Phân loại vi sinh bằng Sinh Học Phân Tử Vietsciences- Dương Văn Hợp, Nguyễn Lân Dũng 27/02/2007 Những bài cùng tác giả 1. Khái quát về các phương pháp phân loại vi sinh v ật truyền thống: Trước đây công tác phân loại vi sinh vật vẫn dựa căn bản tr ên các đặc tính hình thái, sinh lý và hóa vi sinh vật: nhuộm, hình dạng tế b ào khuẩn lạc, khả năng di động, nhu cầu dinh dư ỡng, khả năng sinh acid trong môi trường cũng như sắc tố tạo thành v.v Các đặc tr ưng này đôi khi cũng bộc lộ những hạn chế do các đặc tính được d ùng cho nhóm vi sinh vật này (Enterobacteriaceae) nhưng l ại không có ý nghĩa đối với nhóm khác (vi khuẩn gram âm - gram negative bacteria). H ạn chế của các phương pháp phân loại truyền thống dẫn đến nhiều trư ờng hợp phải xác định lại tên phân loại của một số vi sinh vật. Từ trư ớc đến nay, đơn vị cơ bản của định tên vi sinh vật là loài, bao g ồm nhóm các cơ thể có mức độ tương đồng cao về các đặc điểm hình thái. Các phương pháp dựa trên các phản ứng sinh hóa: Từ những hạn chế của việc xác định các đặc tính hình thái d ẫn đến nhiều nghiên cứu tập trung vào các phản ứng sinh hóa đặc tr ưng cho các vi sinh vật riêng bi ệt. Sự khác biệt của các phản ứng có ý nghĩa cho phân loại các vi sinh vật. - API20E KIT, nguyên tắc: dựa vào 20 ph ản ứng khác nhau. Nói chung hiện nay có nhiều nơi vẫn dùng kỹ thuật này nhưng nhìn chung k ết quả cũng còn nhiều sai số do nhiều nguyên nhân khác nhau: c ụ thể trong các trường hợp gene quy ết định phản ứng sinh hóa nằm trong plasmid lại bị mất do nhiều nguy ên nhân khác nhau như tuổi tế bào, lượng giống cấy hay thay đổi trong quá tr ình nuôi cấy dẫn đến sai khác và làm sai kết quả. - Phân biệt bằng thực khuẩn thể: Các vi khu ẩn có độ mẫn cảm với thực khuẩn thể khác nhau. Có thực khuẩn thể xâm nhiễm làm tan tế bào ngay l ập tức để sau đó thực khuẩn thể nhân lên thành các hạt trong tế bào ch ủ, trong nhưng lại không làm tan tế bào vi khuẩn và chúng cùng t ồn tại với tế bào vật chủ. Dựa vào sự khác biệt này mà người ta d ùng các thực khuẩn thể khác nhau để phân biệt các đối tư ợng vi khuẩn nghiên cứu. Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số như ợc điểm khó giải quyết là các đ ặc tính mẫn cảm của vi khuẩn với thực khuẩn thể lại thay đổi do điều kiện ngoại cảnh hoặc là vi khu ẩn l ại có mức độ mẫn cảm khác nhau đối với các thực khuẩn thể khác nhau. M ặt khác nữa, thực khuẩn thể rất dễ thay đổi các đặc tính do đó cũng làm thay đổi cơ chế xâm nhiễm v ào vi khuẩn chủ. - Phân biệt theo Typ huyết thanh: Đây là phương pháp được dùng khá lâu nhưng rất hiệu quả v à hiện vẫn đang được sử dụng (ví dụ nhóm vi khuẩn Bt). Nguy ên tắc là dựa vào nhóm quyết định kháng nguyên trên tế bào vi sinh vật (bề mặt tế bào tiên mao hoặc protein vỏ). Ưu th ế của phương pháp này là các kháng huyết thanh được dùng đ ể biệt hóa nhiều chi khác nhau, trong nhiều trường hợp đặc tr ưng cho loài. Nói chung đây là phương pháp khá ổn định nhưng h ạn chế chủ yếu của phương pháp này ở chỗ: yêu c ầu kỹ thuật sản xuất kháng huyết thanh và tiêu chu ẩn hóa phản ứng kháng huyết thanh không đồng nhất tại các phòng thí nghiệm và tính ổn định giữa các lần lặp lại. - Phân biệt bằng loại hoạt chất kháng khu ẩn (Bacteriocin): Bacteriocin bản chất là peptid kháng khu ẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại vi khuẩn khác. Như v ậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có kh ả năng kháng lại chính bacteriocin đó. Bởi vậy có nhiều loại vi khuẩn đã được phân loại dựa vào ki ểu bacteriocin. Kết luận: Có nhiều phương pháp truyền thống đư ợc sử dụng trong nhiều nghiên cứu phân loại nhưng không có phương pháp nào t ỏ ra vạn năng thích hợp cho mọi đối tư ợng vi sinh vật, tính chính xác chỉ có thể đạt được khi kết hợp nhiều phương pháp khác nhau. 2. Cách ti ếp cận phân loại học với kỹ thuật sinh học phân tử: Ngày nay những tiến bộ trong sinh học phân tử đã m ở ra khả sinh vật. Nếu như các phương pháp truyền thống chỉ tập trung tr ên một số đối tượng vi sinh vật thì phương pháp sinh h ọc phân tử có thể áp dụng trên mọi đối tượng vi sinh vật. Nói chung các phương pháp sinh học phân tử tập trung v ào các kỹ thuật chủ yếu là: + Phân tích acid nucleic. + Phân tích protein. + Phân tích lipopolysaccharid. + Hóa phân loại học. Trong phần này chúng tôi t ập trung giới thiệu một số kỹ thuật phân loại liên quan đến acid nucleic. Các phần sau chúng tôi lần lư ợt giới thiệu các phương pháp liên quan đến polysaccharid, lipoprotein v à hóa phân loại. 2.1. Phân tích acid nucleic: Kỹ thuật phân tích acid nucleic liên quan ch ủ yếu đến phân tích kích thước, cấu trúc acid nucleic, mối tương quan về trình t ự acid nucleic thông qua giải trình tự ADN và lai ADN. a. Phân tích ADN plasmid: Phương pháp phân tích ở đây bao gồm tách plasmid, so sánh các loại plasmid về kích thước sau đó tinh sạch plasmid và x ử lý bằng enzym cắt hạn chế, sau đó điện di trên gel agarose và so sánh s ự đa hình của các mảnh cắt để phân biệt các chủng vi sinh vật với nhau. Plasmid vòng Streptomyces và Borrelia Plasmid là nhân tố di truyền ngoài nhân và sao chép đ ộc lập với Tuy nhiên, có nhiều trường hợp ngoại lệ là s ợi kép ADN mạch thẳng (đối với vi khuẩn Borrelia và Streptomyces). Plasmid được tìm th ấy hầu hết ở các vi khuẩn và m ột số ít các vi sinh vật nhân thực bậc thấp như nấm men. + Tách plasmid: Thông thường lượng plasmid có trong tế bào chi ếm < 5% tổng số acid nucleic của tế bào. Như vậy, ta phải thực hiện phép tách plasm id ra khỏi ADN của nhiễm sắc thể. Nói chung có nhiều ph ương pháp tách plasmid từ vi khuẩn nhưng nguyên tắc chung là phá tế bào vi khu ẩn dùng enzym, siêu âm hay trong dung dịch kiềm có chất tẩy rửa l à SDS hoặc TritonX-100, sau đó là việc loại ADN của nhiễm sắc thể v à protein. Thông thường dùng phương pháp kết tủa với axetat. Lúc n ày phần lớn các thành phần ADN nhiễm sắc thể và protein của tế bào đ ã bị kết tủa bị loại bằng li tâm và plasmid nằm trong dịch trên tủa đư ợc tách khi kết tủa với ethanol hay isoprop anol. Đây là phương pháp có hiệu quả để tách plasmid, trên th ực tế hiệu quả tách các plasmid có kích thước nhỏ cao hơn nhiều so với các plasmid có kích thư ớc lớn (>100 Kb). Với các plasmid có kích thư ớc lớn cần các thao tác nhẹ nhàng để tránh đứt gãy do các nguyên nhân cơ h ọc. Với cách tách plasmid như trên thì sản phẩm thu đư ợc có lẫn các đoạn ADN có kích thước khoảng 500 bp và nhiễm ARN. Để tránh nhiễm ARN thì c ần xử lý với RNase (ribonuclease A). Tuy nhiên, có thể tách theo các ph ương pháp như: - Tách bằng Caeseium chloride. - Tách bằng KIT QIAGENE. - Tách bằng kỹ thuật khác. + Điện di plasmid trên gel agarose: Sau khi thu được plasmid thì phải tiến hành kiểm tra trư ớc khi phân tích kết quả điện di trên gel agarose để biết phổ plasmid v à kích thước của chúng. Khi tiến hành điện di thì nồng độ gel khoảng 0.7- 1% v ới một trong các đệm sau: TAE (40 mM Tris acetat 1mM EDTA, pH 8.0), TBE (89 mM Tris borat 89 mM boric acid, 2 mM EDTA, pH 8.0) và TPE (80 mM Tris- phosphats 2 mM EDTA, pH 8.0). Sau khi đi ện di, gel được nhuộm với ethidium bromide và phát hiện dư ới tia UV (310 nm). Nồng độ ethidium bromide khoảng 5 mg/l và thời gian nhuộm l à 10 phút. Sau đó được rửa một lần nhanh bằng nước loại ion trư ớc khi được nhìn dưới UV và chụp ảnh làm tài liệu. Một số vấn đề cần lưu ý khi phân tích plasmid: trên gel thông thường plasmid được thấy ở 3 dạng: dạng siêu xoắn, dạng đứt g ãy và dạng mạch thẳng khi bị cắt bởi endonuclease. D ạng di chuyển tốc độ cao hơn là siêu xoắn (Hình 1.1). Hình 1.1. Di chuyển của plasmid mạch thẳng (L) và siêu xo ắn (OC) khi điện di Đôi khi việc tách plasmid cũng phức tạp đặc biệt trong nh ững trường hợp plasmid có kích thư ớc nhỏ có lẫn các mảnh ADN của nhiễm sắc thể. Trong mọi trường hợp đều có nhiễm các RNA và chúng di đ ộng nhanh nhất trừ các trường hợp plasmid như vậy không đư ợc nhầm lẫn giữa plasmid siêu xoắn và dạng chính plasmid đứ t gãy và plasmid khác. Một chú ý khác là tránh nhầm lẫn khi so sánh kích thư ớc giữa các plasmid siêu xoắn và dạng duỗi xoắn hay mạch thẳng. Thực tế l à chỉ có thể so sánh các plasmid siêu soắn với nhau về kích thước. Khi tiến hành phân biệt giữa các chủng vi khuẩn thì đương nhiên là chỉ có thể thực hiện so sánh giữa các chủng cùng có plasmid v ới nhau. Cũng nên chú ý là không ph ải các chủng đều giống nhau về đặc tính miễn dịch nếu có chung kết quả phân tích plasmid nh ư nhau. Phép phân tích sẽ có hiệu qu ả trong các mẫu có nhiều loại plasmid, tuy nhiên c ũng phải tính đến việc các plasmid cũng có thể bị mất trong quá trình bảo quản. + K ỹ thuật dấu vân tay (finger printing) phân tích plasmid với enzym cắt hạn chế: Cho đến nay, người ta đã tìm thấy hơn 400 enzym c ắt hạn chế. Mục đích của kỹ thuật này b ổ sung cho kỹ thuật so sánh phổ kích thước plasmid ở trên. Tức là người ta có thể phân biệt đư ợc sự khác nhau của các plasmid có cùng kích thước. Như v ậy, khi xử lý plasmid với một hay kết hợp một số enzym cắt hạn chế thì kết quả sẽ thu đư ợc là các đoạn ADN được cắt có kích thước khác nhau. Kết quả này có đ ộ lặp lại cao, do đó dễ sử dụng khi so sánh các mẫu khác nhau. Hiện nay, có nhiều enzym cắt hạn chế được sản xuất và tiêu th ụ trên thị trường, các enzym này có điểm nhận biết thay đổi từ 4-6 c ặp nucleotid. Thông thường xử lý enzym trong 1 giờ sau đó mẫu đư ợc phát hiện trên gel agarose hoặc polyacrylamid Tuỳ thuộc v ào kích thước của các mảnh cắt mà sử dụng agarose có nồng độ khác nhau: Bảng 1.1. Nồng độ agarose và kích thước mẫu ADN tương ứng. Nồng độ agarose (%) Kích thước ADN (kb) 0.3 1-7 0.5 0.7-45 0.8 0.4-20 1.0 0.3-10 1.2 0.2-8 1.5 0.2-6 2.0 0.1-5 Theo kinh nghiệm của nhiều tác giả (Grimont-1991) ph ổ các băng ADN có ý nghĩa cho so sánh không nên dưới 10 băng v à nên có cả băng kích thước nhỏ và kích thước lớn. Tuy nhiên, các băng l ớn không nên vượt quá 10 do băng có kích thước lớn như v ậy khó di chuyển trên gel. Trong các trường hợp so sánh th ì nên dùng thang chuẩn ADN để so sánh kích thước và phép phân tích d ấu vân tay cho các lần phân tích khác nhau. Như đã trình bày ở trên, nếu nh ư phân tích các chủng vi sinh vật dựa vào kích thư ớc plasmid có ý nghĩa đối với các đối tượng có nhiều plasmid thì phương pháp xử lý enzym c ắt hạn chế lại có ý nghĩa lớn trong các trường hợp nghiên c ứu dịch tễ học trên các chủng có cùng phổ plasmid hay plasmid có kích thư ớc giống E.coli (0157: H7) gây bệnh từ thực phẩm (Hamburger). Các plasmid t ừ các chủng khác nhau thì có ph ổ khác nhau về các đặc điểm cắt bởi enzym cắt hạn chế. Kết quả tạo ra các mảnh ADN đặc trưng cho cá th ể làm cơ sở cho phép so sánh. Tuy nhiên khó có th ể so sánh kết quả thu được từ các phòng thí nghiệm khác nhau, sở dĩ như vậy l à do không dùng cùng một loại enzym cắt hạn chế. Một lý do nữa cũng cần đư ợc đề cập đến là sự xuất hiện các đột biến ngẫu nhiên t ại vị trí enzym cắt, kết quả này tạo ra sự khác biệt về phổ thu được từ các mảnh cắt. b. Phân tích ADN nhiễm sắc thể: Phương pháp phân tích ở đây bao gồm việc tách ADN của nhiễm sắc thể và c ắt bằng enzym cắt hạn chế để phân biệt giữa các vi sinh v ật với nhau. Một chú ý khi tách ADN nhiễm sắc thể phải thao tác nhẹ nhàng để tránh đứt gãy do nguyên nhân cơ h ọc. Nói chung các mảnh cắt nên có kích thước nhỏ hơn ho ặc bằng 50 kb. Việc tách các mảnh cắt đó được thực hiện dựa vào kỹ thuật điện di trong trư ờng xung điện (PFGE = Pulsed Field Gel Electrophoresis ).style="text-align: justify; margin- top: 6.0pt"> Như v ậy kỹ thuật dấu vân tay không chỉ áp dụng trong trường hợp trên tế bào mang plasmid mà kỹ thuật này còn đư ợc sử dụng với nhiễm sắc thể cho mọi trường hợp.rường hợp.ư ờng hợp.ường hợp. Liên quan đến vấn đề này phải kể đến k ỹ thuật BRENDA: phân tích k ết quả xử lý enzym cắt hạn chế với vi sinh vật. Ở đây cách chọn loại enzym cắt hạn chế vô cùng quan trọng, theo cách chọn này có th ể tạo ra quá nhiều mảnh cắt nên không thể phân biệt đư ợc các băng riêng rẽ trong khi đó đối với các trư ờng hợp khác lại tạo ra quá ít mảnh cắt có kích thư ớc lớn khó tách theo các kỹ thuật điện di hiện có. Các vi sinh vật khác nhau có tỷ lệ GC khác nhau (dao động từ 25- 75%) các mảnh cắt thu đư ợc sau khi xử lý enzym cắt hạn chế rất khác nhau. Theo Nei M. và Li W. H. (1979) thì số mảnh cắt có thể thu đư ợc tính trên lý thuyết là: a = (g/2) r1 x {1-(g/2)} r2 Trong đó: g - tỷ lệ GC của ADN r1 - số cặp GC r2 - số cặp AT trong vị trí c ắt của enzym giới hạn sử dụng a - s ố vị trí cắt khi sử dụng enzym cắt hạn chế. Mặt khác, người ta cũng căn cứ vào kết quả nghiên c ứu các vị trí cắt của bộ gene vi sinh vật làm cơ s ở cho cách chọn enzym cắt. Thông thường cho mỗi phép phân tích người ta ghi đư ợc số các băng cắt bởi enzym và tính toán kích thước các mảnh tạo thành làm cơ s ở cho các phép phân tích về sau. Tuy nhiên, một trong những nguyên nhân h ạn chế cho phép phân tích trên là các phương pháp tách ADN th ông thường đều dẫn đến thay đổi kích thước do đứt gãy ADN nhi ễm sắc th ể, mặt khác sự có mặt của plasmid lẫn cũng tạo ra sự khác biệt giả trong kết quả phân tích, để khắc phục nhược điểm trên ngư ời ta phải thực hiện phép phân tích ADN nhiễm sắc thể nguyên v ẹn để phát hiện các nguồn ADN tạp nhiễm lẫn vào kết quả phân tích. + Kỹ thuật điện di trong trư ờng xung điện (điện di trong trường điện thay đổi, PFGE) - Nguyên tắc: Trước tiên các mẫu đưa vào phân tích phải đư ợc xử lý trước bằng loại enzym cắt hạn chế mà có r ất ít điểm cắt. Kết quả phải tạo ra được các mảnh có kích thước lớn (50 kb – 12 Mb), v ới kích thước này không thể điện di theo phương pháp thông thường mà ch ỉ có thể tách ra bằng kỹ thuật PFGE (ật PFGE (ật PFGE (uật PFGE (Pulsed- Field Gel Electrophoresis ). Kỹ thuật PFGE lần đầu tiên đư ợc Schwartz va Cantor (1984) giới thiệu. Tuy nhiên sau đó đã có nhi ều tác giả mô tả lại kỹ thuật này, tuy có sai khác ít nhiều nhưng cơ s ở lý thuyết của các phương pháp này là như nhau: Mục đích của kỹ thuật n ày là tăng khả năng di động của các mảnh ADN có kích thư ớc lớn trong điện trường, do đó các thành phần gel và đệm hầu như không thay đ ổi theo các phương pháp điện di thông thường. Tuy nhi ên theo phương pháp thông thường thì sự điện di liên quan đến s ự di động của các mảnh ADN có kích thước khác nhau trên gel agarose trong một trư ờng điện không đổi. Kết quả ở đây là phân tử lớn khó di động hơn phân t ử nhỏ qua mắt xích agarose, tạo ra sự tách biệt trong trư ờng điện di. Trong trường hợp PFGE lực làm thay đổi khả năng di động lại là trư ờng điện tích thay đổi liên tục dẫn đến các mảnh ADN có kích thư ớc khác nhau thay đổi hướng di động. Như vậy kết quả là các mảnh có kích thư ớc khác nhau sẽ có khả năng di động khác nhau. Kích thước càng lớn th ì mức độ di động càng ch ậm. Sự di động khác nhau của ADN chủ yếu phụ thuộc vào kích thước chứ không phải do gel agarose như ở ph ương pháp điện di thông thường, hình 1.2. Hình 1.2. Sử dụng kỹ thuật PFGE phân tích nhiễm sắc thể sau khi xử lý với Sma I với 7 chủng Haemophilus ìnluenzae. Tiếp theo các mô tả của Schwartz va Cantor, Smith v à Codemine (1990) đã đ ề cập đến sự di chuyển của các mảnh ADN khác nhau là hàm số tuyến tính với kích thước của chúng. Trên cơ s ở đó có thể điều chỉnh các xung điện và điện trường. Tuy nhiên các nhân t ố khác cũng có mối tương tác lẫn nhau và ảnh hư ởng đến khả năng di động của ADN như: nhiệt độ, điện thế, nồng độ agarose cũ ng như nồng độ ion trong đệm. - Chu ẩn bị ADN cho PFGE: Chuẩn bị ADN từ nhiễm sắc thể không giống như các phương pháp chuẩn bị ADN plasmid. Một vấn đề thư ờng xảy ra là sự đứt gãy ngẫu nhiên ADN d ẫn đến sai khác trong kết quả phân tích. Để hạn chế điều này ngư ời ta phải thực hiện kỹ thuật tách ADN NST khỏi tế bào mẫu agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp – LMT (Schwartz va Cantor – 1984 và Smith, Klco 1988). Theo phương pháp này hỗn dịch tế bào (dịch nuôi cấy hoặc dịch huyền phù) đư ợc trộn với LMT agarose tại 37 o C. Hỗn dịch đầu tiên được xử lý với enzym và ch ất tẩy rửa để tách ADN NST khỏi thành, màng tế b ào, RNA và protein. Sau đó là xử lý với EDTA, bất hoạt nuclease tế bào với proteinase K v à N-lauroylsarcosine để loại các thành phần khác của tế bào. Kết quả là phần LMT agarose có chứa ADN NST được dùng làm mẫu chạy gel 0.5- 1.0% (nên làm tan ở 65 o C) và đưa lên mẫu chạy gel PFGE, tài li ệu của Smith (1988) mô tả chi tiết cách chuẩn bị mẫu từ các tế b ào có và không có thành tế bào: vi khuẩn, nấm men, nấm sợi, tế bào th ực vật và động vật. Nói chung với các trường hợp có thành tế bào thì c ần đến enzym phá thành tế bào. Lượng ADN NST thư ờng dao động trong [...]... tượng vi sinh vật Nguồn ADN đích đôi khi chỉ có số lượng ít trừ khi các tiến hành nuôi cấy vi sinh vật Trong một số trường hợp vi c nuôi cấy không thể thực hiện được với nhiều loài vi sinh vật hay virút hoặc trong các trường hợp khác cần thời gian dài nuôi cấy vi sinh vật để có đủ ADN cho các kỹ thuật lai hay định typ Khó khăn này được khắc phục bằng cách làm tăng nguồn ADN đích một cách nhanh chóng bằng. .. tốt cho nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau nhưng năm 1992 Heimberger và cộng sự đã tiến hành phân tích ADN được xử lý với enzym cắt hạn chế trong trường xung điện (PFGE), kết quả này rất có ý nghĩa cho phép phân tích sâu hơn và phân biệt các chủng vi sinh vật liên quan đến sự bùng phát dịch đối với các chủng vi sinh vật khác Ribotyping và PFGE có chung nguyên tắc dựa vào sự phân bố của các vị trí... để định danh hay xác định vi sinh vật: Lai với vi sinh vật (in situ), lai trong dịch thể và lai với chất mang (solid support) a Kỹ thuật lai với vi sinh vật (in situ), hình 1.4 Hình 1.4 Minh hoạ kỹ thuật lai in situ với kỹ thuật FISH (fluorescence in situ hybridization) phát hiện vi khuẩn Helicobacter pylori Kỹ thuật này được thực hiện để định vị chuỗi acid nucleic trong vi sinh vật sau khi đã được... các tiêu bản hiển vi Tuy nhiên, do hầu hết các vi sinh vật có khả năng thấm (hay cho phép) các đoạn ngắn oligonucleotid đánh dấu đi vào tế bào sau khi cố định mẫu vì vậy khi sử dụng mẫu dò đánh dấu với chất nhuộm huỳnh quang đặc biệt có thể nhìn thấy được trực tiếp vi sinh vật dưới kính hiển vi huỳnh được hàn kín nhằm hạn chế vi c bay hơi của dịch lai Vi c bay hơi dịch lai này dẫn đến vi c bám không đặc... Wahl (1984) Người ta cũng đã sử dụng một số màng nynol, màng nitrocellulose hoạt hoá hay có độ bền cho các phép lai Đối với công vi c định loại vi sinh vật với kỹ thuật cố định trên màng cho phép lai ADN thì cần chấm mẫu (là ADN sạch, hay tế bào vi sinh vật hoặc sinh phẩm có vi sinh vật nghiên cứu) lên màng thích hợp Mẫu được ly giải và ADN bị biến tính, sau đó ADN được cố định trên màng khi đưa vào tủ... phòng thí nghiệm chuẩn đoán vi sinh vật Vi c kết hợp giữa phân tích plasmid với sử dụng enzym cắt hạn chế sẽ tạo được sự phân tích chính xác với các thông tin đáng tin cậy đối với các mẫu phân tích Tuy nhiên, khi phân tích các mẫu dựa trên plasmid thì cần lưu ý là các plasmid có thể bị mất qua các thế hệ phân chia, dẫn đến sai lệch các kết quả nghiên cứu Khi thực hiện phép phân tích PFGE với các plasmid... lai + Chọn mẫu dò: Vi c chọn mẫu dò có ý nghĩa quan trọng cho phép lai Nhìn chung các nhà phân loại học vi sinh vật thường không trực tiếp thiết kế mẫu dò Về mặt này chúng tôi đưa ra một số nội dung chủ yếu về tiêu chí chọn mẫu dò theo Stahl và Amann (1991) như sau: Mẫu dò sẽ lai với ADN đích (target) và không lai với các nguồn ADN khác có mặt trong mẫu lai Khi phân tích các mẫu vi sinh vật với nhau... chất sinh màu khi có mặt enzym (chẳng hạn như Alkaline phosphatase) Lợi thế của phương pháp này là vi c phát hiện đơn giản do kết quả là sự thay đổi màu dễ phát hiện và ứng dụng trong các phòng thí nghiệm vi sinh vật Một phương pháp có thể làm tăng độ nhạy của phản ứng màu bằng cách thêm một enzym kích hoạt phản ứng màu vào hệ thống Một ví dụ cho điều này là vai trò loại nhóm phosphat của phân tử NADP... dịch tễ học vi sinh vật ở mức độ phân tử Tính hợp lý cho vi c sử dụng kỹ thuật này là ở chỗ gene mã hoá cho RNA ribosom có độ bảo thủ cao Cũng có thể phát hiện thấy những thay đổi chút ít trong quá trình tiến hoá đối với các chuỗi ADN trong các vi khuẩn nghiên cứu Gene RNA ribosom được tổ chức thành các operon mà các gene riêng rẽ mã cho các RNA kích thước 5S, 16S và 23S chúng được cách nhau bằng các... nhất là cách chọn enzym cắt hạn chế và loại mẫu dò dùng cho phép lai (Saunder và cộng sự 1991) Tóm tắt: Nhìn chung phương pháp lai ADN chứng tỏ ưu thế của nó như là một kỹ thuật quan trọng cho định typ và nghiên cứu dịch tễ học nhiều loại vi sinh vật khác nhau Về nguyên tắc phương pháp này cũng có ưu điểm và nhược điểm của nó Ưu điểm: - Sử dụng cho nhiều đối tượng vi sinh vật - Có các mẫu dò vạn năng được . Phân loại vi sinh bằng Sinh Học Phân Tử Vietsciences- Dương Văn Hợp, Nguyễn Lân Dũng 27/02/2007 Những bài cùng tác giả 1. Khái quát về các phương pháp phân loại vi sinh v ật. tư ợng vi sinh vật, tính chính xác chỉ có thể đạt được khi kết hợp nhiều phương pháp khác nhau. 2. Cách ti ếp cận phân loại học với kỹ thuật sinh học phân tử: Ngày nay những tiến bộ trong sinh. - Phân biệt bằng loại hoạt chất kháng khu ẩn (Bacteriocin): Bacteriocin bản chất là peptid kháng khu ẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại vi khuẩn khác. Như v ậy, loại vi khuẩn tạo ra loại