Nội dung cơng nghệ tế bào cơng nghệ nuôi cấy mô - tế bào Nguyên tắc phương pháp nuôi cấy mô - tế bào Nuôi cấy mô - tế bào dựa hai nguyên tắc sau: 1.1 Tính tồn tế bào: Mỗi tế bào mang đầy đủ lưMợng thông tin di truyền thể có khả phát triển thành thể hoàn chỉnh gặp điều kiện thuận lợi Năm 1922N, nuôi đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ hòa thảo 12 ngày Như vậy, lần tính tồn tế bào chứng minh thực nghiệm Sau 43 năm (năm 1965n), nuôi tế bào riêng biệt thuốc tạo thuốc hoàn chỉnh ống nghiệm Kết qủa chứng minh đầy đủ tính tồn tế bảo 1.2 Khả biệt hóa phản biệt hóa tế bào Biệt hóa biến đổi tế bào từ trạng thái tế bào phôi thể chức Các tế bào dùng ni cấy biệt hóa cấu trúc chức từ tế bào phơi Trong điều kiện thích hợp, làm cho tế bào quay trở lại trạng thái tế bào sinh chúng - tế bào phơi qúa trình gọi qúa trình phản biệt hóa Trong thể, loại tế bào có khả biệt hóa, phản biệt hóa triển vọng nuôi cấy thành công khác Những tế bào chuyên hóa chức (đã biệt hóa sâu) khó xảy qúa trình phản biệt hóa, tế bào mạch dẫn hệ thống mạch dẫn thực vật, tế bào thần kinh động vật Người ta tổng kết rằng; tế bào gần với trạng thái tế bào phơi khả ni cấy thành cơng cao nhiêu Đối với lồi thực vật tế bào phơi non, tế bào mô phân sinh, tế bào quan sinh sản (hạt phấn, nỗn) dễ xẩy qúa trình phản biệt hóa Vì nói cách hình tượng Galson (1986) Murashige (1974) khả hình thành quan hay thể tế bào thực vật giảm dần theo chiều hướng từ xuống gốc Các tế bào động vật nói chung khó ni cấy chúng biệt hóa qúa sâu sắc qúa trình ngược lại (phản biệt hóa) khó thực Các kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật Nuôi cấy mô-tế bào thực vật - công nghệ đại nhân giống vơ tính thực vật Mục đích chung nuôi cấy mô M- tế bào thực vật sử dụng điều kiện như: nhiệt độ, ánh sáng, thành phần dinh dưỡng, chất điều hoà sinh trưởng thực vật… để điều khiển qúa trình sinh trưởng phát triển tế bào, mô nuôi cấy theo mục tiêu yêu cầu đặt Trong thập kỷ qua công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật phát triển mạnh mẽ nhiều quốc gia giới Nuôi cấy mô tế bào thực vật công cụ cần thiết nhiều lĩnh vực nghiên cứu ứng dụng ngành sinh học Nhờ áp dụng kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh, mô sẹo… người thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh gấp nhiều lần tốc độ vốn có tự nhiên tạo hàng loạt cá thể giữ nguyên tính trạng di truyền thể mẹ, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất quy mô lớn Hơn dựa vào kỹ thuật nuôi cấy mô- tế bào trì bào quản nhiều giống trồng qúy loại bỏ nhiều mầm bệnh (phục tráng giống) Mặt khác sử dụng kỹ thuật nuôi cấy dung hợp protoplast (tế bào trần) thực việc chuyển gen mong muốn vào trồng… Bên cạnh nhà nghiên cứu cịn thu nhận chất trao đổi thứ cấp từ tế bào nuôi cấy ổn định độc lập, lệ thuộc vào sản xuất thực vật tự nhiên Ngồi ra, ni cấy mơ - tế bào thực vật phương pháp nghiên cứu hiệu qủa qúa trình phát sinh hình thái nhiều lồi thực vật Phương pháp giúp mở hướng nghiên cứu sinh lý di truyền thực vật : chế sinh tổng hợp chất, sinh lý phân tử - đột biến, sinh lý dinh dưỡng tế bào thực vật nhiều vấn đề sinh học khác… 2.1 Nuôi cấy mô quan tách rời Năm 1946, khởi đầu nuôi cấy mô quan tách rời thí nghiệm ni cấy đỉnh chồi măng tây Apragus offcinalis, sau ni cấy phận khác cây: lá, hoa, thân Nhu cầu dinh dưỡng nuôi cấy mô quan tách rời có điểm chung: nguồn cacbon (đường), nguyên tố đa lượng (N, P, K, Ca), vi lượng (Mg, Fe, Mn, Zn, Co, …) vitamin Tuy nhiên ni cấy mơ địi hỏi cao ni cấy quan tách rời, phải bổ sung thêm chất hữu chứa N (axit amin) đặc biệt chất điều hòa sinh trưởng phải đầy đủ, mơ tách rời khơng có khả tổng hợp chất Trong nghiên cứu nuôi cấy mô quan tách rời, việc chọn mẫu có tầm quan trọng đặc biệt: mẫu phải tình trạng sinh lý tốt phát triển, phần non phôi hợp tử trưỏng thành mầm, phần mầm, chồi bên thứ hay thứ hai, nơi chứa nhiều tế bào mô phân sinh Nuôi cấy mô quan tách rời ứng dụng nghiên cứu điều kiện sinh trưởng phận mô cây; nhân nhiều nhanh in vitro, tạo mô sẹo phục vụ cho nghiên cứu chọn dòng tế bào, đột biến soma 2.2 Nuôi cấy mô phân sinh Đặc điểm mô phân sinh chứa tế bào non trẻ, phân chia mạnh, lại không bị virut xâm nhập Nuôi cấy mô phân sinh dùng trường hợp: - Tạo giống virut từ giống bị bệnh (phục tráng giống) - Nhân giống in vitro - Tạo đa bội thơng qua xử lý coxixin - Nghiên cứu qúa trình hình thành quan 2.3 Ni cấy mơ sẹo (callus) Khi cân chất kích thích sinh trưởng thực vật thay đổi, cụ thể mô đỉnh sinh trưỏng hay nhu mô tách nuôi cấy mơi trường có tỉ lệ auxin cytokinin thích hợp, mơ sẹo hình thành Đó khối tế bào phát sinh vô tổ chức có hình dạng khơng định với màu vàng, trắng xanh Nguyên liệu để tạo mô sẹo phần non cây, đưa vào môi trường ni cấy Trong qúa trình ni cấy tạo mơ sẹo, mẫu thường phải để tối, Tạo mô sẹo coi qúa trình giải biệt hóa, đưa mẫu biệt hóa trở trạng thái ban đầu phơi Mơ sẹo hình thành gồm hai loạiM: - Loại xốp: chứa nhiều tế bào xốp với nhân nhỏ, chất tế bào lỗng khơng bào to - Loại cứng ngược lại: tế bào chắc, nhân to, chất tế bào đậm đặc không bào nhỏ Từ khối mơ sẹo đưa vào môi trường nhân sinh khối để thu lượng lớn mô sẹo Nuôi cấy mô sẹo ứng dụng nhiều trường hợp: - Nhân giống in vitro lồi thực vật mà phương pháp nhân giống ni cấy đỉnh sinh trưởng có hiệu qủa khơng thực - Làm nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào đơn, thu nhân chất có hoạt tính sinh học - Nguyên liệu cho chọn dòng tế bào: đột biến, chọn dịng tế bào có khả chống chịu cao - Nghiên cứu qúa trình hình thành quan 2.4 Nuôi cấy phôi Năm 1958, thu tế bào phơi vơ tính từ mơ dinh dưỡng cà rốt đưa vào nuôi cấy in vitro Thành công mở hướng ni cấy phơi vơ tính Phơi vơ tính có khả nẩy mầm tạo hồn chỉnh phơi hữu tính Ni cấy phơi vơ tính xem kỹ thuật mang lại nhiều hiệu qủa nhân giống trồng, nhân giống vơ tính theo phương pháp cổ điển cịn nhiều hạn chế Ngồi ni cấy phơi vơ tính cịn dùng để: - Thử sức sống phơi hạt - Duy trì phơi yếu cứu phơi lai xa - Sản xuất hạt nhân tạo mà chất tế bào phôi bọc vỏ đặc biệt 2.5 Ni cấy bao phấn hạt phấn Các thí nghiệm nuôi cấy bao phấn thực vào năm1966, tiến hành cà độc dược thu đơn bội Nuôi cấy bao phấn, hạt phấn có ưu điểm đơn giản thao tác kỹ thuật môi trường nuôi cấy, lại tạo lưỡng bội từ mơ soma thành bao phấn, khó phân biệt với tự lưỡng bội từ đơn bội Nuôi cấy bao phấn hạt phấn dùng cho tạo dòng để: - Nghiên cứu gen lặn chúng khơng biểu thể dị hợp tử - Chọn dịng đột biến 2.6 Ni cấy tế bào đơn tế bào trần Melcher Berman (1959) người tách, nuôi cấy tế bào đơn thực vật Tiếp theo nhiều tác giả khác nghiên cứu ni cấy tế bào đơn thí nghiệm điển hình Street (1970), ơng ni cấy trì đ- ược sinh trưởng liên tục huyền phù tế bào Các tế bào đơn tách từ mô thực vật phơng pháp nghiền xử lý enzym Sau chúng ni cấy dịch lỏng, có khuấy lắc tạo điều kiện thuận lợi cho trao đổi khí tiếp xúc với chất dinh dưỡng Yêu cầu dinh dưỡng cho nuôi cấy tế bào đơn phức tạp, chúng bị nhiều chất cần thiết cho sinh trưởng, tách rời khỏi quần thể tế bào Vì việc lựa chọn môi trường dinh dưỡng điều khiển nuôi cấy phù hợp việc nghiên cứu nuôi cấy tế bào đơn ứng dụng nuôi cấy tế bào đơn cho mục đích; - Nghiên cứu sinh trưởng, phát triển phân hóa tế bào điều kiện khác - Chọn dòng tế bào - Thu nhận chất trao đổi thứ cấp Nuôi cấy tế bào trần N ( protoplast ) cơng trình Cooking (1960) ơng thu đợc protoplast từ tế bào rễ cà chua phương pháp enzym - Mô hay dùng để tách protoplast nhu mơ thịt lá, ngồi dùng mơ sẹo hay tế bào đơn Sau xử lý enzym thành tế bào bị loại bỏ, cịn màng tế bào bao bọc tất cấu trúc tế bào Do protoplast đối tượng lý tưởng cho nghiên cứu: - Tạo lai soma nhờ phương pháp dung hợp protoplast - Chuyển bào quan (ty thể, lạp thể) nhân vào tế bào - Qúa trình sinh tổng hợp màng tế bào Sự phân hóa hình thành quan mơ tế bào nuôi cấy Trong tế bào nuôi cấy thờng xẩy hai dạng phân hóa quan đờng hình thành nhu mơ phân hóa quan qua tạo phơi soma 3.1 Sự phân hóa nhu mơ Sự phân hóa nhu mơ môi trờng nuôi cấy in vitro đợc bẵt đầu ngừng phân hóa tạo thành mơ sẹo – tổ chức tế bào khơng phân hóa Dới tác dụng chất điều hòa sinh trởng yếu tố môi trờng nuôi cấy khả phân hóa mơ phân hóa lại đợc khơi phục phân hóa thành thể hồn chỉnh Phân hóa quan Trong qua trình phân hóa quan, mơ sẹo khơng có tổ chức hình thành cấu trúc hình thái dẫn đến việc tạo chồi, rễ, cành, hoa, hồn chỉnh Qúa trình phân hóa thực cách thay đổi số chất chất điều hòa sinh trởng mơi trờng ni cấy Qúa trình hình thành quan mô xẩy qua hai giai đoạn, tái phân hóa giai đoạn hình thành mầm mống quan Khả hình thành quan mô khác (Galston, 1968, Murashige) Đối với mô sẹo, xu tạo quan giảm dần mơ cấy chuyển nhiều lần mơ cấy chuyển nhiều lần thờng hình thành tế bào đa bội lệch bội ngồi yếu tố di truyền Sự phân hóa mơ ni cấy cho thấy tiềm mãnh liệt tế bào thực vật, nhờ tế bào tái phân hóa để tạo thành tế bào mô thực vật nuôi cấy tạo thành thể hồn chỉnh 3.2 Phân hóa phơi số lồi thực vật tái sinh hoàn chỉnh từ tế bào xẩy theo phân hóa phơi nh trờng hợp phân hóa quan, phân hóa phơi tái phân hóa tế bào biệt hóa mơ ni cấy sau xẩy qúa trình tạo phơi Steward cộng (1958) mơ tả hình thành cấu trúc phôi tế bào cà rốt nuôi cấy môi trờng lỏng Đầu tiên tế bào phân chia mạnh để tạo thành cụm tế bào, cụm phân tử xylem đợc hình thành sau xẩy qua trình tạo mầm mống rễ Khi chuyển sang mơi trờng ni tiếp quan sát thấy hình thành chồi sau hồn chỉnh Cả hai qúa trình phân hóa phơi phân hóa nhu mơ để hình thành quan nh chồi, rễ, chịu tác động chất sinh trởng điều kiện nuôi cấy  ... hóa) khó thực Các kỹ thuật ni cấy mô - tế bào thực vật Nuôi cấy mô -tế bào thực vật - công nghệ đại nhân giống vơ tính thực vật Mục đích chung nuôi cấy mô M- tế bào thực vật sử dụng điều kiện như:... phát triển tế bào, mô nuôi cấy theo mục tiêu yêu cầu đặt Trong thập kỷ qua công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật phát triển mạnh mẽ nhiều quốc gia giới Nuôi cấy mô tế bào thực vật công cụ cần.. .tế bào phôi thể chức Các tế bào dùng ni cấy biệt hóa cấu trúc chức từ tế bào phơi Trong điều kiện thích hợp, làm cho tế bào quay trở lại trạng thái tế bào sinh chúng - tế bào phơi qúa