NGHIÊN CỨU KHOA HỌC KỸ THUẬT Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp, số 1&2/2007 Đại học Nông Lâm Tp. HCM 180 PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN Aeromonas hydrophila TRÊN ẾCH THÁI LAN “Rana tigerina” NUÔI TẠI KHU VỰC VEN ĐÔ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHARACTERIZATION OF BACTERIA ISOLATED FROM FARMED FROG (Rana tigerina) IN PERI – URBAN OF HCM CITY Trần Hồng Thủy Bộ môn Sinh học và Quản lý Nguồn lợi Thủy sản, Khoa Thủy sản Trường Đại học Nông Lâm Tp. HCM ABSTRACT This study was conducted from September 2006 to September 2007 to identify major pathogens, especially bacteria, of diseased frog (Rana tigerina) farmed in the peri –urban area of Ho Chi Minh City. Challenge of cultured frog with Aeromonas hydrophila. That were isolated from diseased frogs with clinical signs of ulcerative syndrome were carried out. Experimental frogs were injected on the vetral left thigh with a variety of bacterial concentrations. Average 18-25g sized frog (Rana tigerina) were stocked at 10 frogs/tank. There were four treatments with triplicate each: control (injected with 0.85% sterile NaCl), 9x10 6 cfu/ml, 9x10 7 cfu/ml, and 9x10 8 cfu/ml for bacterial infection challenges. The mortalities occurred at bacterial concentration of 9x10 6 cfu/ml, 9x10 7 cfu/ ml, and 9x10 8 cfu/ml were 57%, 90% and 100%, respectively. No bacteria were isolated from frogs in the control at the end of experiment. Signs of moribund frogs included light-reddish fluid in the body cavity and haemorrhage on the skin of abdomen and thigh. Aeromonas hydrophila were isolated frog diseased frog in bacterial injection challenge treatments. Those results point out the importance of Aeromonas hydrophila as causal agents of ulcerative syndrome in frog. GIỚI THIỆU Thành Phố Hồ Chí Minh những năm gần đây rộ lên phong trào nuôi ếch với nhiều hình thức nuôi khác nhau. Nguồn ếch giống được nhập về từ Thái Lan. Ếch Thái Lan Rana tigerina vòng đời ngắn, tăng trưởng nhanh và thích hợp với điều kiện nuôi tại khu vực ven đô Thành phố Hồ Chí Minh. Tuy nhiên, song song với sự phát triển nuôi ếch công nghiệp đó là sự gia tăng đáng kể tình hình dòch bệnh làm ếch chết hàng loạt mà không rõ nguyên nhân. Ếch bệnh có những biểu hiện lâm sàng như mệt mỏi bỏ ăn, xuất hiện những vết lở loét trên da và tổn thương ở chân sau, bụng xuất huyết, chân bại liệt, quẹo cổ, mù mắt, sình bụng. tỷ lệ chết lên tới 80-90%. Do thiếu kinh nghiệm trong kỹ thuật nuôi nên dòch bệnh thường xuyên xảy ra, gây thiệt hại lớn về kinh tế cho người dân. Phong trào nuôi ếch có phần chững lại. Theo báo cáo của Viện Nghiên Cứu Sức Khỏe Động Vật Thủy Sản- Thái Lan (AAHRI) năm 1997, 120 loài vi khuẩn phân lập được từ ếch bình thường và ếch bệnh ở các trại thuộc 8 tỉnh của Thái Lan. Những vi khuẩn xác đònh được chủ yếu là vi khuẩn Gram âm như: Aeromonas hydrophila, A.sobria, Pseudomonas…. Một số nghiên cứu khác của Somsiri và ctv,1997, cũng tìm thấy A.hydrophila trên ếch bò bệnh lở loét ở Thái Lan trong quá trình phân lập và đònh danh. Dựa trên những kết quả đã nghiên cứu tại Thái Lan, đồng thời xuất phát từ tình hình thực tế về dòch bệnh trong nước, việc tìm ra nguyên nhân và biện pháp phòng trò bệnh hữu hiệu là yêu cầu cần thiết. Chúng tôi tiến hành “Phân lập và đònh danh vi khuẩn A.hydrophila trên ếch Thái Lan Rana tigerina nuôi tại khu vực ven đô TP.Hồ Chí Minh”. Mục đích của nghiên cứu này là phân lập và đònh danh được vi khuẩn Aeromonas hydrophila trên ếch nuôi bò bệnh đồng thời tiến hành gây cảm nhiễm ngược vi khuẩn A.hydrophila trên ếch nuôi khỏe mạnh để xác đònh xem A.hydrophila có đúng là vi khuẩn gây bệnh lở loét và đỏ chân trên ếch Thái Lan nuôi tại Khu vực ven đô TP.Hồ Chí Minh hay không? Từ đó có hướng nghiên cứu tiếp theo về vấn đề phòng và trò bệnh cho ếch, góp phần duy trì và phát triển nuôi ếch công nghiệp tại khu vực Thành phố Hồ Chí Minh trong thời gian tới. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nội dung Phân lập và đònh danh vi khuẩn A.hydrophila trên mẫu ếch bệnh thu tại khu vực Quận 9, Q. Thủ Đức, huyện Củ Chi, Hóc Môn. Gây cảm nhiễm ngược vi khuẩn A.hydrophila trên ếch giống khỏe mạnh. Phương pháp Phương pháp phân lập và đònh danh vi khuẩn từ ếch nuôi bò bệnh theo phương pháp truyền thống của Bergey NGHIÊN CỨU KHOA HỌC KỸ THUẬT Đại học Nông Lâm Tp. HCM Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp, số 1&2/2007 181 - Thu mẫu ếch bệnh từ một số trại nuôi tại khu vực nghiên cứu. Thu mẫu vào các thời điểm xảy ra dòch bệnh và thu mẫu đònh kỳ mỗi tháng một lần, từ tháng 9/2006 đến tháng 9/2007. - Tiến hành giải phẫu ếch bệnh thu mẫu máu, gan, lách, thận. tụy nuôi cấy trên môi trường NA (Nutrien Agar). Ủ ở 37 o C trong thời gian từ 18-24 giờ. Chọn khuẩn lạc riêng lẻ phân lập, cấy truyền, làm thuần tăng sinh sau đó nhuộm gram, thử các phản ứng sinh hóa, đònh danh bằng bộ kit API- 20E (BioMerieus, Pháp). Sau khi phân lập được vi khuẩn Aeromonas hydrophila chúng tôi tiến hành gây cảm nhiễm lên ếch giống khỏe mạnh. Nếu vi khuẩn thu được từ ếch bò bệnh nhân tạo (với dấu hiệu bệnh lý tương tự) là vi khuẩn phân lập được từ mẫu ếch bệnh ngoài hiện trường thì kết luận vi khuẩn đó chính là tác nhân gây bệnh. Phương pháp gây bệnh thực nghiệm Chúng tôi tiến hành gây cảm nhiễm ngược vi khuẩn A.hydrophila phân lập được từ ếch bệnh ngoài hiện trường lên ếch giống khỏe mạnh có trọng lượng từ 18-25g/con. trong thời gian 14 ngày. Thí nghiệm gồm: nghiệm thức đối chứng, nghiệm thức có mật độ vi khuẩn 9x10 6 cfu/ml, 9x10 7 cfu/ml và 9x10 8 cfu/ml. mỗi nghiệm thức được lập lại 3 lần. Mật độ Ếch thí nghiệm 10con/bể (kích thước bể 30cm x 40cm x 35cm). Liều gây bệnh: Tiêm vào cơ đùi mỗi ếch 0,1ml huyền dòch vi khuẩn. Lô đối chứng mỗi ếch được tiêm 0,1 ml nước muối sinh lý. Trong quá trình bố trí thí nghiệm ếch ở tất cả các lô thí nghiệm được chăm sóc như nhau. Theo dõi các biểu hiện bất thường của ếch, thu mẫu ếch chết hoặc có biểu hiện bệnh, yếu. Tiến hành mổ, phân lập đònh danh những ếch bệnh và những ếch còn sống sót sau thời gian kết thúc thí nghiệm. Sơ đồ khái quát quá trình thực hiện Ếch be ä nh Giải p hẫu Thu mẫu (Máu, Gan, Tụy, thận, dòch bụng) Nuôi cấy trên môi trường thạch NA (Nutrient Agar) Ủ ở 37 o C thời gian 18-24 giờ Phân lập vi khuẩn (chọn khuẩn lạc riêng lẻ) Giữ giống Thử các phản ứng sinh hóa (Oxidease, catalase, di động) Nhuộm gram Q uan sát hình thái vi khuẩn Đònh danh vi khuẩn Gây bệnh thực nghiệ m Làm thuần NGHIÊN CỨU KHOA HỌC KỸ THUẬT Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp, số 1&2/2007 Đại học Nông Lâm Tp. HCM 182 KẾT QUẢ THẢO LUẬN Kết quả phân lập vi khuẩn từ ếch bệnh thu ngoài hiện trường Sau khi thu mẫu ếch bệnh từ các trại thuộc khu vực nghiên cứu, chúng tôi tiến hành phân lập 145 mẫu vi khuẩn từ các cơ quan như: Máu tim, Gan, Lách, tụy, Thận, dòch bụng. Kết quả đònh danh như sau: 45 mẫu A.hydrophila, 68 mẫu (bao gồm 14 giống vi khuẩn) như: Chryseobacterium indologenes, Salmonella choleraesuis ssp/arizonal, Vibrio, Pasteurella pneumotropica, Pseudomonas flurescens/putida, Enterobacteria, Citrobacter freundii ….32 mẫu chưa đònh danh được.(Biểu đồ 1). Từ kết quả đònh danh vi khuẩn thu được trên ếch bệnh ngoài hiện trường, kết hợp với các kết quả nghiên cứu trước đây của Viện Nghiên Cứu Sức Khỏe Động Vật Thủy Sản-Thái Lan (AAHRI) năm 1997; Somsiri và ctv,1996. Chúng tôi chọn A.hydrophila tiến hành gây cảm nhiễm ngược lên ếch khỏe mạnh. Kết quả gây cảm nhiễm ngược Sau khi tiến hành gây bệnh thực nghiệm vi khuẩn A.hydrophila trên ếch giống khỏe mạnh có trọng lượng từ 18-25g, trong thời gian 14 ngày. Kết quả cho thấy: Sau 8 giờ kể từ khi bắt đầu tiêm vi khuẩn, ở nghiệm thức có mật độ vi khuẩn là 9x10 8 cfu/ml: ếch có biểu hiện mệt mỏi bất động không ăn và bắt đầu có ếch bò chết Sau 10 giờ kể từ khi bắt đầu tiêm vi khuẩn, ếch ở nghiệm thức có mật độ vi khuẩn 9x10 7 cfu/ml cũng bắt đầu chết rải rác và sau 12 giờ thì ếch ở nghiệm thức có mật độ vi khuẩn 9x10 6 cfu/ml bắt đầu chết. Ếch chết cơ thể bò tích nước, xuất huyết dưới da, tuột nhớt, tại vết tiêm ở đùi sau cơ bò hoại tử. Biểu đồ 1. Tỷ lệ % vi khuẩn đònh danh được từ ếch bệnh ngoài hiện trường Chưa đònh danh được 22% Các loài VK khác 47% A eromonas hydrophil a 31% NGHIÊN CỨU KHOA HỌC KỸ THUẬT Đại học Nông Lâm Tp. HCM Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp, số 1&2/2007 183 Hình 1. Ếch bò bệnh sau khi tiêm vi khuẩn Aeromonas hydrophila Biểu đồ 3. Tỷ lệ sống của ếch Sau thời gian gây cảm nhiễm ngược 87% 43% 10% 0% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 9x106cfu/ml 9x107cfu/ml 9x108cfu/ml Nồng độ vi khuẩn (cfu/ml) Đối chứn g Tỷ lệ ếch còn sống sau TN (%) Chúng tôi tiến hành mổ, phân lập, đònh danh 85 mẫu vi khuẩn tại một số cơ quan như: Dòch ứ trong khoang bụng, gan, lách, thận, cơ và máu tim. Kết quả ghi nhận được như sau: 52 mẫu là A.hydrophila chiếm 61,17%, 21 mẫu là các vi khuẩn khác (Seratia liquefaciens, Chyseomonas luteola, Enterobacter, Salmonella arizonae, Escherichia coli Pasteurella…). (Biểu đồ 2). Tiếp tục theo dõi thí nghiệm, sau 2 ngày Ếch ở nghiệm thức tiêm nồng độ vi khuẩn 9x10 8 cfu/ml chết 100%. Sau 5 ngày tất cả những ếch còn sống quan sát thấy tại vết tiêm có hiện tượng lở loét, hoại tử. Một số ếch có hiện tượng lở loét trên da và tứ chi. Mổ quan sát nội tạng ếch chết, yếu thấy gan, lách, thận có hiện tượng mủ trắng. Tuy nhiên 10 ngày sau khi tiêm, những ếch còn sống sót tại vết tiêm có hiện tượng khép miệng, và kết thúc thí nghiệm những ếch còn sống vết thương đã lành, ếch ăn bình thường. Sau 14 ngày theo dõi thí nghiệm, chúng tôi ghi nhận kết quả: sau 24 giờ ếch ở nghiệm thức có nồng độ vi khuẩn 9x10 8 cfu/ml ếch chết 100%. ở nghiệm thức có nồng độ vi khuẩn 9x10 7 cfu/ml sau 14 ngày ếch chết 90%. Ở nghiệm thức có nồng độ vi khuẩn 9x10 6 cfu/ml ếch chết 57%. Nghiệm thức đối chứng 13%. Biểu đồ 3 cho thấy tỷ lệ ếch còn sống sót sau thời gian bố trí thí nghiệm. Chúng tôi tiến hành mổ tất cả những ếch còn sống sau 14 ngày, phân lập, đònh danh kết quả cho thấy: Nghiệm thức đối chứng mổ 26 ếch (87%), không có sự hiện diện của vi khuẩn A.hydrophila. Nghiệm thức có nồng độ vi khuẩn 9x10 6 cfu/ml số ếch sống sót 13 ếch (43%) quan sát ngoài thấy bình thường. Mổ quan sát nội tạng tất cả các ếch gan, lách, thận đều bò mủ. Tuy nhiên, không làm ếch chết. NGHIÊN CỨU KHOA HỌC KỸ THUẬT Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp, số 1&2/2007 Đại học Nông Lâm Tp. HCM 184 Nghiệm thức có nồng độ vi khuẩn 9x10 7 cfu/ml số ếch sống sót 03 ếch(10%). Quan sát bên ngoài một số ếch vết thương đã khép miệng nhưng chưa hoàn toàn lành (hình 3), mổ nội tạng các cơ quan đều bò mủ. Vi khuẩn đònh danh vẫn có sự hiện diện của A.hydrophila nhưng ít hơn kết quả đònh danh ban đầu. Từ kết quả ghi nhận được sau thời gian thí nghiệm, chúng tôi đưa ra kết luận A.hydrophila chính là một trong số những vi khuẩn gây bệnh lở loét trên êch nuôi tại khu vực ven đô thành phố Hồ Chí Minh. Kết quả này cũng giống với kết quả nghiên cứu của Somsiri và ctv (1997), khi gây cảm nhiễm ngược trên ếch Thái Lan với A.hydrophila và A.sobria thì triệu chứng lâm sàng trên ếch phù hợp với biểu hiện ban đầu khi phân lập 2 loài vi khuẩn này. Gibbs,(1973) cũng cho rằng A.hydrophila được xem là nguyên nhân gây nên triệu chứng lở loét và tỷ lệ chết cao đối với ếch trong điều kiện phòng thí nghiệm. KẾT LUẬN A.hydro phila là vi khuẩn chiếm ưu thế trong quá trình phân lập được từ ếch bệnh lở loét ngoài hiện trường. Sau khi gây bệnh thực nghiệm, vi khuẩn thu được từ ếch bò bệnh thực nghiệm cũng chính là vi khuẩn khi tiêm vào ếch khỏe. Ếch có các biểu hiện tương tự ếch bệnh ngoài hiện trường. A.hydrophila chính là một trong số vi khuẩn gây bệnh lở loét trên ếch Thái Lan nuôi tại khu vực ven đô Thành phố Hồ Chí Minh. Kết quả thu được tương tự kết quả nghiên cứu bệnh trên ếch Thái Lan của Somsiri và ctv năm 1997 ở Thái Lan. Hình 2. Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn A.hydrophila phân lập từ ếch bệnh Hình 3. A.hydrophila gây hoại tử cơ đùi ếch NGHIÊN CỨU KHOA HỌC KỸ THUẬT Đại học Nông Lâm Tp. HCM Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp, số 1&2/2007 185 TÀI LIỆU THAM KHẢO Temdoung Somsiri., Supranee Chinabut and Suriyan Soontornvit, 1996. Challenge of cultured frogs (Rana tigerina) with Aeromonas spp. In Proceedings of World Aquaculture,1996. The 1996 Annual Meeting of the World Aquaculture Society. Kanchanakhan. S., 1998. An ulcerative disease of the cultured Tiger Frog, Rana tigerina, in Thailand: Virological Exammination. AAHRI Newsletter Article Vol. 7(2). Temdoung Somsiri. Diseases of cultured frogs in Thailan. Aquatic Animal Health Research Institute Department of Fisheries Jatujak Bangkok 10900. Kantimanee Panwichien and Supranee Chinabut, 1997. Somsiri T., S. Chinabut, and S. Soontornvit, 1997. Challenge of cultured frogs (Rana tigerina) with Aeromonas Species. In: T.W Flegel and I.H. MacRae (eds.), Diseases in Asian Aquaculture III. Fish Health Section, Asian Fisheries Society, Manila. Viện nghiên cứu nuôi trồng Thủy Sản II, 1992. Bài giảng về bệnh cá tôm. Bộ Thủy Sản. Viện nghiên cứu nuôi trồng Thủy Sản II, 1992. Các bài thực hành nghiên cứu và chuẩn đoán bệnh Cá- Tôm. Bộ Thủy Sản. Lê Thanh Hùng, 2000. Kỹ thuật nuôi công nghiệp ếch Thái Lan (Rana rugulosa). Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. . chí KHKT Nông Lâm nghiệp, số 1&2/2007 Đại học Nông Lâm Tp. HCM 180 PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHU N Aeromonas hydrophila TRÊN ẾCH THÁI LAN “Rana tigerina” NUÔI TẠI KHU VỰC VEN ĐÔ THÀNH PHỐ. khu vực ven đô TP .Hồ Chí Minh . Mục đích của nghiên cứu này là phân lập và đònh danh được vi khu n Aeromonas hydrophila trên ếch nuôi bò bệnh đồng thời tiến hành gây cảm nhiễm ngược vi khu n A .hydrophila. bệnh lở loét trên ếch Thái Lan nuôi tại khu vực ven đô Thành phố Hồ Chí Minh. Kết quả thu được tương tự kết quả nghiên cứu bệnh trên ếch Thái Lan của Somsiri và ctv năm 1997 ở Thái Lan. Hình