TỔNG QUAN VỀ TOBRAMYCIN.DOC

TỔNG QUAN VỀ TOBRAMYCIN

Bột màu trắng hoặc trắng ngà Dễ tan trong nớc, rất khó tan trong ethanol, thực tế không tan trong cloroform và ether.

Tobramycin hầu nh không hấp thu qua đờng tiêu hoá nhng hấp thu tốt qua đờng tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch Thuốc ít liên kết với protein huyết tơng Do

phân tử phân cực mạnh nên khó đi vào các mô kể cả não Thuốc đạt nồng độ cao trong vỏ thận Khi sử dụng cho phụ nữ mang thai, thuốc tích lũy trong thai gây độc cho cả mẹ và con Tobramycin đào thải chủ yếu qua thận nên phải giảm liều khi suy thận, thờng dựa vào creatinin huyết thanh để tránh độc tính Hiện nay, tobramycin đợc dùng với chế độ một liều cao và duy nhất trong ngày Cách dùng này cho thấy hiệu quả điều trị cao hơn và ít độc tính hơn so với dùng liều nhỏ và nhiều lần trong ngày nh trớc đây Đối với các ca nặng (nhiễm Pseu

aeruginosa ở ngời giảm neutrophile và các ca suy thận) cần khoảng cách liều

dài hơn 24 giờ Thời gian bán thải của tobramycin: 2 - 5 giờ [6]

1.1.5 Tác dụng và cơ chế tác dụng

Tobramycin là một kháng sinh nhóm aminoglycosid có tác dụng trên nhiều vi khuẩn Gr (-) hiếu khí và một số vi khuẩn Gr (+) hiếu khí Thuốc không có tác dụng với Chlamydia, nấm, virus và đa số các vi khuẩn yếm khí

Tobramycin rất giống gentamycin về tính chất sinh học và độc tính: chúng có cùng nửa đời thải trừ, nồng độ đỉnh trong huyết thanh, ít liên kết với protein, thể tích phân bố và sự bài tiết chủ yếu qua lọc ở cầu thận

Điểm quan trọng nhất của tobramycin là có hoạt tính đối với phần lớn các chủng Pseudomonas aeruginose, mạnh hơn cả gentamycin

Cơ chế tác dụng: Tobramycin ức chế sự tổng hợp protein ở các vi khuẩn nhậy cảm bằng cách gắn không thuận nghịch với các tiểu phân 30S của ribosom [2], [11].

1.1.6 Chỉ định

Đợc chỉ định trong các bệnh nhiễm khuẩn nặng đe dọa tới tính mạng, đặc biệt với các bệnh mà nguyên nhân cha rõ ràng hoặc bị nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Gr (-).

Trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn nặng, hoặc trong các bệnh nhiễm khuẩn nặng toàn thân do Pseudomonas sp gây ra, tobramycin có thể dùng phối hợp với một kháng sinh nhóm beta-lactam

Trong bệnh viêm nội tâm mạc do Streptococcus faecalis hoặc alpha -

Streptococcus gây ra, có thể dùng tobramycin phối hợp với ampicilin hoặc

benzylpenicilin nhng phải tiêm riêng rẽ [2]

1.1.7 Chống chỉ định

Ngời có tiền sử dị ứng với các kháng sinh loại aminoglycosid, ngời nghe kém và ngời có bệnh thận [2]

1.1.8 Dạng bào chế và liều lợng

Tobramycin sulphat: Dung dịch tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch 40 mg/ml (ngời lớn), 10 mg/ml (trẻ em) Bột pha tiêm 30 - 40 mg/lọ.

Lọ 5 ml 0,3 % để nhỏ mắt Tuýp 3,5 g mỡ tra mắt 0,3 %.

Dạng thuốc hít qua đờng miệng bằng máy khi dùng để điều trị nhiễm P

aeruginosa đờng hô hấp ở bệnh nhân bị xơ nang hóa. [11]

pH sau khi tiệt trùng : 7,8 ± 0,2

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử sau đó tiến hành thử và tính kết quả theo [15]

pH sau khi tiệt trùng : 8,2 ± 0,2 - Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử

Cân chính xác khoảng 25,0 mg tobramycin hòa tan trong dung dịch đệm phosphat pH 8,0 để có nồng độ tobramycin chính xác khoảng 10 IU/ml; 20

- Chủng vi khuẩn : Bacillus subtilis ATCC 6633 - Môi trờng nuôi cấy : Môi trờng đặc

- Dung dịch chuẩn

Cân chính xác một lợng tobramycin chuẩn, tơng đơng khoảng 25 mg (hiệu lực), hoà tan trong dung dịch đệm phosphat 0,1 mol/l, pH 8 thành chính

xác 25 ml và đó chính là dung dịch chuẩn gốc Giữ dung dịch chuẩn gốc ở nhiệt độ từ 5οC đến 15οC và sử dụng trong vòng 30 ngày Pha loãng dung dịch bằng dung dịch chuẩn đệm phosphat 0,1M, pH 8 để đợc các dung dịch có nồng độ 8àg/ml và 2àg/ml (theo hiệu lực)

- Dung dich thử:

Cân chính xác một lợng tobramycin, tơng đơng khoảng 25 mg (hiệu lực), hoà tan trong dung dịch đệm phosphat 0,1 mol/l, pH 8 thành chính xác 25ml Pha loãng dung dịch bằng dung dịch chuẩn đệm phosphat 0,1M, pH 8 để đợc các dung dịch có nồng độ 8àg/ml và 2àg/ml (theo hiệu lực)

1.2.2 Định lợng tobramycin bằng phơng pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS

1.2.2.1 Phơng pháp 1: [4]

Cân một lợng tobramycin sulfat tơng ứng với khoảng 0,3 g tobramycin nguyên liệu , cho vào bình định mức có dung tích 100 ml, bổ sung nớc cất 2 lần vừa đủ đến vạch, trộn đều Lấy 1 ml dung dịch này cho vào bình định mức có dung tích 20 ml, thêm 5 ml dung dịch NaOH 0,01N, 2 ml dung dịch KMnO4 Dung dịch vừa pha đem đun cách thuỷ ở 400C trong 60 phút.

Song song tiến hành điều chế dung dịch chuẩn bằng cách dùng chất đối chiếu tobramycin.

Mẫu trắng tiến hành nh mẫu thử nhng không có tobramycin.

Sau khi đun cách thuỷ ở 400C, thời gian 60 phút, đem đo mật độ quang của các dung dịch này ở bớc sóng 425 nm, cuvet dày 1cm.

1.2.2.2 Phơng pháp 2: [19]

Dựa trên cơ sở tạo ra sản phẩm mầu xanh với 3-methyl-2 benzothiazolinon hydrazon hydrochlorid và FeCl3 Sản phẩm có độ hấp thụ lớn nhất ở 645 nm Định luật Lambert-Beer đợc áp dụng trong khoảng nồng độ từ 50-500 mUI/ml.

1.2.3 Định lợng tobramycin bằng phơng pháp HPLC

1.2.2.1 Phơng pháp 1 [14]

- Cột styren - divinylbenzen copolymer (4,6 x 250 mm, 8àm) - Nhiệt độ cột: 55 0C.

- Pha động: Hỗn hợp pha trong 1l nớc đã loại CO2 gồm: 52 g natri sulfat khan; 1,5 g natri octansulfonat; 3 ml tetrahydrofuran và 50 ml dung dịch kali dihydrophosphat 0,2 M đã đợc chỉnh pH về 3,0 bằng acid phosphoric.

- Pha động: Hòa tan 2,0 g tris (hydroxymethyl) aminomethan trong khoảng 800 ml nớc, thêm vào dung dịch này 20 ml dung dịch acid sulfuric 1N, sau đó pha loãng bằng acetonitril tới 2000 ml, lắc đều.

- Thuốc thử 2,4-dinitrofluorobenzen: Dung dịch 2,4dinitrofluorobenzen

- Các dung dịch chuẩn và thử đợc tạo dẫn xuất với các thuốc thử 2,4-dinitrofluorobenzen và tris (hydroxymethyl) aminomethan trớc khi tiêm sắc ký.

1.2.2.3 Phơng pháp 3 [15]

- Cột Purospher STARRP-18e (4 x 55 mm, 3 àm, Merck).

- Tốc độ dòng: 1,3 ml/phút - Detector UV: 230 nm.

- Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: Khoảng 5 àg/ml trong nớc

- Dung dịch chuẩn và dung dịch thử đợc tạo dẫn xuất với dung dịch thuốc thử 1-naphthyl isothiocyanat trong pyridin ở 700C.

1.2.2.4 Phơng pháp 4 [16]

- Cột Xterra RP - 18 (2,1 x 250 mm, 5 àm) - Nhiệt độ cột: 30 0C.

- Pha động A: Thêm 0,7 ml dung dịch amoni hydroxyd 28 - 30 % vào 1 lít nớc Milli - Q Sử dụng dung dịch natri hydroxyd 2,5 N để chỉnh pH pha

- Pha động: Hoà tan 17,75 g natri sulfat khan ; 3,05g natri pentansulfonat và 1ml acid acetic băng trong 1000 ml nớc, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45àm.

- Thuốc thử tạo dẫn xuất sau cột: Hoà tan 0,5g o-phthalaldehyd trong 100 ml methanol, thêm 1,0 ml 2-mercaptoethanol, lắc 3 phút Thêm 1,5 ml dung dịch polyoxyethylen lauryl ether 12% và 350 ml dung dịch đệm borat pH 10,4 lắc đều

- Dung dịch đệm borat pH 10,4: Hoà tan 24,64 g acid boric trong 900 ml nớc Điều chỉnh pH đến 10,4 bằng dung dịch NaOH 40%, thêm nớc tới vừa đủ 1000 ml, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 àm (pha theo BP 2005).

1.2.2.7 Phơng pháp 7 [9]

• Dung dịch thử

Cân chính xác khoảng 20,0 mg tobramycin nguyên liệu cho vào bình định mức 20,0 ml Hòa tan và pha loãng bằng nớc vừa đủ đến vạch Lấy chính xác 5,0 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 20,0 ml Thêm 0,5 ml thuốc

thử X, đem đun cách thủy ở 80 0C trong 60 phút Thêm dung môi vừa đủ đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45 àm.

• Dung dịch chuẩn (đối chiếu)

Tiến hành tơng tự nh dung dịch thử nhng thay tobramycin nguyên liệu bằng tobramycin chuẩn (đối chiếu)

- Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng thí nghiệm.

* Nhận xét: Qua các phơng pháp định lợng nêu trên, chúng tôi nhận thấy:

- Định lợng bằng phơng pháp vi sinh: Rẻ, đơn giản, không cần trang thiết bị phức tạp nhng có nhợc điểm lớn là mất nhiều thời gian và kém dặc hiệu do sự có mặt của các chất kháng vi sinh vật khác, tính chính xác không cao.

- Định lợng bằng phơng pháp đo độ hấp thụ UV-VIS: Có độ chính xác cao, tiến hành đơn giản, không yêu cầu máy móc quá phức tạp, hoá chất thông dụng và có thể áp dụng định lợng ở các cơ sở kiểm nghiệm trong cả nớc Tuy nhiên, nhợc điểm của phơng pháp là: Tính đặc hiệu cha cao (sự có mặt của chất khác có khả năng hấp thụ tử ngoại khả kiến nh benzalkonium clorid, một chất bảo quản hay dùng, sẽ ảnh hởng kết quả định lợng), hoặc phải dùng thuốc thử nhập ngoại để tạo dẫn chất

- Định lợng bằng phơng pháp HPLC :

 u điểm: Nói chung có tính đặc hiệu cao, tách riêng đợc hoạt chất.

 Nhợc điểm: Tiến hành phức tạp, đòi hỏi có trang thiết bị và thuốc thử đắt tiền vì detector UV thờng không dùng đợc mà thờng phải tạo dẫn chất.

Phơng pháp HPLC pha đảo với detector UV rất hay sử dụng để phân tích các hợp chất phân cực và hấp thụ UV Nhng với các hợp chất hấp thụ UV yếu nh tobramycin thì thờng phải tạo dẫn chất, hoặc phải sử dụng detector loại đặc biệt đắt tiền

Vì vậy, với các trang thiết bị sẵn có ở phòng thí nghiệm, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu xây dựng một quy trình định lợng tobramycin bằng phơng pháp HPLC đơn giản, dễ thực hiện và kinh phí thấp hơn, không sử dụng thuốc thử tạo dẫn xuất nh các phơng pháp hiện nay với hi vọng có thể đa vào sử dụng trong công tác kiểm nghiệm - góp phần quản lý chất lợng các sản phẩm chứa định lợng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với 2 pha luôn tiếp xúc nhng không hòa lẫn vào nhau: Pha tĩnh (trong cột hiệu năng cao) và pha động (dung môi rửa giải) Khi dung dịch của hỗn hợp các chất cần phân tích đa vào cột, chúng sẽ đợc hấp phụ hoặc phân bố vào pha tĩnh tùy thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích Khi ta bơm dung môi pha động vào cột thì tùy thuộc vào ái lực của các chất với hai pha, chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách

Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đợc phát hiện bởi bộ phận phát hiện gọi là detector và đợc chuyển qua bộ xử lý kết quả Kết quả cuối cùng đợc hiển thị trên màn hình hoặc đa ra máy in [8]

1.3.2 Cơ sở lý thuyết

Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau Khi pha động di chuyển với một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lu giữ ra khỏi cột

Tùy theo bản chất pha tĩnh, chất tan và pha động mà quá trình rửa giải tách đợc các chất khi ra khỏi cột sắc ký Nếu ghi quá trình tách sắc ký, chúng ta có sắc đồ [8], [11].

1.3.3 Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC

Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao gồm 6 bộ phận chính sau:

1.3.3.1 Hệ thống bơm

Để bơm pha động vào cột tách Bơm này phải điều chỉnh đợc áp suất (0 - 400 bar)

1.3.3.2 Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi

Bình chứa dung môi thờng bằng thủy tinh hoặc thép không gỉ Dung môi chạy sắc ký đợc lọc qua màng lọc (thờng màng lọc cỡ lỗ 0,45 àm ) và đuổi khí hòa tan.

1.3.3.3 Hệ tiêm mẫu

Để đa mẫu phân tích vào cột.

Có nhiều phơng pháp tiêm mẫu khác nhau, đơn giản nhất là sử dụng một van tiêm Trong các hệ thống sắc ký hiện đại là hệ tiêm mẫu tự động.

Mẫu thử (dạng lỏng hay dạng rắn) đều phải hoà tan trong dung môi thích hợp rồi lọc qua màng lọc 0,45àm trớc khi tiêm.

1.3.3.4 Cột sắc ký lỏng HPLC

Cột đợc chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hóa chất, chịu đợc với áp suất cao đến vài trăm bar.

- Chiều dài cột: 10, 15, hoặc 25 cm; thích hợp với các tiểu phân pha tĩnh có đ-ờng kính rất nhỏ (3, 5, 10 àm).

- Đờng kính cột: 4 hoặc 4,6 mm.

Nói chung, cột HPLC có tuổi thọ khá dài nếu ta sử dụng đúng cách Nếu sử dụng không đúng cách tuổi thọ của cột sẽ giảm Ví dụ dung môi có tính chất acid mạnh hoặc base mạnh hoặc tiêm liên tiếp các mẫu sinh học hay nguyên liệu bẩn thì tuổi thọ của cột sẽ bị giảm.

1.3.3.5 Detector trong HPLC

Là bộ phận phát hiện chất phân tích, tùy theo bản chất của chất cần phân tích mà sử dụng detector thích hợp Detector hay sử dụng là detector hấp thụ UV - VIS

Nguyên lý hoạt động của detector UV - VIS dựa trên nguyên lý hoạt động của phơng pháp đo quang phổ hấp thụ Ngoài ra còn có detector khúc xạ, huỳnh quang, điện hóa.

1.3.3.6 Thiết bị hiển thị kết quả

Có nhiều loại, nhng đơn giản và phổ biến nhất là máy tự ghi các tín hiệu

* tR (Thời gian lu): thời gian kể từ khi chất phân tích đợc bơm vào cột cho đến khi đợc phát hiện ở nồng độ cựu đại của nó.

* t0 (Thời gian chết): thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống sắc ký * tR’ (Thời gian lu thực): tR’ = tR - t0

* W0.5 : Độ rộng của pic ở nửa chiều cao * Wb : Độ rộng ở đáy pic.

Thời gian lu là thông tin về mặt định tính của sắc đồ, nó là một hằng số đối với một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong điều kiện không đổi

1.3.4.1 Hệ số dung lợng k’

Nếu k' nhỏ thì tR

cũng nhỏ và sự tách kém Trong thực tế k' nằm trong khoảng 2 - 5 là tốt nhất Hai chất chỉ đợc tách ra khỏi nhau nếu chúng có giá trị khác nhau Trong phân tích thờng chọn cột, pha động và các điều kiện phân tích sao cho: 1 < k' < 8

Đặc trng cho mức độ tách hai chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký Độ phân giải của 2 pic ở cạnh nhau đợc tính theo công thức:

W1/20: là chiều rộng của pic đợc đo ở 1/20 chiều cao của pic

a: khoảng cách từ đờng vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đờng cong phía trớc tại vị trí 1/20 chiều cao của pic.

Trong phép định lợng, yêu cầu: 0,9 ≤ AF ≤ 2 [1], [18], [22].

Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách một hỗn hợp có nhiều thành phần Nó là một chất rắn xốp có kích thớc hạt rất nhỏ, đờng kính cỡ hạt từ 3 - 10 àm, diện tích bề mặt riêng từ 50 - 500 m2/g

Yêu cầu pha tĩnh trong HPLC:

• Phải trơ và bền vững trong môi trờng HPLC.

• Có khả năng tách một hỗn hợp chất tan nhất định.

• Tính chất bề mặt ổn định

• Cân bằng động học của sự tách diễn ra nhanh và lặp lại tốt.

• Cỡ hạt phải đồng nhất.

Pha tĩnh thờng đợc chế tạo trên nền silica (SiO2), nền oxyd nhôm (Al2O3), nền hợp chất cao phân tử (cellulose) hay trên nền mạch carbon Trong sắc ký hấp phụ, pha tĩnh trên nền silica có nhiều u điểm và sử dụng nhiều nhất Có thể phân loại chất nhồi cột theo gốc siloxan:

* R là nhóm phân cực (a nớc): nhóm hydroxyl (-0H) hoặc các alkylamin (-CH2NH2), alkylnitril (-CH2CN) Loại này sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký pha thuận để phân tích các chất ít hoặc không phân cực.

* R là các nhóm ít phân cực: các nhóm octyl, octadecyl, phenyl đợc chế bằng cách alkyl hóa các nhóm OH trên bề mặt silica trung tính bằng các gốc alkyl - R của mạch carbon (C2, C8, C18) hay các gốc carbon vòng (phenyl) Do các nhóm OH thân nớc đợc thay bằng các gốc R kỵ nớc nên bề mặt trở nên ít

phân cực Silica đã alkyl hóa đợc sử dụng trong sắc ký pha đảo để phân tích các chất phân cực, ít phân cực hay sắc ký cặp ion.

1.3.5.2 Lựa chọn pha động cho HPLC [12], [18]

Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký, là yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất tách của một hỗn hợp Pha động có thể là nớc, dung môi hữu cơ hay hỗn hợp dung môi theo tỷ lệ nhất định.

Pha động trong HPLC ảnh hởng tới rất nhiều thông số của quá trình sắc ký nh độ chọn lọc α, thời gian lu tR, hiệu lực tách của cột, độ phân giải RS , độ rộng của pic sắc ký Chính vì vậy việc lựa chọn pha động thích hợp là rất quan trọng.

Yêu cầu của pha động:

• Phải trơ với pha tĩnh.

• Hòa tan đợc chất cần phân tích.

• Bền vững theo thời gian.

• Có độ tinh khiết cao.

• Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.

• Phù hợp với detector.

• Có tính kinh tế và đảm bảo môi trờng.

Trong sắc ký pha thuận, pha động thờng là các dung môi hữu cơ ít phân cực (kỵ nớc) nh: n-hexan, n-heptan, benzen, cloroform Các pha động này th-ờng đợc bão hoà.

Trong sắc ký pha đảo, pha động là hệ dung môi hữu cơ phân cực nh: nớc, methanol, acetonitril hay hỗn hợp của chúng Các dung môi này có thể hòa tan thêm một lợng nhỏ acid hay base hữu cơ.

Bốn yếu tố chính cần chú ý khi lựa chọn pha động:

• Bản chất của dung môi để chạy pha động.

• Thành phần của các chất trong pha động.

• pH của pha động.

• Tốc độ dòng của pha động.

1.3.5.3 Chọn đệm pH

Trong sắc ký tạo cặp ion, sắc ký trao đổi ion, sắc ký hấp phụ mà chất tan có tính acid hay base thờng phải thêm đệm vào pha động để ổn định pH cho quá

* Đánh giá diện tích pic: Diện tích của một chất tơng ứng với tổng lợng

chất đó Để tính diện tích pic, hiện nay ngời ta thờng dùng máy tích phân điện tử gắn với máy vi tính (sai số khoảng 0,5 %) hoặc máy phân tích cơ học (sai số 1,3 %) Phơng pháp này có thể dùng cho các pic không bị trôi đờng nền và cả pic có đờng nền bị trôi Phơng pháp này chỉ cần điểm đầu điểm cuối của pic đợc nhận ra chính xác và cho và cho kết quả tốt với nồng độ vừa, trung bình và cao.

* Đánh giá chiều cao pic: Khi pic có dạng không đổi thì chiều cao pic

(khoảng cách giữa đờng nền và đỉnh pic) là một đại lợng tỷ lệ với diện tích pic và nó cũng có thể dùng để đánh giá phổ Phơng pháp chỉ áp dụng khi các chỉ số k' là hằng định.

1.3.7 ứng dụng của HPLC

Sắc ký nói chung và HPLC nói riêng có ba ứng dụng chính:

1.3.7.1 Định tính và thử độ tinh khiết:

Thời gian lu của chất thử trên sắc đồ phải tơng ứng với thời gian lu của chất chuẩn đối chiếu trên sắc ký đồ.

1.3.7.2 Sắc ký điều chế:

Qua qúa trình sắc ký các chất đợc tách ra và dịch rửa giải đợc hứng riêng rồi cho bốc hơi dung môi thu lấy chất.