Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ KHÁNH LY SÀNG LỌC VI KHUẨN SINH BETA – LACTAMASE PHỔ RỘNG PHÂN LẬP TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA TRUNG ƢƠNG THÁI NGUYÊN BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX – PCR Chuyên ngành: Công nghệ sinh Mã số : 60 42 0201 LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Đắc Trung Thái Nguyên, năm 2013 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên cho tôi gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới Tiến sĩ Nguyễn Đắc Trung – Bộ môn Vi sinh, Trường Đại học Y – Dược Thái Nguyên, đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ tôi hoàn thành tốt luận văn này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các bác sĩ, kỹ thuật viên khoa Vi sinh – Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên, tới các cán bộ nhân viên của Bộ môn Vi sinh – Đại học Y – Dược Thái Nguyên đã hết sức tạo điều kiện giúp đỡ, cho tôi trong quá trình làm luận văn này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban Giám hiệu, Phòng đào tạo, các thầy cô giáo, cán bộ giảng dạy của Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên đã tận tình giảng dạy trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới khoa Xét nghiệm – Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Nguyên, nơi tôi đang công tác đã tạo điều kiện về thời gian cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Thái Nguyên, tháng 4 năm 2013 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ ii DANH MỤC BẢNG BẢNG TÊN BẢNG BIỂU Trang 2.1 Các dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm 21 2.2 Các thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm 22 2.3 Các giai đoạn trong quá trình nghiên cứu 28 2.4 Trình tự các cặp mồi được thiết kế để khuếch đại gen 29 2.5 Thành phần các phản ứng PCR đơn mồi 30 2.6 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với cặp mồi gene bla TEM 30 2.7 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với cặp mồi gene bla CTX-M 31 2.8 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với cặp mồi gene bla SHV 31 2.9 Thành phần phản ứng multiplex - PCR 32 2.10 Chu trình nhiệt của phản ứng multiplex - PCR 33 3.1 Cơ cấu các loại vi khuẩn Gram âm gây bệnh phân lập được 34 3.2 Tỷ lệ đề kháng kháng kháng sinh của E. coli (43 chủng) 35 3.3 Tỷ lệ đề kháng kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae 37 3.4 Kiểu cách kháng kháng sinh của E. coli và K. pneumoniae 39 3.5 Tỷ lệ vi khuẩn sinh ESBL 41 3.6 Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E. coli ESBL 42 3.7 Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng K. pneumoniae ESBL(+) 43 3.8 Kiểu gene ESBL bla được tìm thấy ở các chủng vi khuẩn 52 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ iii DANH MỤC HÌNH HÌNH TÊN HÌNH ẢNH Trang 1.1 Phương pháp đĩa đôi xác định vi khuẩn sinh ESBL 17 1.2 E-test xác định vi khuẩn sinh ESBL 18 2 Sơ đồ các bước được thực hiện trong quá trình nghiên cứu 27 3.1 Tỷ lệ kháng kháng sinh của E. coli 36 3.2 Tỷ lệ kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae 37 3.3 Kiểu cách kháng kháng sinh của E. coli và K. Pneumoniae 39 3.4 Kết quả Double-disk test ở chủng vi khuẩn ESBL(+) 41 3.5 Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E. coli ESBL(+) 42 3.6 Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng K. pneumoniae ESBL(+) 44 3.7 Kết quả khuếch đại gene bla TEM bằng PCR đơn gene 46 3.8 Kết quả khuếch đại gene bla CTX-M bằng PCR đơn gene 47 3.9 Kết quả khuếch đại gene bla SHV bằng PCR đơn gene 49 3.10 Kết quả khuếch đại gene bla TEM và bla CTX-M bằng multiplex- PCR 51 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ iv MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Kháng sinh và cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn 3 1.1.1. Định nghĩa 3 1.1.2. Phân loại phổ tác dụng và chống chỉ định của thuốc kháng sinh 3 1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh 6 1.1.4. Cơ chế kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn 7 1.2. Enzyme β – lactamase hoạt phổ rộng 9 1.2.1. Lịch sử phát hiện enzyme β- lactamase hoạt phổ rộng 9 1.2.2. Định nghĩa ESBL 10 1.3. Tình hình nghiên cứu khả năng sinh ESBL ở vi khuẩn gây bệnh 10 1.3.1. Trên thế giới 10 1.3.2. Tại Việt Nam 12 1.4. Các gen mã hóa ESBL 13 1.4.1. TEM 13 1.4.2. SHV 13 1.4.3. CTX – M 14 1.4.4. OXA 15 1.5. Một số phương pháp phát hiện vi khuẩn sinh ESBL 16 1.5.1. Phương pháp đĩa đôi 17 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ v 1.5.2. Phương pháp đĩa kết hợp (Double disk test) 17 1.5.3. Phương pháp E-test 18 1.5.4. Vitek ESBL card 18 1.5.5. Hệ thống tự động BD Phoenix (Becton Dickinson Biosciences) 18 1.5.6. Các phương pháp sinh học phân tử 19 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 21 2.1.1. Các chủng vi khuẩn 21 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 21 2.1.3. Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn 23 2.1.4. Vật liệu và môi trường xác định độ nhạy cảm của vi khuẩn với 23 2.2. Địa điểm nghiên cứu 23 2.3. Phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1. Phân lập, định danh chủng vi khuẩn Gram âm 23 2.3.2. Kỹ thuật xác định độ nhạy cảm với kháng sinh 24 2.3.3. Kỹ thuật xác định vi khuẩn sinh ESBL 25 2.3.4. Sàng lọc vi khuẩn Gram âm sinh ESBL bằng kỹ thuật multiplex-PCR 26 2.4. Xử lý số liệu 33 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tỷ lệ và kiểu cách kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm gây bệnh phân lập được 34 3.2. Tỷ lệ vi khuẩn sinh ESBL………… ……………….………… 40 3.3. Tỷ lệ và mức độ kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm (E. coli và Klebsiella pneumoniae) sinh ESBL phân lập được 42 3.3. Khuếch đại gene ESBL ở E. coli và Klebsiella pneumoniae 45 3.3.1. Kết quả khuếch đại gene ESBL bằng kỹ thuật PCR 45 3.3.1.1. Gene bla TEM 46 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ vi 3.3.1.2. Gene bla CTX-M 47 3.3.1.3. Gene bla SHV 48 3.3.2. Kết quả khuếch đại gene ESBL bằng kỹ thuật multiplex – PCR 50 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ KẾT LUẬN 54 KHUYẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AMC Amoxycillin/ Acid clavuanate DNA Deoxyribonucleic Acid RNA Ribonucleic Acid FEP Cefepime CTX Cefotaxime CAZ Ceftazidime CRO Ceftriaxone CXM Cefuroxime CIP Ciprofloxacin dNPTs Deoxyribonucleotide Triphosphate DO Doxycyline E. coli Escherichia coli ESBL Extended-spectrum beta lactamase K. pneumoniae Klebsiella pneumoniae MEM Meropenem MPA Meat – Peptone – Agar OFX Ofloxacin PABA Para - aminobenzoic acid PCR Polymerase Chain Reaction TAE Tris – Acetate - EDTA Bp Base pairs Taq – DNA polymerase Themus aquaticus DNA polymerase W/v Weight/volume Bla β- lactamase Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 1 MỞ ĐẦU 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Việc phát minh ra kháng sinh năm 1928 đã làm tăng hiệu quả xử lý các ổ nhiễm trùng. Nhờ đó nhiều căn bệnh được giải quyết dựa vào việc điều trị bằng những phác đồ kháng sinh. Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh tràn lan trong nhiều thập kỷ qua dẫn đến xuất hiện nhiều chủng vi khuẩn kháng kháng sinh. Nhiều bệnh dịch nhiễm trùng kháng thuốc đang nổi lên và kháng sinh dần mất hiệu lực trong điều trị. Đây là mối lo chung của ngành y tế và của toàn xã hội. Việc giới thiệu các kháng sinh cephalosporin thế hệ thứ ba vào thực hành điều trị lâm sàng các nhiễm khuẩn trong đầu những năm 1980 đã được dự báo như là một bước đột phá trong cuộc chiến chống lại các vi khuẩn gây bệnh sinh β-lactamase. ESBL là các β-lactamase có khả năng tác động lên các phân tử penicillin và các cephalosporin thế hệ 1, thế hệ 2, thế hệ 3 và các aztreonam (trừ kháng sinh cefamycin và carbapenem) do chúng có khả năng ly giải các kháng sinh này nhưng chúng lại bị ức chế bởi các các chất ức chế β-lactamase như acid clavulanic [1, 18]. Nhiều gene mã hóa ESBL nằm trên các phân tử plasmid lớn. Các plasmid đã kháng thuốc này đều được tìm thấy ở các vi khuẩn họ Entobacteriaceae, trong đó hay gặp nhất là E. coli và Klebsiella spp. [2, 3, 4, 17, 20, 21, 23]. Nhiễm trùng do các chủng vi khuẩn sinh β-lactamase phổ rộng dẫn đến sự gia tăng tỷ lệ thất bại trong điều trị bằng kháng sinh, trong đó làm tăng cao tỷ lệ tử vong đặc biệt ở những trường hợp nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn sinh ESBL. Khi các chủng vi khuẩn sinh ESBL cũng đồng nghĩa với việc chúng kháng lại rất nhiều loại kháng sinh, đặc biệt là các kháng sinh nhóm cephalosporin. Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên là bệnh viện hạng I trực thuộc Bộ Y tế, được thành lập từ năm 1951, có nhiệm vụ khám chữa bệnh cho nhân dân các dân tộc miền núi vùng Đông bắc Việt Nam. Bệnh viện đóng trên địa bàn trung tâm của tỉnh Thái Nguyên có trách nhiệm phục vụ trực tiếp Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 2 cho người dân của tỉnh. Lưu lượng bệnh nhân đến khám và điều trị tại bệnh viện ngày một tăng. Nhiều nghiên cứu về cơ cấu vi khuẩn và mức độ kháng kháng sinh của các vi khuẩn phân lập tại bệnh viện cũng đã được thực hiện và công bố trên các tạp chí trong nước. Tuy nhiên, vẫn chưa có một nghiên cứu nào điều tra về vi khuẩn sinh β-lactamase phổ rộng được thực hiện tại bệnh viện. Đó là lý do chúng tôi chọn tên đề tài “ Sàng lọc vi khuẩn sinh beta – lactamase phổ rộng phân lập tại bệnh viện Đa khoa trung ƣơng Thái Nguyên bằng kỹ thuật multiplex - PCR”. 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Xác định tỷ lệ và kiểu cách kháng kháng sinh của một số vi khuẩn Gram âm gây bệnh phân lập tại BVĐKTƯ Thái Nguyên. Xác định tỷ lệ và mức độ kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm sinh ESBL phân lập tại BVĐKTƯ Thái Nguyên. Phát hiện một số gene ESBL ở các chủng vi khuẩn phân lập bằng kỹ thuật multiplex - PCR. 3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Thu thập bệnh phẩm từ các mẫu bệnh hô hấp, sinh dục và các bệnh phẩm khác. Nuôi cấy, phân lập và xác định vi khuẩn. Thực hiện kỹ thuật kháng sinh đồ xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh của vi khuẩn. Sàng lọc chủng vi khuẩn sinh ESBL bằng kỹ thuật khoanh giấy đôi (double - dist test). Sử dụng kỹ thuật muitiplex PCR để phát hiện gene sinh ESBL (SHV, CTX và TEM) [...]... Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 21 CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1 Các chủng vi khuẩn Đối tượng nghiên cứu là các chủng vi khuẩn Gram âm gây bệnh thường gặp được phân lập từ các loại bệnh phẩm lâm sàng tại Khoa Vi sinh - Bệnh vi n Đa khoa Trung ương Thái Nguyên từ tháng 4/2012 đến tháng 04/2013 - Vi khuẩn gây bệnh từ mẫu bệnh phẩm được... kháng sinh hiệu quả nhất có khả năng ức chế trên 90% các chủng vi khuẩn kể cả các vi khuẩn sinh ESBL [32] 1.3.2 Tại Vi t Nam Tại Vi t Nam, một số nghiên cứu về vi khuẩn sinh ESBL cũng đã thực hiện Trong 350 chủng vi khuẩn được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm lâm sàng tại 1 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 13 bệnh vi n ở Thành phố Hồ Chí Minh, kết quả cho thấy: 36,7% các vi khuẩn. .. hình elip 2.3.4 Sàng lọc vi khuẩn Gram âm sinh ESBL bằng kỹ thuật multiplex- PCR * Kỹ thuật multiplex - PCR Phát hiện gene mã hóa ESBL ở các chủng vi khuẩn Gram âm phân lập được, bao gồm các gene blaTEM, blaCTX-M và blaSHV Với mục tiêu ứng dụng kỹ thuật multiplex - PCR nhằm phát hiện gene mã hóa ESBL ở các chủng vi khuẩn Gram âm, chúng tôi tiến hành nghiên cứu theo quy trình sau: Số hóa bởi trung tâm học... - Bệnh vi n Đa khoa Trung ương Thái Nguyên từ tháng 4/2012 đến tháng 04/2013 - Vi khuẩn gây bệnh từ mẫu bệnh phẩm được định danh tại Khoa Vi sinhBệnh vi n Đa khoa Trung ương Thái Nguyên và Phòng xét nghiệm Vi sinhSinh học phân tử, Bộ môn Vi sinh, Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất Bảng 2.1 Các dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm STT Dung dịch Thành phần, nồng... 27, 28, 33] Để xác định sự tồn tại và mô tả đặc điểm của các β - lactamase ở các vi khuẩn Gram âm phân lập tại một Bệnh vi n nhi đồng ở Ai Cập, Maysaa đã thu thập các mẫu máu từ những bệnh nhi nghi ngờ bị nhiễm khuẩn bệnh vi n từ tháng 1/2005 - tháng 12/2006 Trong số 1.600 bệnh nhi nghi ngờ nhiễm khuẩn huyết có 816 trường hợp (45%) nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Gram âm; phổ biến nhất là Klebsiella (38,2%),... lực diệt khuẩn lên vi khuẩn mủ xanh và một số vi khuẩn Gram âm - Phân nhóm Cephalosporin + Thế hệ 1: Bao gồm các cephalothin, cephalexin…tác dụng diệt khuẩn lên các vi khuẩn Gram dương và một số ít vi khuẩn Gram âm + Thế hệ 2: Bao gồm các cefuroxim, cefoxitin…tác dụng cân bằng lên cả 2 loại vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm + Thế hệ 3: Bao gồm các cefotaxime, ceftriaxone, ceftazidime… phổ tác... tiết niệu tại bệnh vi n trường cao đẳng y tế Indira Gandhi, Nagpur, Ấn Độ, đã được kiểm tra khả năng sinh ESBL bằng phương pháp khoanh giấy đôi cộng hưởng Kết quả cho thấy trong số 87 chủng vi khuẩn Gram âm kháng Cefotaxime có 42 chủng (48,3%) sinh ESBL đó là E coli, K pneumonia và Acinetobacter Sự đa đề kháng được tìm thấy phổ biến ở các vi khuẩn sinh ESBL (90,5%) cao hơn hẳn các vi khuẩn không sinh ESBL... chủng E coli Kiểu cách đa đề kháng kháng sinh ESBL được tìm thấy ở 30% chủng K pneumonia và 25,8% chủng E coli [29] Ba mươi chín chủng vi khuẩn Gram âm được phân lập từ 39 bệnh nhân nghi ngờ nhiễm khuẩn bệnh vi n của một bệnh vi n cấp 3 Tazania đã được Faustine và cộng sự xác định sự nhạy cảm kháng sinh và khả năng sinh ESBL Trong số các chủng vi khuẩn được phân lập, gồm E coli, Enterobacter spp, Pseudomonas... nghiệm Vi sinh - Sinh học phân tử, Bộ môn Vi sinh, Trường Đại học Y - Dược Thái Nguyên 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 2.3.1 Phân lập, định danh chủng vi khuẩn Gram âm Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 24 * Lấy bệnh phẩm Bệnh phẩm lâm sàng được lấy từ các bệnh nhân tới khám và điều trị tại theo thường quy Các bệnh phẩm được xét nghiệm trong vòng 1 giờ đầu sau khi lấy Các loại bệnh phẩm... năng sinh ESBL ở vi khuẩn E coli và Klebsiella spp., trong tổng số 3.004 chủng vi khuẩn Gram âm phân lập từ các nhiễm khuẩn bụng tại khu vực châu Á - Thái Bình Dương (2007); 42,2% chủng E coli và 35,8% chủng Klebsiella sinh ESBL Tại Ấn Độ, tỷ lệ sinh ESBL lần lượt là 79%, 69,4% và 100% với E coli, K pneumonia và K oxytoca Trong khi đó 55% chủng E coli ở Trung Quốc và 50,8% vi khuẩn này ở Thái Lan sinh . về vi khuẩn sinh β -lactamase phổ rộng được thực hiện tại bệnh vi n. Đó là lý do chúng tôi chọn tên đề tài “ Sàng lọc vi khuẩn sinh beta – lactamase phổ rộng phân lập tại bệnh vi n Đa khoa trung. mức độ kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm sinh ESBL phân lập tại BVĐKTƯ Thái Nguyên. Phát hiện một số gene ESBL ở các chủng vi khuẩn phân lập bằng kỹ thuật multiplex - PCR. 3. NỘI DUNG. bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ KHÁNH LY SÀNG LỌC VI KHUẨN SINH BETA – LACTAMASE PHỔ RỘNG PHÂN LẬP TẠI BỆNH