2.3. Nhân gene và kỹ thuật giải trình tự ADN. Kỹ thuật lai ADN đã được sử dụng rộng rãi cho các nghiên cứu xác định typ của nhiều đối tượng vi sinh vật. Nguồn ADN đích đôi khi chỉ có số lượng ít trừ khi các tiến hành nuôi cấy vi sinh vật. Trong một số trường hợp việc nuôi cấy không thể thực hiện được với nhiều loài vi sinh vật hay virút hoặc trong các trường hợp khác cần thời gian dài nuôi cấy vi sinh vật để có đủ ADN cho các kỹ thuật lai hay định typ. Khó khăn này được khắc phục bằng cách làm tăng nguồn ADN đích một cách nhanh chóng bằng kỹ thuật nhân gene PCR. a. Kỹ thuật nhân gene PCR (Polymerase Chain Reaction) Việc nhân ADN cho phép làm tăng số lượng gấp hàng triệu hoặc nhiều hơn nữa đối với đoạn ADN hay ARN nghiên cứu. Có nhiều phương pháp khác nhau để phân tích nguồn ADN khuyếch đại theo cách này. Phương pháp đơn giản nhất là sử dụng điện di để xác định kích thước sản phẩm của phản ứng PCR. Có thể xác định độ nhạy và tính đặc hiệu cao hơn nếu sản phẩm PCR được lai với mẫu dò đặc hiệu đã được đánh dấu. Phương pháp đưa lại thông tin nhiều nhất là xác định được trình tự ADN và ARN của sản phẩm PCR. Việc xác định được sai khác của chuỗi ADN sẽ cho phép xác định và định typ chính xác nhất các đối tượng vi sinh vật nghiên cứu. Kết quả xác định trình tự ADN còn cho phép xác định mối liên hệ tiến hoá và dịch tễ học của các chủng vi sinh vật. - Đôi nét về phản ứng chuỗi PCR: Phản ứng chuỗi PCR nhằm khuyếch đại ADN lần đầu tiên được Saki (1985) giới thiệu và đây được coi là một trong những tiến bộ khoa học quan trọng nhất về sinh học trong thập kỷ 80. Phản ứng PCR sử dụng enzym chịu nhiệt tạo ra nhiều phiên bản theo hàm số mũ. Có thể ví dụ, chỉ cần 1 sợi ADN sau vài giờ có thể nhân lên 10 11 phiên bản ADN tương đương với 100 ng ADN. Sau khi thực hiện phản ứng PCR thì cần tiến hành một số kỹ thuật để xác định sản phẩm, đơn giản nhất là điện di và xác định kích thước của sản phẩm PCR. Trong các nghiên cứu chẩn đoán thì kết quả này rất có ý nghĩa, nó chứng tỏ sự có mặt của ADN đích trong mẫu nghiên cứu. Có thể nhận được tính đặc hiệu và độ nhạy cao hơn khi sử dụng kỹ thuật RFLP với sản phẩm PCR hoặc lai với mẫu dò đặc hiệu. Tuy nhiên, thông tin đầy đủ nhất vẫn là kết quả xác định trình tự ADN của sản phẩm PCR. Ngay từ khi được giới thiệu thì PCR đã được xem là phương pháp đưa lại kết quả khá nhạy trong việc xác định và phát hiện vi sinh vật. Tính ưu việt của nó thể hiện ở chỗ có thể chỉ cần một hạt virus hay một tế bào vi khuẩn nào đó cũng đủ cho phản ứng xảy ra và khuyếch đại tới mức có thể phát hiện được trong thời gian ngắn. Kỹ thuật PCR còn được dùng để nhân ADN từ khuôn RNA sau khi đã được chuyển thành cDNA sau phản ứng phiên mã ngược (RT). Phương pháp này nhanh chóng được chú ý và trở lên phổ biến cho các nghiên cứu phát hiện vi khuẩn hay virus ở nồng độ thấp trong các mẫu môi trường và bệnh phẩm. Ví dụ việc phát hiện mẫu máu nhiễm HIV có nghĩa là phát hiện phần nhỏ ADN của virus trong hệ gene người có kích thước gấp 100 000 lần. Mặt khác khi dùng kỹ thuật miễn dịch với kháng thể thì phải cần tới 8 ngày mới có đáp ứng miễn dịch trong máu, trong khi đó với kỹ thuật PCR thì toàn bộ quy trình phát hiện chỉ mất vài giờ (đối với nguồn ADN hay RNA). Lợi thế của kỹ thuật PCR được tận dụng cho việc chuẩn bị ADN làm mẫu dò với số lượng lớn cho các phép lai ADN đã trình bày ở trên. Các mẫu dò có thể được đánh dấu bằng phóng xạ hay phi phóng xạ khi tiến hành phản ứng khuyếch đại. Mẫu dò đánh dấu với kỹ thuật PCR có ưu thế hơn các phương pháp đánh dấu truyền thống bằng kỹ thuật tổng hợp các mạch đứt gãy (nick translation) hay đánh dấu với mồi ngẫu nhiên (rADN random primer labeling). Các ưu thế này có thể kể đến, cụ thể như là cần lượng nhỏ sợi ADN khuôn, có thể tiến hành đánh dấu với các mẫu dò có kích thước ngắn, chuẩn bị mẫu dò không cần tinh sạch ADN khuôn. Bảng 1.7. dưới đây liệt kê một số ví dụ ứng dụng kỹ thuật PCR cho phát hiện nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau. Rất nhiều các kết quả nghiên cứu như vậy được trình bày trong các tạp chí chuyên ngành như: ành như: ành như: ành như: Journal of Clinical Microbiology, Applied Environmental Microbiology. Bảng 1.7. Một số ví dụ về ứng dụng kỹ thuật PCR trong xác định vi sinh vât. Vi sinh vật Tài liệu Acanthamoeba sp Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi Brucella sp Candida albicans Carnobacterium spp Vokin et al (1992) Houard et al (1989) Marconi ADN Garon (1992) Chlamydia trachomatis Clostridium difficile Coxiella burneti Cryptosporidium parvum Cytomegalovirus Dengue virus Epstein-barr virus Erwinia amylovora Escherichia coli Frankia spp Gaeumannomyces spp Herman an Derider (1992) Miyakawa et al (1992) Brook et al (1992) Hayes et al (1992) Gumerlock et al (1991) Stein an Raoult (1992) Laxer et al [...]...Helicobacter pylori (1991) Hepatitis C virus Gozlan et al (1991) Human immunodeficiency virus (HIV) Henchal et al (1991) Leptospira spp Samoszuk (1991) Litsteria monocytogenees Bereswill etal (1992) Luteovirus Jackson (1992) Influenza virus Mycobacterium leprae Mycobacterium tuberculosis Simonet et al (1990) Henson (1992) Neisseria meningitis Claton et al (1992) Papillomavirus Parvovirus Plsmodium falciparum Pneumocystis... carini Okamoto et al (1992) Dawood et al (1992) Polio virus Claas et al (1992) Pseudomonas solanacearum Merien et al (1992) Rickettsia spp Niederhauser et al (1992) Rotavirus Salmonella spp Staphylococcus spp Robertson et al (1991) Hackel et al Toxoplasma gondii (1990) Treponema pallidum Altamirano et al (1992) Trichomonas vaginalis Trypanosoma cruzi Vibrio vulnificus Yersinia Maiden et al(1992) Charlotte . tượng vi sinh vật. Nguồn ADN đích đôi khi chỉ có số lượng ít trừ khi các tiến hành nuôi cấy vi sinh vật. Trong một số trường hợp vi c nuôi cấy không thể thực hiện được với nhiều loài vi sinh. pháp đưa lại kết quả khá nhạy trong vi c xác định và phát hiện vi sinh vật. Tính ưu vi t của nó thể hiện ở chỗ có thể chỉ cần một hạt virus hay một tế bào vi khuẩn nào đó cũng đủ cho phản ứng. loài vi sinh vật hay virút hoặc trong các trường hợp khác cần thời gian dài nuôi cấy vi sinh vật để có đủ ADN cho các kỹ thuật lai hay định typ. Khó khăn này được khắc phục bằng cách làm