Di truyền phân tử ( phần 18 ) Sử dụng enzym giới hạn trong phân tích ADN Hầu hết các phân tử ADN trong tự nhiên đều lớn hơn nhiều so với kích thước có thể thao tác và phân tích một cách thuận lợi trong phòng thí nghiệm. Trong các tế bào, phần lớn các nhiễm sắc thể thường là một phân tử ADN dài chứa hàng trăm thậm trí hàng nghìn gen khác nhau. Vì vậy, để có thể phân lập và phân tích từng gen, người ta phải cắt các phân tử ADN kích thước lớn thành các phân đoạn nhỏ. Công việc này được thực hiện bởi một nhóm các enzym đặc biệt gọi là enzym giới hạn. Tất cả các enzym giới hạn đều có hai đặc tính: 1) nhận biết một trình tự đặc hiệu trên phân tử ADN (gọi là trình tự giới hạn); và 2) cắt bên trong phân tử ADN tại vị trí đặc hiệu (hoặc ngay tại vị trí giới hạn như đối với nhóm enzym giới hạn loại ; hoặc cách vị trí giới hạn một số nucleotit nhất định như đối với các nhóm enzym giới hạn thuộc các nhóm và ). Trong các nhóm enzym giới hạn, nhóm thường được dùng trong các nghiên cứu di truyền phân tử và kỹ nghệ gen là nhóm nhờ vị trí và trình tự cắt của chúng được xác định rõ. Vì vậy chúng ta chỉ đề cập đến việc ứng dụng của nhóm enzym giới hạn này. Các trình tự giới hạn của enzym nhóm thường gồm 4 - 8 bp, thông thường có tính đối xứng và vị trí cắt thường nằm trong trình tự giới hạn này. Ví dụ như enzym giới hạn coR được tìm thấy ở vi khuẩn E. coli có trình tự giới hạn là 5’-GAATTC- 3’ với vị trí cắt ở giữa G và A. Tên enzym gồm 3 ký tự đầu chỉ tên loài vi khuẩn mà từ đó enzym được tìm thấy (Eco = Escherichia coli), các ký tự sau chỉ tên của chủng vi khuẩn và số thứ tự của enzym được tìm thấy ở loài vi khuẩn đó (EcoRI là enzym giới hạn đầu tiên được tìm thấy ở E. coli). Một enzym giới hạn có trình tự giới hạn gồm 6 bp giống EcoRI thông thường được trông đợi sẽ có trung bình một vị trí cắt trong một đoạn trình tự có kích thước khoảng 4 kb (bởi theo nguyên tắc xác suất tại một vị trí nhất định xác suất để có một loại nucleotit nhất định là 1/4, vì vậy xác suất để có một trình tự nhất định gồm 6 bp sẽ là 1/46 = 1/4096). Giả sử có một phân tử ADN mạch thẳng có 6 vị trí cắt của enzym EcoRI. Việc cắt phân tử ADN này bằng EcoRI sẽ cho ra 7 phân đoạn ADN khác nhau. Do đó, khi điện di trên gel sản phẩm cắt, 7 phân đoạn ADN sẽ phân tách nhau ra do chúng khác nhau về khối lượng (vì chúng khác nhau về thành phần và trình tự các nucleotit). Như vậy, một phân đoạn ADN sẽ tương ứng với một vùng của phân tử ADN ban đầu. Việc sử dụng một enzym giới hạn khác, chẳng hạn HindIII cũng có trình tự giới hạn gồm 6 bp, nhưng có trình tự giới hạn thay đổi (5’-AAGCTT- 3’) sẽ cho ra các sản phẩm cắt khác với khi sử dụng EcoRI (với cùng phân tử ADN ban đầu). Như vậy, việc sử dụng đồng thời nhiều enzym giới hạn sẽ tạo ra một kiểu hình phổ điện di các phân đoạn cắt giới hạn đặc thù đối với từng gen phân tích. Đối với một số enzym giới hạn khác, chẳng hạn như Sau3A1 (tìm thấy ở vi khuẩn Staphylococcus aureus) có trình tự giới hạn ngắn hơn (5’- GATC-3’), nên tần số cắt của chúng thường cao hơn các enzym có trình tự giới hạn dài. Theo xác suất, Sau3A1 có trung bình 1 vị trí cắt trong một đoạn trình tự khoảng 250 bp (1/44 = 1/256). Ngược lại, enzym NotI có trình tự giới hạn dài (5’-GCGGCCGC-3’) trung bình cứ một đoạn trình tự dài khoảng 65 kb, mới có 1 vị trí cắt (1/48 = 1/65536). Các enzym giới hạn không chỉ khác nhau về trình tự giới hạn và độ dài đoạn trình tự giới hạn đặc trưng của chúng, mà chúng còn khác nhau về cách “cắt” phân tử ADN. Chẳng hạn như enzym HpaI tạo ra các phân tử ADN dạng đầu bằng (đầu tù), còn các enzym RcoRI, HindIII và PsIt cắt phân tử ADN tạo ra các phân đoạn có đầu dính. Sở dĩ gọi là “đầu dính” bởi phần các trình tự ở hai đầu sau khi được enzym cắt ra bổ trợ với nhau theo nguyên tắc Chargaff và vì vậy chúng có xu hướng “dính” trở lại với nhau, hoặc với các phân tử ADN được cắt bởi cùng một loại enzym giới hạn. Tính chất này được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ ADN tái tổ hợp và các kỹ thuật tách dòng phân tử. RNA vận chuyển Mỗi tRNA gắn với một phân tử amino acid, mang đến ribosome để tham gia tổng hợp protein. Mỗi tRNA đặc hiệu cho một loại amino acid. Có hơn 20 loại tRNA khác nhau tương ứng với hơn 20 loại amino acid. Trong thực tế, người ta thấy số lượng tRNA lớn hơn rất nhiều so với số lượng amino acid vì một amino acid có nhiều bộ ba mã hóa. Đồng thời cùng một bộ ba mã hóa, vẫn có thể có nhiều tRNA do hiện tượng biến đổi của các nucleotide trong tRNA tạo nên các loại tRNA mới và trong quá trình tổng hợp tRNA, sau khi hình thành chuỗi polynucleotide còn chịu sự tác động của các yếu tố của môi trường nội và ngoại bào làm các nucleotide bị biến đổi, tạo ra các tRNA mới. Các tRNA cùng tham gia vận chuyển một acid amin là các izoaceptor. Số lượng izoaceptor thay đổi tùy acid amin. Cấu trúc bậc I của tRNA: tRNA vận chuyển có phân tử lượng nhỏ: 25.000-30.000, gồm 75-90 nucleotide, có hằng số lắng 4S. Trong thành phần cấu trúc của tRNA có khoảng 10% các nucleotide hiếm với khoảng 30 loại khác nhau. Mọi cấu trúc của tRNA đều có 2 đầu 5' và 3' giống nhau: đầu 5' luôn chứa G với gốc P tự do, còn đầu 3' luôn có 3 nucleotide là CCA 3'-OH. Nhóm 3'-OH của A có thể liên kết với acid amin để tạo phức hợp tRNA-aminoacyl. Chuỗi polynucleotide cuộn lại có những đoạn tạo mạch xoắn kép, hình thành cấu trúc bậc hai của tRNA. Hình 1.13 Cấu trúc của tRNA Enzyme aminoacyl tRNA synthetase gắn amino acid với tRNA tương ứng. Mỗi enzyme đặc hiệu cho một loại amino acid riêng biệt và xúc tác phản ứng gắn với tRNA của nó nhờ năng lượng ATP tạo ra aminoacyl tRNA. Phức hợp aminoacyl tRNA đến ribosome gắn với mRNA bằng nhờ các bộ ba đối mã (anticodon) trên tRNA bắt cặp bổ sung với các bộ ba mã hóa (codon) trên mRNA. Các tRNA có một số đặc tính cấu trúc chung: chiều dài khoảng 73- 93 nucleotide, cấu trúc gồm một mach cuộn lại như hình lá chẻ ba nhờ bắt cặp bên trong phân tử. Đầu mút 3’ có trình tự kết thúc là CCA, amino acid luôn gắn vào đầu này. Đầu 5 chứa gốc phosphate của G. Mỗi tRNA có có 4-5 vùng với chức năng khác nhau: - Vòng DHU: có chứa nucleotide dihydrouridin, vùng này có chức năng nhận biết aminoacyl tRNA synthetase - Vòng anticodon: đọc mã trên mRNA theo nguyên tắc kết cặp anticodon – codon. - Vòng phụ: có thể không có ở một số RNA. - Vòng TφC: có chứa nucleotide pseudouridin, vùng này có chức năng nhận biết ribosom để vào đúng vị trí tiếp nhận aminoacyl tRNA (vị trí A) - Đấu 3’ –CCA: vị trí gắn với acid amin. tRNA chiểm khoảng 15% tổng số RNA của tế bào RNA riboxom rRNA cùng với protein cấu tạo nên ribosome. rRNA chiếm tỷ lệ cao trong tế bào có thể đến 75% của tổng RNA. Ở các ribosome khác nhau có các rRNA khác nhau, chúng được đặc trưng bởi hằng số lắng S: - Eukaryote : ribosome có hệ số lắng khi ly tâm là 80S, gồm hai đơn vị: + Đơn vị lớn ( 60S) có rRNA 28S; 5,8S; 5S + Đơn vị nhỏ (40S) có rRNA 18S - Prokaryote và lục lạp, ty thể có hệ số lắng khi ly tâm là 70S, gồm 2 + Đơn vị lớn (50S): có loại rRNA 23S; 5S + Đơn vị nhỏ (30S): có rRNA 16S RNA ribosom có cấu trúc bậc I (mạch thẳng) và cấu trúc bậc hai. Trong ribosome, các rRNA tồn tại ở dạng cấu trúc bậc hai. RNA ribosom có cấu tạo là một sợi xoắn có nhiều vùng liên kết đôi theo nguyên tắc bổ sung A liên kết với U, G liên kết với X và có khi G liên kết với U. Trong tế bào rRNA chiếm tỷ lệ cao có thể lên đến 75-80% tổng số RNA Điều hòa hoạt động gene ở prokaryote Ở vi khuẩn và phage, hoạt tính đóng mở gene thường được điều khiển qua phiên mã tổng hợp các mRNA xảy ra khi sản phẩm của gene được cần đến. Cơ chế phân tử cho mỗi mô hình điều hòa hoàn toàn khác nhau, nhưng thường theo một trong hai kiểu chính: điều hòa âm tính và điều hòa dương tính. Trong hệ thống điều hòa âm tính một protei ức chế có mặt trong tế bào, ngăn cản sự phiên mã. Trong hệ thống cảm ứng được điều hòa âm tính, protein ức chế hoạt động làm ngăn cản phiên mã. Nhân tố cảm ứng kìm hãm chất ức chế, cho phép bắt đầu phiên mã. Trong hệ thống ức chế, protein aporepressor gắn với co-repressor tạo ra chất ức chế có hoạt tính, làm ngăn cản phiên mã. Ngược lại trong hệ thống điều hòa dương tính (Hình 11.1B), sự tổng hợp mRNA xảy ra nều protein điều hòa gắn vào một vùng của gene làm hoạt hóa phiên mã. Những protein này được xem là những nhân tố hoạt hóa phiên mã. Điều hòa âm tính và dương tính không loại trừ lẫn nhau. Một vài hệ thống là cả điều hòa âm tính và dương tính, sử dụng cả 2 hệ thống điều hòa để phản ứng với các điều kiện khác nhau trong tế bào. Điều hòa âm tính là phổ biến cho prokaryote, trong khi điều hòa dương tính lại phổ biến cho eukaryote. 1. Cấu trúc của operon Mô hình operon của điều hòa phiên mã Cơ chế điều hòa di truyền của hệ thống lac(lac system) được giải thích bằng mô hình operon của Francois Jacob và Jacque Monod (1960) Hệ thống sử dụng lactose gồm 2 loại thành phần: gene cấu trúc mã hóa protein cần thiết cho sự vận chuyển và chuyển hóa lactose và các yếu tố điều hòa (gene ức chế lacI, promotor lac P và operator lacO). Sản phẩm gene cấu trúc được mã hóa bởi một phân tử mRNA đa gene (polycistronic). Gene Z mã hóa cho enzyme b- galactosidase (thủy phân đường lactose thành galactose và glucose), gene Y mã hóa cho enzyme permease (cần cho vận chuyển lactose qua màng), gene A mã hóa cho enzyme transacetylase (vai trò chuyển hóa lactose chưa rõ). Đột biến promotor (lacP-) làm mất khả năng tổng hợp mRNA. Sản phẩm của gene lacIlà chất ức chế, nó bám vào trình tự các base của DNA cấu tạo operator. Chất ức chế bám vào operator, ngăn cản sự khởi đầu phiên mã mRNA nhờ RNA polymerase. Chất cảm ứng (lactose) kích thích sự sinh tổng hợp mRNA bằng cách kết hợp và làm bất hoạt chất ức chế. Sự có mặt của chất cảm ứng làm chất ức chế không gắn vào operator, promotor cho phép khởi đầu tổng hợp mRNA. Khi môi trường có lactose, lactose được chuyển vào tế bào nhờ permease. Khi vào trong tế bào một số lactose (liên kết b -1,4) được chuyển thành allolactose (liên kết b-1,6) nhờ b-galactosidase. Allolactose là chất cảm ứng, nó gắn vào protein kìm hãm, gây biến đổi cấu hình tạo phức hợp allolactose-repressor. Phức hợp này mất khả năng gắn vào operator. Lúc này operon mở ra, RNA polymerase bắt đầu phiên mã từ gene cấu trúc. Khi môi trường không có lactose, protein ức chế có hoạt tính gắn vào operator, làm sự phiên mã của tất cả các gene cấu trúc của operon lac bị dừng. Sự điều hòa của operon yêu cầu promotor nằm chồng lên một phần hoặc kề sát bên promotor của gene cấu trúc, vì nó gắn với chất ức chế ngăn cản phiên mã. A Bản đồ của operon lac B. Sơ đồ của operon lac ở trạng thái bị kìm hãm C. Sơ đồ của operon lac ở trạng thái được kích thích . Di truyền phân tử ( phần 18 ) Sử dụng enzym giới hạn trong phân tích ADN Hầu hết các phân tử ADN trong tự nhiên đều lớn hơn nhiều so với kích thước có thể thao tác và phân tích một. trên phân tử ADN (gọi là trình tự giới hạn) ; và 2) cắt bên trong phân tử ADN tại vị trí đặc hiệu (hoặc ngay tại vị trí giới hạn như đối với nhóm enzym giới hạn loại ; hoặc cách vị trí giới hạn. sử dụng EcoRI (với cùng phân tử ADN ban đầu). Như vậy, việc sử dụng đồng thời nhiều enzym giới hạn sẽ tạo ra một kiểu hình phổ điện di các phân đoạn cắt giới hạn đặc thù đối với từng gen phân