang. . đề tài này nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học về marker phân tử, nuôi cấy mô tế bào kết hợp với công nghệ chọn giống tạo giống truyền thống để rút ngắn thời gian chọn giống mới có phẩm chất. tiêu - Ứng dụng công nghệ sinh học và khảo nghiệm đồng ruộng để chọn một đến hai giống lúa mới cho tỉnh An Giang - Cung cấp giống lúa tác giả cho Trung tâm giống tỉnh An Giang 2. Nội dung - Ứng dụng. năng suất lúa và chất lượng lúa gạo là yếu tố quan trọng trong công tác chọn tạo giống lúa hiện nay ở An Giang. - Ứng dụng công nghệ mới kết quả bước đầu chọn tạo giống OM3566 được chọn từ biến