Tiến hóa ( phần 17 ) Tiến hóa kiểu nhân ở tế bào nhân chuẩn Qúa trình phân hóa di truyền có thể biểu hiện ở các mức độ khác nhau trong qúa trình tiến hóa. Đa hình di truyền biểu hiện ở đa hình thể nhiễm sắc phổ biến trong các quần thể tự nhiên. Baimai cho rằng sự thay đổi di truyền luôn luôn phát hiện ở mức độ thể nhiễm sắc bao gồm tái cấu trúc thể nhiễm sắc (chromosomal rearrangement) và sự phân hóa của vùng dị nhiễm sắc có liên quan đến hàm lượng ADN thông qua sự thay đổi về trật tự phân bố cũng như số lượng của các khối dị nhiễm sắc nằm trên thể nhiễm sắc đó. Sự tiến hóa kiểu nhân của các cơ thể sinh sản hữu tính theo phương thức này đã thu hút sự chú ý của nhiều chuyên gia trong lĩnh vực di truyền học tiến hóa. Các nghiên cứu cho thấy sự khác biệt kiểu nhân cũng được tìm thấy trong bộ côn trùng hai cánh mà đối tượng là Drosophila và các loài muỗi Anopheles. Hơn 500 loài và phân loài (subspecies) thuộc chi Drosophilađã được nghiên cứu về thể nhiễm sắc nguyên phân (mitotic chromosome) và thể nhiễm sắc khổng lồ (polytene chromosome) đã cho thấy những bức tranh thật phong phú về sự đa hình thể nhiễm sắc, dẫn đến việc khám phá ra nhiều loài đồng hình tồn tại trong quần thể tự nhiên của hơn 100 loài muỗi trong tổng số 200 loài muỗi được nghiên cứu kỹ kiểu nhân. Các tác giả đã mô tả hàng loạt các đa hình thể nhiễm sắc bên trong loài (intraspecific polymorphism) và sự khác biệt kiểu nhân giữa các loài (interpecific karyotypic differences). Sở dĩ các loài Anophelesđược đặc biệt chú ý do nhiều nguyên nhân mà một trong những nguyên nhân phải kể đến là tầm quan trọng của chúng đối với y tế cộng đồng và tính khả thi của vấn đề nghiên cứu được các tác giả nêu rõ: - Số lượng thể nhiễm sắc lưỡng bội ở các loài muỗi ít (2n=6) là một thuận lợi dễ thâu tóm được các đặc điểm trong qúa trình phân loại. - Số lượng 2n=6 luôn luôn cố định. Trên thực tế nhìn chung người ta chưa phát hiện ra hiện tượng đa bội thể ở các loài thuộc chi Anopheles,tuy nhiên như Belcheva và Baimai cho biết có một vài trường hợp ngoại lệ về hiện tượng thể nhiễm sắc bổ sung được tìm thấy ở loài An. maculipennis và An. messae hay ở loài An. indefinitus ở Đông Nam Á. - Các thể nhiễm sắc thường (autosomal chromosome) ở các loài Anophelescó nhiều đặc điểm giống nhau và thường bắt đôi soma tạo thành 2 cặp thể nhiễm sắc loại tâm giữa (metacentric) và tâm cận giữa (submetacentric). Hai thể nhiễm sắc giới tính đồng hình (XX) ở con cái (homomorphism) và dị hình (XY) ở con đực (heteromorphism). - Nét đặc trưng khá nổi bật ở kiểu nhân của các loài muỗi Anopheleslà khối lượng cũng như vị trí phân bố riêng biệt của các vùng dị nhiễm sắc được xác định rõ trên thể nhiễm sắc nguyên phân và các băng dị nhiễm sắc đặc thù trên thể nhiễm sắc khổng lồ là các dấu hiệu đáng lưu ý để sử dụng cho nghiên cứu về di truyền và phân loại. Việc phát hiện ra những đặc điểm khác nhau về kiểu nhân thông qua tái cấu trúc thể nhiễm sắc và các biến dị về số lượng của các khối dị nhiễm sắc cũng như sự phân bố của chúng đã giúp ích cho việc nghiên cứu về phân loại và mối quan hệ tiến hóa của nhiều nhóm côn trùng và đặc biệt là các loài thuộc chi Anopheles. Đa hình thể nhiễm sắc và các biến dị trong loài Tính biến dị trong loài thể hiện ở sự thay đổi về vị trí phân bố cũng như số lượng của các vùng dị nhiễm sắc phổ biến ở tế bào nhân chuẩn. Đặc tính này đã giúp ích rất nhiều cho việc nghiên cứu các loài có quan hệ gần nhau ở cả động vật và thực vật. Hiện tượng này cũng không phải ít gặp ở các loài thuộc chi Drosophila. Rất nhiều công trình nghiên cứu về các biến dị trong loài đã mô tả sự đa hình của các vùng dị nhiễm sắc (heterochromatin polymorphism) ở các loài muỗi Anophelesđã giúp ích rất nhiều trong việc nghiên cứu các loài đồng hình. Anopheles dirusPeyton và Harrison (dirusA) đã được Baimai và cộng sự phát hiện có sự đa hình về thể nhiễm sắc giới tính. Ba dạng (X1, X2, X3) và hai dạng (Y1, Y2) được tác giả phân biệt dựa trên mức độ khác nhau về kích thước và sự phân bố của các vùng dị nhiễm sắc cũng như số lượng của chúng trên thể nhiễm sắc. Một trường hợp nổi bật về đa hình các biến dị thể nhiễm sắc giới tính trong loài thể hiện ở An. dirus(loài B), Baimai và cộng sự đã phát hiện được 9 dạng biến dị thể nhiễm sắc giới tính, trong đó 5 dạng biến dị thuộc thể nhiễm sắc X(X1-X5) và 4 dạng biến dị khác thuộc thể nhiễm sắc Y(Y1-Y4). Phân tích đa hình của thể nhiễm sắc Xtác giả đã chỉ ra dấu hiệu khác nhau về vị trí tâm động để phân biệt đối với thể nhiễm sắc X1 là tâm mút (telocentric), X2, X3, X4 là tâm cận mút (acrocentric) và X5 là tâm lệch (submetacentric). Ba thể nhiễm sắc X2, X3, X4 có thể phân biệt dựa trên mức độ khác nhau về kích thước cũng như đặc điểm vùng dị nhiễm sắc. Ngoài ra Baimai còn cho thấy dạng dị hợp tử X1X2 ít phổ biến trong quần thể tự nhiên khác với dạng dị hợp tử X3X4 lại xuất hiện ở hầu hết các gia đình muỗi được nghiên cứu. Sự khác biệt kiểu nhân giữa loài Anopheles minimus(A & C) và đ a hình thể nhiễm sắc trong loài Bốn dạng thể nhiễm sắc Ycũng được nhận biết trên cơ sở các đặc tính tương tự như đối với thể nhiễm sắc X. Dạng dị hợp tử X3Y4, X4Y2 là dạng phổ biến nhất còn dạng X3Y3 và X4Y4 lại rất hiếm tác giả chỉ phát hiện 2 trường hợp trong tổng số 126 gia đình được phân tích. Nhìn chung các biến dị thể nhiễm sắc giới tính ở kiểu nhân của hai loài An. dirusA và B biểu hiện ở quy mô rộng. Các biến dị này theo xu hướng nhận thêm khối dị nhiễm sắc (trường hợp X2, X3, Y2 ở An. dirusA và X5, Y3, Y4 ở An. dirusB) hoặc mất khối dị nhiễm (trường hợp X1, X3, Y1 ở An. dirusB). Thực tế đã cho thấy tiến hóa kiểu nhân thông qua tái cấu trúc nhận thêm hoặc mất đi khối dị nhiễm sắc là phổ biến cho các loài muỗi ở Phương Đông. Kiểu biến dị trong loài mà biểu hiện ở đa hình của dị nhiễm sắc còn thấy ở các đối tượng khác được các tác giả mô tả rất chi tiết. Phức hợp loài An. gambiaelại có sự đặc trưng về các đa hình dị nhiễm sắc ở thể nhiễm sắc giới tính. Điểm nổi bật về sự đa hình thể nhiễm sắc X các tác giả chỉ tìm thấy ở các quần thể tự nhiên còn ở phòng thí nghiệm thì thể nhiễm sắc X lại là đơn hình đối với cả hai loài An. gambiaevà An. arabiensis. Với phương pháp nhuộm băng huỳnh quang H-33258 các tác giả đã mô tả các dạng thể nhiễm sắc X và Y khác nhau ở cả hai loài An. gambiae và An. arabiensis. Hơn nữa Gatti và cộng sự đã chỉ ra kết quả định tính huỳnh quang phản ánh sự phù hợp của sự khác nhau về hóa tế bào và di truyền tế bào ở cả hai loài trong phức hợp. Rõ ràng các biến dị trong loài giữ vai trò quan trọng trong tiến hóa, tuy nhiên vấn đề sẽ được sáng tỏ hơn khi vai trò sinh lý cuả các chất dị nhiễm sắc được nghiên cứu đầy đủ. Mặc dù vậy, giả thiết về vai trò của các dị nhiễm sắc trong mối quan hệ giữa vectơ và ký sinh trùng truyền cho người thông qua vectơ đó được nhiều các tác giả đặc biệt quan tâm. Phương pháp nhận biết loài Việc nhận biết loài đồng hình bằng biện pháp di truyền tế bào mà cơ sở là thể nhiễm sắc đã được thể hiện rất rõ trong nhiều công trình 10 năm nghiên cứu về phức hợp An. dirusở Thái Lan. Phân tích đa hình thể nhiễm sắc mà cơ sở là đa hình các dị nhiễm sắc (heterochromatic polymorphism), tác giả đã phát hiện được nhiều dạng thể nhiễm sắc giới tính khác nhau. Dựa vào dạng kết hợp của các giao tử (các hợp tử) được tìm thấy trong quần thể tự nhiên, tác giả đã chỉ ra các biến dị bên trong loài hay là sự khác biệt loài. Quan điểm loài sinh học và định nghĩa loài của Mayr mà cơ chế cách ly sinh sản được xem như một tiêu chuẩn để xác định các cá thể thuộc cùng một loài hay thuộc về hai loài đã được các tác giả quán triệt trong suốt qúa trình phân loại. Tuy nhiên, tác giả đã chỉ ra rằng việc áp dụng tiểu chuẩn đó một cách độc lập hay ở dạng kết hợp (với các chỉ tiêu sinh học khác) phải phụ thuộc vào từng trường hợp cụ thể. Trường hợp phổ biến có thể tóm tắt và được trình bày dưới đây. Các cá thể muỗi (cùng vùng phân bố) có các dạng thể nhiễm sắc khác nhau X1 và X2 luôn luôn chỉ tồn tại ở dạng đồng hợp tử (X1X1) (X2X2) mà không bắt gặp các cá thể ở dạng dị hợp tử (X1X2) (qúa trình giao phối không xảy ra) vì vậy chúng thuộc về hai loài khác nhau. Về phương diện di truyền học, hai loài này cùng tồn tại trong tự nhiên rất giống nhau về hình thái nhưng cách ly sinh sản với nhau bởi cơ chế tiền giao phối. Nhưng, cũng các dạng đồng hợp tử trên (X1X1) (X2X2) được tìm thấy ở khác vùng phân bố (qúa trình giao phối không thể thực hiện được) nhưng như vậy không có nghĩa là chúng thuộc về hai loài. Trong trường hợp này phải kết hợp với các chỉ tiêu khác để kiểm tra kết quả. Mức độ hòa hợp di truyền thể hiện ở kết quả của phép lai ở phòng thí nghiệm sẽ cho ra kết quả về sự tồn tại về cơ chế cách ly hậu giao phối đem lại độ chính xác cao hơn trong phân loại. Còn trong trường hợp ngoài các dạng đồng hợp tử (X1X1) (X2X2) còn tìm thấy cả dạng dị hợp tử (X1X2) trong cùng vùng phân bố thì chúng thuộc cùng một loài. Sự có mặt của dị hợp tử chứng tỏ qúa trình giao phối giữa hai loài đã xảy ra. Cơ chế giao phối ngẫu nhiên quyết định sự kết hợp ngẫu nhiên của các giao tử. Vì vậy, tần số các hợp tử các đồng hợp tử (X1X1) (X2X2) và dị hợp tử (X1X2) phải phù hợp với định luật Castle - Hardy - Weinberg (1908) C - H - W: p2X1X1 + 2pq X1X2 + q2X2X2 Ngoài các trường hợp đã được tác giả khái quát và nêu rõ ở trên, trong thực tế các trường hợp ngoại lệ cũng cần lưu ý như việc tìm thấy dạng dị hợp với tỷ lệ không đáng kể hoặc những khó khăn về kỹ thuật trong việc thực hiện phép lai ở phòng thí nghiệm đã không phản ánh được mức độ chính xác của kết quả phân loại. Trong những trường hợp như vậy, phải kết hợp với nhiều các chỉ tiêu khác. Nghiên cứu kiểu nhân ở côn trùng truyền bệnh Áp dụng phương pháp làm tiêu bản thể nhiễm sắc trung kỳ (metaphase chromosome) nguyên phân của Baimai, tiến hành mổ lấy tế bào não bọ gậy (tuổi IV). Các bước cụ thể được tiến hành như sau: Xử lý bọ gậy trong dung dịch Colchicine (catologue number: Colchicine Sigma cat N0 C. 9754) với nồng độ 0,1% (trong 3 - 4 giờ) ở nhiệt độ phòng. Sau khi xử lý, bọ gậy được vớt ra, chuyển vào dung dịch Citrat - Natri 1%, qúa trình mổ lấy não được thực hiện bằng hai kim nhọn, nhỏ, các thao tác được thực hiện dưới kính hiển vi. Thể nhiễm sắc kỳ giữa nguyên phân của bọ gậy muỗi 1. Con đực; 2. Con cái - thuộc Anopheles barbumbrosus;3,4. con đực; 5. Con cái - thuộc Anopheles umbrosus; 6,7. Con đực; 8,9. Con cái thuộc Anopheles letifer Chuyển não (bao gồm hai khối nhỏ, màu trắng) sang dung dịch nhược trương (thời gian nhược trương tuỳ thuộc vào đối tượng). Định hình não trong dung dịch Carnoy (ở một lam kính khác nhờ vào động tác chuyển não rất khéo léo từ dung dịch nhược trương sang dung dịch định hình). Dùng pipet Pasteur bơm hút tế bào não (còn ở dạng hai khối nhỏ màu trắng) nhiều lần cho đến khi huyền dịch tế bào trở nên đồng nhất. Cũng dùng những pipet trên nhỏ huyền dịch tế bào lên lam kính sạch, hơ nóng ở máy sấyvới nhiệt độ 45 độ C (5 - 10 phút). Với thời gian như vậy đủ để tế bào bám dính vào lam kính còn axít axetic dư thừa sẽ tự bay hơi. Như vậy, qúa trình làm tiêu bản thể nhiễm sắc đã được hoàn thành. Có thể áp dụng phương pháp nhuộm tiêu bản thể nhiễm sắc của muỗi như của người. . Tiến hóa ( phần 17 ) Tiến hóa kiểu nhân ở tế bào nhân chuẩn Qúa trình phân hóa di truyền có thể biểu hiện ở các mức độ khác nhau trong qúa trình tiến hóa. Đa hình di truyền biểu hiện ở đa. sắc loại tâm giữa (metacentric) và tâm cận giữa (submetacentric). Hai thể nhiễm sắc giới tính đồng hình (XX) ở con cái (homomorphism) và dị hình (XY) ở con đực (heteromorphism). - Nét đặc. b ) có các dạng thể nhiễm sắc khác nhau X1 và X2 luôn luôn chỉ tồn tại ở dạng đồng hợp tử (X1X 1) (X2X 2) mà không bắt gặp các cá thể ở dạng dị hợp tử (X1X 2) (qúa trình giao phối không xảy ra)