Chơng 4 Biến dị Mutation 4.1 Đột biến gen Đột biến (mutation) là sự biến đổi xuất hiện ngẫu nhiên (spontan) hay những thay đổi số lợng và chất lợng rút ra qua thực nghiệm nhờ các gen đột biến (mutagene). Ngời ta phân biệt các dạng đột biến: Đột biến gen (genmutation, đột biến nhiễm sắc thể (chromosommutation), đột biến hệ gen (genommutation), đột biến bào tơng (plasmonmutation) và đột biến bào quan (plastidenmutation). Các tác nhân đột biến (mutagene) là những tác nhân (agent) hóa lý có khả năng khởi phát đột biến gen và đột biến nhiễm sắc thể, và khả năng gia tăng tỷ lệ đột biến ngẫu nhiên (spontane mutation rate). Thuộc vào những tác nhân đột biến hóa học phải kể tới số nhiều các hợp chất có cấu trúc và hiệu quả khác nhau nh nitrite, urethan, foraldehyd, peroxide. Thuộc về những tác nhân đột biên lý học cần nói tới gồm tia ion hóa (tia X, tia tia , tia neutron), ánh sáng tử ngoại, sốc nhiệt độ (ABC Biologie, 1967, tr. 567). Gen đột biến (mutatorgene) là hững gen có thể làm tăng tỷ lệ đột biến các gen khác của hệ gen ở mức độ khác nhau. Cá thể đột biến (mutant) là một cá thể mà kiểu gen (genotyp) của nó ít nhất một vị trí bị biến đổi dẫn đến những sai khác kiểu hình (phenotyp) nhận biết đợc hay đo lờng đợc so với kiểu hình bình thờng. áp lực đột biến là sự gia tăng tần số các allen của gen trong quần thể bắt nguồn từ tỷ lệ đột biến khác nhau của các allen của một gen. Khi tần số các đột biến A sang a lớn hơn là từ a sang A thì tồn tại một áp lực đột biến đối với allen a. Bởi các đột biến có giá trị chọn lọc (selection value) âm nên áp lực chọn lọc có tác dụng chống lại áp lực đột biến [ABC Biologie, 1967, tr. 567]. Tỷ lệ đột biến là thành phần tơng đối những giao tử có đôt. biến gen hoặc đột biến mới xuất hiện trong tổng số giao tử đợc kiểm tra của một thế hệ (generation). Theo Timofeeff-Resovsky, mỗi thế hệ ruồi Drossophila có 2-3% số con là chủ mang mang một hay vài gen đột biến mới. Theo Muller, ở ngời trong mỗi thế hệ có 10-40% tế bào sinh dục là thể mang một đột biến mới xuất hiện [ABC Biologie, 1967, tr. 567]. Tăng nhiệt độ thờng gây tăng tỷ lệ đột biến. Tần số các đột biến gen ngẫu nhiên ở ngô (theo Stadler) Gen Các tính trạng của hạt Tế bào sinh dục đã qua kiểm tra Số đột biến quan sát đợc Tần số đột biến trong 1 triệu tế bào sinh dục R J Pr su Y Sh Wx (nhân tố nền mầu) (nhân tố kìm mầu) Rote Aleuronschicht Zuckerhaltiges Endospenn Gelbes Endosperm Geschrumpftes Kom Wachsartiges Endosperm 554768 265391 647102 1678736 1745280 2469285 1503744 273 28 7 4 4 3 0 492 106 11 2,4 2,2 1,2 0 Trích từ ABC Biologie, 1967, tr. 567 Đơn vị đột biến (muton) là phần tử nhỏ nhất (nucleotid) của vật chất di truyền mà sự biến đổi nó dẫn đến xuất hiện đột biến gen. 4.1.1 Biến dị không di truyền và di truyền Biến dị không di truyền là những khác biệt tính trạng của cá thể không xuất hiện ở những cá thể sau do cá thể đó sinh ra. Nguồn gôc những biến dị này không do đột biến gen hay đột biến nhiễm sắc thể biểu hiện ra. 1 Biến dị di truyền là những tính trạng sai khác trên cá thể so với những cá thể cùng thế hệ và thuộc thế hệ trớc vẫn lặp lại ở những cá thể các thế hệ sạu. Sơ đồ hệ phả của một tính trạng lặn (bệnh gen lặn) Thẹo.W. Harms, 1965, tr. 286 4.1.2 Phân loại đột biến Đột biến gen (genmutation là những biến đổi xuất hiện ngẫu nhiên hoặc gây ra bằng thực nghiệm trong thành phần phân tử của gen; chúng làm biến đổi hàm lợng thông tin di truyền mã hóa hóa học (mã di truyền) và dẫn đến xuất hiện những allen mới. Đột biến nhiễm sắc thể (chromosommutation) là những biến đổi cấu trúc NST xảy ra ngẫu nhiên hoặc nhận đợc qua thí nghiệm dới tác động của gen đột biến dẫn đến đảo lộn đoạn NST nội trong một NST (đột biến NST nội tại: intrachromosomal chromosommutation), giữa các NST khác nhau (đột biến NST trao đổi: interchromosomal chromosommutation) hoặc do mất đoạn NST. Tiền đề cho những đột biến NST là sự hình thành cầu nối giữa các cấu trúc dọc của NST theo học thuyết Bruch-Reunion [ABC Biologie, 1967, tr. 165]. 1: Xuất hiện vết cắt bỏ đoạn NST hoặc sự phục hồi đứt gẫy 2: Xuất hiện 2 dạng chuyển vị chromatid (bất đối xứng và đối xứng) hoặc sự phục hồi đứt gẫy. Theo ABC Biologie, 1967, tr. 165 Đột biến hệ gen (genommutaion) là những biến đổi số lợng nhiễm sắc thể dẫn đến đa bội chỉnh (polyploid: tất cả NST đợc nhân đôi) và đa bội lệch (aneuroploid: chỉ một hay vài NST trong bộ NST đợc nhân đôi trong tế bào). Đột biến kiểu bào tơng (plasmonmutation) là những biến đổi của vật chất di truyền (plasmid = plasmagen) trong bào tơng hoặc ngẫu nhiên hoặc do những gen đột biến. Đột biến kiểu bào tơng có nhiều nội dung khác so với những đột biến của hệ gen. Một trong những khác biệt chính là số lợng đông các phần tử di truyền thuộc bào tơng (plasmid = plasmagen) giống nhau, nh rất nhiều ty thể nh nhau (ở tế bào động vật thực vật), hay nhiều lục lạp (ở ttế bào thực vật). Sự đột biến ở các phần tử di truyền chỉ có thể đợc nhận biết sau sự làm giàu chọn lọc các đơn vị đột biến. Tiền đề cho sự làm giàu kiểu này ìa giá trị chọn lọc dơng của các đơn vị đột biến. Không có gì đáng ngạc nhiên là đột biến kiểu bào tơng rất khó phát hiện. Hơn nữa sự di truyền kiểu bào tơng dựa trên 3 cơ sở chính: (1) Hệ thống di truyền các tính trạng quan sát không tuân theo các định luật Mendel; (2) Những lai ghép thuận nghịch cho kết quả những hậu duệ khác nhau vì bào tơng đợc truyền sang thực ra từ phía giới cái (trứng); (3) do sự phân bố không đều các phần tử bào tơng khác nhau trong quá trình phân bào nên có thể đa đến sự pha trộn vật chất di truyền (plasmagen) trong quá trình phát triển cá thể. 2 4.1.3 Các phơng pháp phát hiện đột biến Những đột biến gen hầu hết đều gây ra biến đổi phân tử phân tử protein đợc biểu hiện thành tính trạng ở những cá thể đột biến của thế hệ sau. Để phát hiện đột biến cần thiết các phơng pháp xác định trình tự nucleotid và xác định trình tự acid amin ở các cá thể thế hệ trớc và thế hệ sau. Các phơng pháp xác định trình tự nucleotid Phơng pháp hóa học Maxam-Gilbert Trớc hết đánh dấu phân tử ADN sợi kép tại đầu 5 , rồi dùng nhiệt phân tách thành các sợi đơn. Sau đó xử lý hóa chất phá hủy nucleotid (ví dụ nu-A). Kết qua đợc hàng loạt đoạn ADN kích thớc khác nhau. Các đoạn này đợc phân ly trên gen polyacrylamid và chỉ những đoạn có gắn chất phát màu mới đợc phát hiện trên phim (do nhuộm màu phim). Xác định trình tự nucleotid bằng phơng pháp Maxam-Gilbert -tiến hành 4 phản ứng độc lập dùng 4 hóa chất khác nhau -Chạy điện di đồng thời sản phẩm trên 4 vị trí phân biệt của màng acrylamide Đọc trình tự các đoạn nucleotid từ 5 lên 3 Phơng pháp men Sanger (tạo đầu tận của chuỗi: chain terminator method) Sử dụng dideoxynucleotid không có OH ở vị trí 3 trong phản ứng tổng hợp ADN. Do đó khi men ADN polymerase gắn chúng vào sợi ADN thì vì thế quá trình tổng hợp bị dừng lại. Vì vậy còn gọi là phơng pháp dideoxy (dideoxy method). 3 Đầu tiên sợi đúp ADN (cần đọc trình tự nuc leotid) biến tính bởi nhiệt thành hai sợi đơn và đợc lai với mồi (ddA-TP, ddT-TP.ddC-TP hay ddG-TP = dideoxy A-, T-, C- hay G-triphosphat) có sự tham gia của men ADN-polymerase. Mỗi phản ứng gồm (sợi khuôn ADN, mồi, men, 1 loại ddN-TP) và 4 loại dN-TP theo tỷ lệ 1/100. Sản phẩm của 4 phản ứng độc lập đợc đồng thời điện di trên gel polyacrylamid tại 4 vị trí khác nhau. Các vạch ADN quan sát đợc nhờ có gắn P 32 vào mồi hoặc vào một trong 4 loại nucleotid (A, T, C và G) bình thờng. Xác định trình tự nucleotid trên máy tự động Trong những năm gần đây đã xuất hiện một số phơng pháp mới xác định trình tự nucleotid bên cạnh phơng pháp thông thờng sử dụng các gel để phân ly các đoạn ADN có độ dài khác nhau vài hoặc chỉ một nucleotid: - Phát hiện huỳnh quang các nucleotid bị đánh dấu - Xác định trình tự ADN bằng khối phổ - Xác định trình tự ADN bằng lai với oligonucleotid nhân tạo - Quan sát bề mặt ADN, phân biệt nucleotid bằng kính hiển vi điện tử - Sử dụng tấm chip gắn các oligonucleotid (phân biệt > 50.000 pt ADN khác nhau). Tơng lai có thể gắn hàng nghìn oligonucleotid lên một chíp nhỏ đa vào phần mềm máy tính. Phơng pháp tạo đầu tận cùng của chuỗi cải tiến cho phép đọc tự động trình tự trên máy (automagic sequencing). Sử dụng các KIT khác nhau, trong đó đầu tận cùng đợc gắn chất phát huỳnh quang (dye terminator sequencing). Phản ứng gắn các nucleotid đánh dấu vào sợi ADN tổng hợp đợc tiến hành trên máy PCR (còn gọi kỹ thuật chuỗi đọc trình tự: cycle sequencing). Sản phẩm từ PCR đợc điện di bằng máy tự động trên gel acrylamid cho phép phân biệt các đoạn ADN hơn kém nhau 1 nucleotid. Kết quả đợc phân tích bằng phần mềm máy tính chuyên dụng. Thông thờng 4 loại nucleotid đợc đánh dấu bằng các chất phát huỳnh quang khác nhau. Đầu đọc laser kích hoạt các chất này khiến chúng hấp thụ và phát màu; mỗi màu ứng với một loại nucleotid và đợc hiển thị bằng một đỉnh đồ thị điện di. Phản ứng gắn nucleotid vào sợi ADN tổng hợp trên sợi khuôn đợc thực hiện trên máy PCR (.). Hai loại nucleotid dG-TP và dT-TP đợc thay thế bởi dI-TP và dU-TP nhằm hạn chế sự trùng lặp đỉnh. Sản phẩm PCR đợc tinh sạch, loại bỏ nucleotid và primer (chất đệm) thừa trớc khi đa vào máy đọc. Các trình tự đọc đợc trên máy tự động thờng dài 600-1000 bp. u điểm của phơng pháp là kết quả đợc đa trực tiếp vào máy tính, giảm bớt lỗi đọc bằng mắt; không đòi hỏi lợng ADN khuôn (dạng sợi kép) nhiều nhng các sợi đơn cần đọc đợc khuyếch đại lên rất nhiều lần. Trong chơng trình nghiên cứu hệ gen (của ngời hay arabidopsis ), hệ gen đợc cắt bởi men giới hạn thành những đoạn lớn có đầu gối lên nhau. Chúng đợc đa vào vector (plasmid hoặc BAC) và đợc lấy ra ngẫu nhiên để xác định trình tự. Số liệu đọc đợc phân tích trên máy để tìm ra các đoạn trùng nhau. Khoảng trống gap bất kỳ giữa các đoạn đã biết đ ợc xác định khi thiết kế primer dựa vào trình tự hai đầu tận cùng của khoảng trống. Trình tự hệ gen, các loại ADN (các đoạn ADN hệ gen, các cADN, các đoạn đích EST expressed sequence tags của cADN ) đ ợc xác định ngày càng 4 nhiều đã thúc đẩy hớng nghiên cứu mới bio.informatic (tin sinh). Ba ngân hàng dữ liệu chính lu giữ hầu hết các thông tin về ADN là EMBL (thuộc viện tin học châu âu European informatic institude ), Genbank (thuộc trung tâm công nghệ sinh học Mỹ US National Centre for Biotechnology) và DDBS (thuộc ngân hàng dữ liệu của nhật DNA DataBase of Japan) Phơng pháp ADN footprint Phát triển dựa trên phơng pháp xác định trình tự, phơng pháp ADN footprint cho phép xác định vị trí protein (protein điều khiển, factor phiên mã ) liên kết với ADN. Thông thờng các đoạn ADN ngoài vùng chứa mã di truyền có protein bám dính giữ vai trò quan trọng (kiểm soát hoạt động của gen). Tại vị trí liên kết có protein bám dính, đoạn ADN này không tạo ra sợi đơn nên không quan sát đợc trên gen (khoảng trống = dấu vết footprint ) trên băng điện di hiển thị vạch mầu. Các phơng pháp xác định trình tự protein Phơng pháp điện di trên thạch polyacrylamid chứa SDS (SDS-PAGE) Điện di trên thạch polyacrylamid: với sự có mặt của sodium dodecylsulfat (SDS) cho phép phân ly các phân tử protein có khối lợng khác nhau. SDS có điện tích âm lớn khi ghép nối vào liên kết peptid tạo phức SDS-protein. Phức này có độ âm điện khác nhau và đi chuyển khác nhau trên thâch polyacrylamid. Nh vậy số lợng SDS tỷ lệ với khối lợng phân tử protein. Kết quả có thể phân lập các protein có khối lợng phân tử khác nhau. Điện di đẳng điện: Mỗi protein có điểm đẳng điện khác nhau nên có thể điện di các mẫu protein trong du7ng dịc đệm có pH biến thiên liên tục. Điện di hai chiều (2-D electrophoresis): Kết hợp hai phơng pháp trên chpo phép phân đoạn, phân lập và xác định khối lợng protein. Sắc ký khối phổ (mass spectrometry): protein đợc bơm vào cột sắc ký chứa đệm dễ bay hơi. Phơng pháp phân tích protein bằng phản ứng kháng nguyên-kháng thể Phản ứng này có tính đặc hiệu cao, dùng để phát hiện và tinh sạch protein. Kháng thể đợc tạo ra khi đa kháng nguyên vào thỏ và đợc tinh sạch từ máu thỏ sau khi nhiễm. Đấy là những kháng thể đa dòng (polyclonal antibody; nhận biết một số kháng nguyên) trong khi kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody) chỉ nhận biết một kháng nguyên nhất định. Kháng thể đợc đánh dấu bằng phóng xạ hoặc chất phát huỳnh quang để phát hiện protein đặc hiệu nhờ kỹ thuật Western blot, immunoblot. Sự phân bố của protein đặc hiệu trong tế bào, tổ chức mô có thể đợc phát hiện nhờ kỹ thuật 5 lai in situ (giống nguyên tắc của Western blot). Ngoài ra kháng thể còn đ ợc dùng để tinh sạch protein đặc hiệu nhờ phản ứng kết tủa miễn dịch hoặc bằng sắc ký ái lực. Kháng thể đánh dấu đợc dùng để đánh giá về số lợng kháng nguyên trong kỹ thuật ELISA (enzymelinked immunosorbent asay) Phơng pháp xác định trình tự acid amin (cấu trúc bậc I của protein Gián tiếp qua phân tích trình tự cADN tơng ứng chuỗi peptid đó. Phơng pháp này thờng không thật chính xác do tính bị thoái hóa của ADN t ơng ứng protein đó. Phơng pháp phân hủy Edman (Edman degradation) cho phép trực tiếp xác định cấu trúc bậc I của protein. Trong đó acid amin cuối cùng đợc đánh dấu và cắt ra để xác định. Mỗi phản ứng thờng 50 acid amin/chuỗi, do vậy trớc khi đọc, các chuỗi dài thờng đợc cắt ngắn bằng protease đặc hiệu hoặc hóa chất đặc hiệu; ví dụ hydroxylamin cắt đặc hiệu liên kết asparagin-glycin. Máy đọc trình tự acid amin đợc kết nối với sắc ký lỏng cao áp cho phép xác định trình tự của protein cỡ pM (tơng đơng lợng protein có thể thu đợc từ điện di trên thạch acrylamid) [Võ Thị Thơng lan, sinh học phân tử, 2002, tr.201-202. 4.1.4 Cơ chế phân tử của đột biến Chuỗi kép polynucleotid là cấu trúc cơ sở của một gen. Cơ chế phân tử của đột biến gen dựa vào sự biến đổi tại một nucleotid của chuỗi đơn mang mã di truyền (bộ ba nucleotid = triplette). Do đặc điểm cấu tạo hóa học nên chỉ có sự thay thế giữa nucleotid AG và TC, trong khi sự chèn thêm hay cắt bỏ nucleotid không lệ thuộc vào loại A, G, T hoặc C. Để tiện theo dõi cơ chế phân tử của đột biến gen cần dựa vào bảng mã phiên đợc đa ra dới đây. U C A G u uuu Phe UCU Ser UAU Tir UGU Cys U uuc Phe UCC Ser UAC Tir UGC Cys C UUA Leu UCA Ser UAA KT UGA KT A UUG Leu UCG Ser UAG KT UGG Trp G c CUU Leu ecu Pro CAU His CGU Arg U cuC Leu CCC Pro CAC His CGC Arg C CUA Leu CCA Pro CAA Gin CGA Arg A CUG Leu CCG Pro CAG Gin CGG Arg G A AUU Ile ACU. Thr AAU Asn AGU Ser U AUC Ile ACC Thr AAC Asn AGC Ser C AUA Ile ACA Thr AAA Lis AGA Arg A AUG Met ACG Thr AAG Lis AGG Arg G G GUU Val GCU Ala GAU Asp GGU Gli U GUC Val GCC Ala GAC Asp GGC Gli C GUA Val GCA Ala GAA Glu GGA Gli A GUG Val GCG Ala GAG Glu GGG Gli G 6 Tùy theo hậu quả của đột biến gen có thể phân biệt những dạng đột biến: đột biến sai nghĩa, đột biến vô nghĩa, đột biến thoái hóa và đột biến dịch khung. (1) Đột biến sai nghĩa: Khi thay thế một cặp nucleotid (ví dụ cặp G-C bằng cặp A-T) dẫn đến thay đổi loại acid amin tại vị trí tơng ứng với bộ ba mã cho acid amin tại vị trí đó. Chuỗi Trình tự cha đột biến Trình tự sau đột biến Gen 3AGT-CAA-GGT-TGC-CAT-5 3AGT-CAA-GGT-TAC-CAT-5 m-ARN 5UCA-GUU-CCA-ACG-GUA-3 5UCA-GUU-CCA-AUG-GUA-3 Protein Ser-Val-Pro-Thr-Val- Ser-Val-Pro-Met-Val- (2) Đột biến vô nghĩa: Thay thế cặp A-T bằng cặp G-C tại bộ ba thứ 3 trên ADN dẫn đến thay đổi mã bộ ba có cặp nucleotid bị thay đổi. Bộ ba mới vẫn mã cho acid amin nh bộ ba cũ. Chuỗi Trình tự cha đột biến Trình tự sau đột biến Gen 3AGT-CAA-GGT-TGC-CAT-T5 3AGT-CAG-GGT-TGC-CAT-T5 m-ARN 5UCA-GUU-CCA-ACG-GUA-3 5UCA-GUC-CCA-AUG-GUA-3 Protein Ser-Val-Pro Thr Val- Ser-Val-Pro Thr Val- (GUC cũng mã cho Val nh GUU) (3) Đột biến thoái hóa: Do mất cặp (ví dụ cắt bỏ cặp G-C) trong ADN dẫn đến tổ chức mới trình tự các bộ ba từ vị trí mất cặp G-C và có thể xuất hiện mã kết thúc làm thay đổi loại và trình tự amin cũng nh giảm số lợng acid amin trong protein mới. Chuỗi Trình tự cha đột biến Trình tự sau đột biến Gen 3AGT-CAA-GGT-TGC-CAT-T5 3AGT-CAA-GTT-GCC-ATT5 m-ARN 5UCA-GUU-CCA-ACG-GUA-A3 5UCA-GUU-CAA-UGG-UAA3 (UAA là mã kết thúc) Protein Ser-Val-Pro-Thr-Val- Ser-Val-Gln-Trp (thay đổi loại và ít hơn 1 a. amin) (4) Đột biến dịch khung: cắt bỏ cặp C-G của bộ ba thứ 3 trên gen dẫn đến tổ chức lại các bộ ba kể từ vị trí đó; hậu quả là làm thay đổi loại, số l ợng các acid amin trong chuỗi polypeptid ban đầu. Chuỗi Trình tự cha đột biến Trình tự sau đột biến Gen 3AAC-ACA-CAG-GTT-CAA-AGG-AGC5 3AAC-ACA-AGG-TTC-AAA-GGA-GC5 m-ARN 5UUG-UGU-GUC-CAA-GUU-UCC-UCG3 5UUG-UGU-UCC-AAG-UUU-CCU-CG3 Protein Leu-Cys-Val-Gly-Val-Trp-Ser- Leu-Cys-Ser-Lys-Trp-Pro- (thay đổi loại và ít hơn 1 a. amin) Cơ chế đột biến gen trên một nhiễm sắc thể có thể phân làm các bớc: 1)- Men topoisomerase mở xoắn chuỗi kép ADN 2)- Một men giới hạn (nuclease) cắt liên kết peptid giữa hai nucleotid tại một hoặc hai vị trí trên gen. 3)- Tách rời liên kết hydro giữa hai mạch, gỡ nucleotid ra và thay thế, ghép thêm hoặc loại bỏ nucleotid ban đầu. 4)- Men ligase nối lại mạch nucleotid đã bị cắt đứt . 4.1.5 Đột biến nhân tạo hay cảm ứng và hồi biến 7 4.2 Đột biến cấu trúc và số lợng nhiễm sắc thể 4.2.1 Đột biến cấu trúc trên một nhiễm sắc thể (ADN) Đột biến gen thờng rất hay là hậu quả của những biến đổi của một cặp nucleotid duy nhất nội trong đoạn acid nucleic diễn đạt gen chức năng. Khi đó hoặc một purin base hay một pyrimidin base bị thay thế bởi purin hoặc pyrimidin base khác (transition: chuyển đổi). Cũng có thể một purin base đợc đổi (transversion: trao đổi) bằng một pyrimidin base (hay ngợc lại). ở cả hai tr- ờng hợp, trật tự nucleotid bị biến đổi trong sự bảo tồn số lợng nucleotid nguyên thủy. Sự mất đi (-) hay sự chèn thêm (+) các nucleotid trong vùng một gen cùng khởi sinh những đột biến gen dẫn đến sơ đồ đọc từ một điểm bắt đầu cố định của mã di truyền bị thay đổi [ABC Biologie, 1967, tr.295]. Thay thế nucleotid Thêm nucleotid Bớt nucleotid Đảo đoạn nucleotid trong một gen 8 Trao đổi đoạn nucleotid 4.2.2 Đột biến cấu trúc giữa các nhiễm sắc thể Tùy theo dạng biến đổi cấu tạo mà những đột biến NST đợc gọi là đột biến đảo vị (inversion: đảo vị một đoạn tại chỗ), đột biến đổi vị (translocation: chuyển vị một đoạn sang NST khác), đột biến mất đoạn (deletion: mất một đoạn ở giữa NST), đột biến cắt đuôi (deficiency) và đột biến nhân đôi (duplication: tái bản một đoạn của NST đơn bội). Thêm đoạn NST Tái tổ hợp đặc hiệu phát hiện lần đầu tiên ở E. coli. Khi xâm nhập tế bào chủ, men integrase của phage (thể thực khuẩn) và protein IHF của tế bào chủ liên kết với vị trí đặc biệt trên -ADN (của phage) và bám vào hệ gen của tế bào vi khuẩn. Lúc này xảy ra trao đổi chéo giữa hai genomee (phage và E. coli); Phage có thể ở dạng tiềm tan. Tùy theo chiều sắp xếp của các vị trí đặc hiệu trên ADN mà trao đổi chéo đặc hiệu có thể diễn ra theo 3 cách khác nhau: Trao đổi chéo đặc hiệu ngoại phân tử (intermolecular site-specific recombination): sự ghép vào hoặc tách ra giữa hai phân tử ADN (ví dụ nh ghép -ADN vào genome của E. coli). Cơ chế tái tổ hợp đặc hiệu ở E. coli Trao đổi chéo đặc hiệu nội phân tử (intramolecular site-specific recombination): giữa các đoạn nucleotid lặp lại cùng chiều hay ngợc chiều của một phân tử ADN. Ví dụ sự trao đổi chéo đặc hiệu tại vùng G (3000 bp) của phage Mu. Đoạn G (có 34 nucleotid lặp lại ngợc chiều ở hai đầu) có khả năng đổi chiều ngay tại vị trí của 9 mình. Sự đổi chiều của G phụ thuộc hai đoạn lặp lại này và protein GIN (mã bởi gen gin). Trao đổi chéo giữa hai chuỗi lặp lại ngợc chiều gixL và gixR gây ra sự đổi chiều đoạn G. Do vậy hoạt động của các gen S và U bị thay thế bởi S và U . Sản phẩm của hai cặp gen này của Mu qui định giới hạn tế bào chủ E. coli. Bớt đoạn NST Trao đổi gen do tái tổ hợp chung Trao đổi chéo đoạn NSTử (gen E) giữa hai NST tơng đồng Đoạn e không bổ sung với E, đ ợc cắt bỏ Đoạn E đợc dùng làm khuôn tổng hợp E Trao đổi gen do tổng hợp ADN có giới hạn Thay thế gen giữa hai NSTử của một NST do tổng hợp ADN có giới hạn Trao đổi đoạn NST Sự trao đổi chéo đoạn ADN (crossing-over) cũng dựa trên thuyết Bruch-Reunion và diễn ra ở cuối kỳ đầu của phân bào giảm phân (meiose). Hiện tợng này diễn ra theo nhiều dạng khác nhau, tùy xem NST nào trong thể tứ bắt chéo nhau. 10 [...]... trờng cực đoan nh hạn, nhiệt độ cao, độ muối cao Có thể phân chia HSP theo khối lợng phân tử thành 6 nhóm với MW (molecular wight) = 110, 90, 70, 60, 20, 8,5 kDa Trong số này HSP70 và HSP60 còn có khả năng môi giới phân tử (gọi là chaperonin); trái lại HSP8,5 có khả năng bảo vệ tế bào nhng không phải là môi giới phân tử (gọi là ubiquytin) Ubiquytin phân giải những protein không có hoạt tính men, ngăn... kết phosphodiester ngay sau base pyrimidin (C, U) của ARN, dùng để loại bỏ ARN trong chế phẩm ADN hoặc protein, loại hỏ các đoạn không ghép cặp trên phân tử lai ARN-ADN 5)- Loại bỏ ARN trong phân tử lai ARN-ADN, dùng để loại bỏ ARN trong phiên mã ngợc trớc khi tiếp tục tổng hợp mạch thứ hai của cADN tạo ADN mạch kép 17 4.3.2 Các kiểu sửa sai Phục hồi trực tiếp [1] Sử dụng photolyase: Tia tử ngoại gây... ABC Biologie, 1967, tr.295 Đa bội thể lệch Nguồn gốc của đa bội lệch (aneuploid) chủ yếu do rối loạn phân ly cặp NST kép tơng đồng trong phân bào (meiosis và mitose) Hiện tợng này gọi là non-disjunction 13 Meiose di n biến bình thờng Meiose di n biến bất thờng Mitose di n biến bình thờng Mitose di n biến bất thờng Phỏng theo ABC Biologie, 1967, tr.295 4.3 Cơ chế sửa sai và bảo vệ nhiễm sắc thể Đột... 1967, tr 169 Quá trình tơng tự nhau ở virus, vi khuẩn cũng nh ở nấm và gồm các bớc chính: (1) Hai phân tử ADN bị bẻ gẫy, (2) Vị trí đứt gẫy nằm bất kỳ trên đoạn nucleotid tơng đồng, (3) trao đổi hai sợi đơn của hai phân tử ADN, (4) cắt nối mạch bổ sung giữa hai đoạn sợi đơn ADN để hoàn chỉnh hai phân tử ADN dị hợp kép (heteroduplex join) Trao đổi đoạn ADN ở Eucaryota Tại vị trí nối dị hợp có thể xảy... tách đợc hơn 1200 men giới hạn nhóm II Sau khi sử dụng men giới hạn có thể đa các mẫu vào chạy điện di trên thạch sẽ thu đợc các băng hiển thị các đoạn ADN với chiều dài (kích thớc) khác nhau So sánh với băng điện di mẫu ADN chuẩn và kết quả phân tích sẽ cho trình tự các đoạn nhỏ ADN cấu tạo nên phân tử ADN cần kiểm tra Ngoài sử dụng men giới hạn để lập bản đồ giới hạn còn để tạo ADN tái tổ hợp Quy... protein, tạo điểm đứt trong kỹ thuật mẫu dò 2)- Nuclease SI (tách từ Aspergillus orycae) phân giải ADN mạch đơn hoặc kép, dùng để phân tích đặc điểm cấu trúc phân tử lai ADN-ARN, loại bỏ đầu so le để tạo đầu bằng, loại bỏ các nút vòng trên ARN trong phản ứng phiên mã ng ợc tạo cADN 3)- Exonuclease III (từ E coli) phân giải lần lợt các nucleotid từ đầu 3 -OH tự do của ADN theo chiều từ 3 -5 tạo ra vùng... 17 4.3.2 Các kiểu sửa sai Phục hồi trực tiếp [1] Sử dụng photolyase: Tia tử ngoại gây ra hai sai hỏng là cyclobutapyrimidin dimer (CPDs) và pyrimidine 6-4 pyrimidone (6-4PPs) Các enzym photolyase nhận biết sai hỏng này và sửa chữa nhờ năng l ợng ánh sáng để hóa giải cấu trúc dimer thành cấu trúc bình thờng Phơng thức này cha phát hiện ở động vật có vú và ở ngời [2] Sử dụng ADN polymerase và protein... khỏi ADN nhờ phân hủy liên kết Nglycosidic giữa đờng và base Khi ấy phần tử đờng bị bộc lộ và vị trí đó gọi là AP vì nó đợc nhận biết bởi men AP-endonuclease Sau đó ADN đợc sửa chữa bởi ADN polymerase và ADN ligase Ví dụ mô tả trong hình dới đây: Cơ chế sửa chữa base hỏng (BER = base excision repair) Phơng thức loại bỏ nucleotid hỏng (NER = nucleotid excision repair): Chỉnh sửa các liên kết dimer T-T,... chết do ung th Theo quan điểm hóa lý thì ADN chịu rất nhiều đột biến tự phát do biến động nhiệt hoặc do tác động của các phân tử dung môi: mỗi ngày, ADN của một tế bào mất đi 5000 purin (adenin và guanin), và 1000 cytosin chuyển thành uracin Ngoài ra dới tác động tia tử ngoại rất nhiều dimer (giữa hai thymin, ) Rõ ràng cấu trúc ADN phải chịu đột biến tự phát với tần số khá cao 4.3.1 Khái quát về cơ chế... này đ ợc khắc phục nhờ cơ chế sửa chữa ADN Nhóm protein RAD (trong đó có RAD51 rất tơng đồng với RecA của E coli) tham gia trao đổi chéo ở Eucaryota đợc phân lập đầu tiên từ tế bào nấm không có khả năng sửa chữa ADN hoặc bị rối loạn phân bào nguyên phân Sau đó các dạng tơng đồng với RAD51 tìm thấy ở ruồi giấm, chuột và ngời Gen mã cho các dạng RAD51 đều đợc hoạt hóa khi ADN bị tổn thơng Gen DST1 (thuộc . lệ với khối lợng phân tử protein. Kết quả có thể phân lập các protein có khối lợng phân tử khác nhau. Điện di đẳng điện: Mỗi protein có điểm đẳng điện khác nhau nên có thể điện di các mẫu protein. điện di trên thạch acrylamid) [Võ Thị Thơng lan, sinh học phân tử, 2002, tr.201-202. 4.1.4 Cơ chế phân tử của đột biến Chuỗi kép polynucleotid là cấu trúc cơ sở của một gen. Cơ chế phân tử của đột. tơng đợc truyền sang thực ra từ phía giới cái (trứng); (3) do sự phân bố không đều các phần tử bào tơng khác nhau trong quá trình phân bào nên có thể đa đến sự pha trộn vật chất di truyền (plasmagen)