_____________________________________________________________Phương pháp miễn dòch đònh lượng MỤC LỤC I/ MỤC LỤC trang 1 II/ ĐẶT VẤN ĐỀ trang 2 III/ DANH MỤC MỘT SỐ TỪ NGỮ VIẾT TẮT trang 2 IV/ NỘI DUNG trang 3 A . PHẢN ỨNG KHÁNG NGUYÊN - KHÁNG THỂ trang 3 1/ Kháng nguyên: Đònh nghóa – Tính đặc hiệu – Tính sinh miễn dòch 2/ Kháng thể: Đònh nghóa – Phân loại . 3/ Nguyên tắc phản ứng kháng nguyên – kháng thể. B . KỸ THUẬT ĐỊNH LƯNG trang 6 1/ Kỹ thuật cạnh tranh 2/ Kỹ thuật không cạnh tranh C . CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯNG trang 8 1/ Miễn dòch ngưng kết (agglutination) trang 9 2/ Miễn dòch kết tủa (precipitation) trang 10 3/ Miễn dòch men (ELISA: enzyme linked immuno sorbent assay) trang 11 4/ Miễn dòch vi hạt (MEIA: micro-partide enzyme immuno assay) trang 13 5/ Miễn dòch huỳnh quang (FIA: fluoro immuno assay) trang 14 6/ Miễn dòch phóng xạ (RIA: radio immuno assay) trang 15 7/ Miễn dòch hóa phát quang (chemiluminescense immuno assay) trang 16  Hóa phát quang trực tiếp (DCLIA: direct-chemiluminescense immuno assay)  Điện hóa phát quang (ECLIA: electro-chemilumminescense immuno assay) V/ MỘT SỐ XN ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP MD ĐỊNH LƯNG trang 18 VI/ KẾT LUẬN trang 19 VII/ TÀI LIỆU THAM KHẢO trang 19 1 _____________________________________________________________Phương pháp miễn dòch đònh lượng ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, có nhiều kỹ thuật đònh lượng miễn dòch mới được nghiên cứu và ứng dụng vào việc chẩn đoán và điều trò, nhất là các bệnh lý ác tính. Vấn đề là người làm xét nghiệm phải nắm vững các phương pháp kỹ thuật để thực hiện, cho ra những kết quả thật chính xác và các thầy thuốc sử dụng thật hiệu quả các xét nghiệm trong chẩn đoán và điều trò cho bệnh nhân. Trong phạm vi chuyên đề, chúng tôi chỉ giới thiệu một số kỹ thuật hiện đang áp dụng tại TPHCM và các tỉnh thành lân cận dựa trên các nguyên tắc và phương pháp đònh lượng trong xét nghiệm MD cũng như một số loại máy móc trang thiết bò được sử dụng trong lónh vực này. MỘT SỐ TỪ NGỮ VIẾT TẮT KN : Kháng nguyên KT : Kháng thể MD : Miễn dòch HT : Huyết thanh HC : Hồng cầu 2 _____________________________________________________________Phương pháp miễn dòch đònh lượng NỘI DUNG A/ PHẢN ỨNG KHÁNG NGUYÊN KHÁNG THỂ I .KHÁNG NGUYÊN 1. Đònh nghóa : KN là một vật lạ đối với cơ thể mà khi tiếp xúc với hệ MD của cơ thể đó sẽ kích thích tạo nên MD đặc hiệu chống lại KN đó. 2. Tính đặc hiệu : Tính đặc hiệu của KN là do những quyết đònh KN, gọi là epitope, nằm trên bề mặt của KN tạo thành. Một KN có thể có nhiều loại epitope, như vậy có thể có nhiều MD đặc hiệu chống lại nó. Ví dụ: KN A có 3 epitope: a , b , c . Khi tiếp xúc với hệ MD một cơ thể sẽ kích thích tạo nên 3 MD đặc hiệu chống lại nó, đó là MD đặc hiệu chống lại epitope a (αa); MD đặc hiệu chống lại epitope b (αb); MD đặc hiệu chống lại epitope c (αc). 3 Kháng nguyên A αc αa αb Hình 01 : Một KN với nhiều loại epitope sẽ tạo được nhiều MD đặc hiệu _____________________________________________________________Phương pháp miễn dòch đònh lượng 3. Điều kiện để sinh miễn dòch của kháng nguyên :  Trọng lượng phân tử (MW: Molecolar Weight): Trọng lượng phân tử tối thiểu là khoảng 10.000 Dalton.Trọng lượng phân tử càng lớn tính sinh MD càng mạnh.  Cấu trúc phân tử: Cấu trúc phân tử càng phức tạp, tính sinh MD càng mạnh. Xếp theo tính sinh MD từ mạnh đến yếu: mạnh nhất là protein; đến các KN có protein như gluco-protein, lipo-protein, nucleo-protein; kém nhất là polysaccharide. Lipid, AND, ARN không sinh MD.  Tính lạ đối với cơ thể: một KN muốn sinh MD thì ít nhất KN đó phải mang một epitope lạ đối với cơ thể. II . KHÁNG THỂ Kháng thể có bản chất hóa học là globulin, nên còn gọi là các globulin miễn dòch (Ig). Cấu trúc cơ bản của KT gồm hai chuỗi nặng H (heavy chain) và hai chuỗi nhẹ L (light chain), có trọng lượng phân tử là 50.000 và 25.000, nối với nhau bằng cầu nối di-sulfur. KT có hai đầu, một đầu gọi là Fab kết hợp đặc hiệu với một epitope KN, một đầu gọi là Fc , là thành phần có thể tinh hóa được. Về tính sinh KN, chuỗi L mang KN kappa (k), hoặc lamda (λ), nghóa là trên một phân tử KT chuỗi L chỉ có thể là kappa hoặc lamda, chứ không thể vừa là kappa vừa là lam da. Chuỗi H thì tùy loại KT mà có thể là γ , µ , α , δ , ε Có 5 loại KT mang tên theo (theo tên KN chuỗi H): IgG (γ), IgM (µ), IgA (α),IgD (δ), và IgE (ε). 4 H H H H L L Fab Fab Fc Hình 02: Cấu trúc cơ bản của một phân tử kháng thể. _____________________________________________________________Phương pháp miễn dòch đònh lượng III . NGUYÊN TẮC PHẢN ỨNG KHÁNG NGUYÊN – KHÁNG THỂ Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng đặc hiệu giữa KN và KT. + Đối với KN hữu hình : Kết quả phản ứng quan sát được bằng sự ngưng kết (Agglutination) giữa KN và KT. + Đối với các KN hòa tan: Kết quả phản ứng quan sát được bằng : 1.Tạo KN hay KT hữu hình bằng cách gắn KN hay KT vào HC hay hạt latex, ở đây HC hay hạt latex chỉ là cái giá cho KN.Khi KN có hình thù , phản ứng ngưng kết sẽ xảy ra. 2.Hiện tượng kết tủa (Precipitation) của phức hợp KN-KT. Hiện tượng xảy ra khi một KN hòa tan tiếp xúc với KT trực tiếp chống lại nó. Một kết tủa được hình thành có thể thấy được bằng mắt thường. Quan sát hay đo lường được bằng máy. 3.Dùng kỹ thuật đánh dấu KN hoặc KT :  Các chất đồng vò phóng xạ như : I 125 , Co 63 …  Các thuốc nhuộm huỳnh quang như: Fluorescein isothiocyanat (xanh lục), rodamin (đỏ gạch)…  Các enzym như peroxydaza, glucoza-oxydaza… 5 _____________________________________________________________Phương pháp miễn dòch đònh lượng B . KỸ THUẬT ĐỊNH LƯNG I/ Đối với các KN hữu hình (phản ứng ngưng kết): chủ yếu là bán đònh lượng bằng cách pha loãng theo tuần tự II/ Đối với hệ thống kháng nguyên-kháng thể hòa tan: • Bằng cách đo độ đục của phức hợp KN-KT • Bằng kỹ thuật “cạnh tranh” và “không cạnh tranh” 1.Kỹ thuật cạnh tranh a)Nguyên tắc : KN không đánh dấu cạnh tranh với KN có đánh dấu, kết hợp với KT. b)Phản ứng có hai giai đoạn: + Giai đoạn 1: Trong một dãy ống cho vào các thành phần:  KN đã đánh dấu với lượng bằng nhau  KN không đánh dấu với lượng tăng dần  KT kháng KN với lượng bằng nhau + Giai doạn 2: Tách phần KN (gồm KN đánh dấu và KN không đánh dấu) đã gắn KT và KN chưa gắn KT.  Đo hoạt tính phóng xạ của phần KN đã gắn KT (B)  Đo hoạt tính phóng xạ của phần KN chưa gắn KT (F)  Xác lập tỉ số B/F và vẽ đồ thò chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa các tỉ số này với nồng độ của KN không đánh dấu cho vào mỗi ống.  Tỉ số B/F tỉ lệ nghòch với nồng độ KN không đánh dấu. Yêu cầu của phản ứng này là KT phải có tính đặc hiệu cao, KN dùng xác lập đồ thò tương quan chuẩn phải rất tinh khiết, kháng nguyên không mất hoạt tính sinh học sau khi đánh dấu. 6 _____________________________________________________________Phương pháp miễn dòch đònh lượng 2.Kỹ thuật không cạnh tranh a)Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi trong đònh lượng KN hoặc KT bằng phương pháp MD b)Các bước thực hiện + Gắn KN (hay KT) lên pha rắn, rửa loại bỏ KN (hoặc KT) không gắn. + Cho HT bệnh nhân, nếu có KT (hay KN),sẽ gắnđặc hiệu với KN (hay KT).Rửa bỏ chất thừa, cặn. + Cho HT có kháng KT (hay kháng KN) đã đánh dấu với đồng vò phóng xạ hay enzym.Trong bước này sẽ xảy ra sự kết hợp giữa kháng KT (hay kháng KN) đánh dấu với KT (hay KN). Rửa loại bỏ kháng KT (hay kháng KN) thừa.Nếu kháng KT (hay kháng KN) được đánh dấu bằng đồng vò phóng xạ thì sau đó đo lường hoạt tính phóng xạ, nếu đánhdấu bằng enzym thì dùng phản ứng sinh màu và đo bằng quang phổ kế. 7 _____________________________________________________________Phương pháp miễn dòch đònh lượng C.CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯNG ĐỀ CẬP TRONG CHUYÊN ĐỀ 1.Miễn dòch ngưng kết (agglutination): Dựa trên nguyên tắc kết hợp KN và KT, dùng hạt latex hay HC làm nền phản ứng.Bản chất của phương pháp này là đònh tính và suy luận bán đònh lượng bằng cách pha loãng tuần tự. 2.Miễn dòch kết tủa (precipitation): Dựa trên nguyên tắc kết hợp KN và KT tạo kết tủa trong môi trường thích hợp (như polyethylene glycol), nếu lượng KT quá nhiều sẽ tạo thành độ đục và đo ở bước sóng UV (340nm). 3.Miễn dòch men (ELISA: enzyme linked immuno sorbent assay) : Dựa trên nguyên tắc kết hợp KN và KT và phát hiện (đònh lượng ) bằng chất đánh dấu là một enzyme (vd: peroxidaza). Đây là phương pháp được áp dụng rộng rãi nhất hiện nay. 4.Miễn dòch vi hạt: (MEIA: micro-particle enzyme immuno assay): phương pháp cải tiến dựa trên ELISA. 5.Miễn dòch huỳnh quang (FIA: fluoro immuno assay): Dựa trên nguyên tắc kết hợp KN và KT và phát hiện (đònh lượng ) bằng chất đánh dấu là một chất phát huỳnh quang. Phát hiện chất đo dựa trên môt quang kế huỳnh quang (fluorometer). 6.Miễn dòch phóng xạ (RIA: radio immuno assay): Dựa trên nguyên tắc kết hợp KN và KT và phát hiện (đònh lượng) bằng chất đánh dấu là một chất phóng xạ (đồng vò phóng xạ của một nguyên tố như I 125 hay Co 63 ).Phát hiện chất đo dựa trên một máy đếm phóng xạ (Geiger meter) 7.Miễn dòch hóa phát quang (chemiluminescanse immuno assay): Dựa trên nguyên tắc kết hợp KN và KT và phát hiện (đònh lượng) bằng chất đánh dấu là một chất phát quang ; phát hiện chất đo dụa trên một ống nhân quang (luminometer). Ưu điểm của phương pháp này là có độ nhạy khát tốt, phản ứng xảy ra nhanh (9-15 phút),dễ áp dụngtự động hóa xử lý hằng loạt.Dự trên phương pháp kích hoạt phát quang, mhóm này được chia ra 2 nhóm phụ: -Hóa phát quang trực tiếp (DCLIA: Direct-chemiluminescense immuno assay) kích hoạt phát quang bằng cách thay đổi pH môi trường từ acide sang kiềm. -Điện hóa phát quang (ECLIA: Electro-chemiluminescense immuno assay) kích hoạt phát quang bằng cách tạo điện áp trong dung dòch phản ứng. 8 _____________________________________________________________Phương pháp miễn dòch đònh lượng I. Thử nghiệm ngưng kết hạt latex trên lam kính để đònh tính và bán đònh lượng antistreptolysin O (ASO) trong HT (Latex agglutination slide test) Những hạt latex polystyrene phủ KN streptolysin O đã được ổn đònh, những KN này sẽ phản ứng MD với những KT kháng stretolysin O thích ứng trong mẫu HT bệnh nhân hoặc HT kiểm chứng. Phản ứng dương tính: khi có sự ngưng kết rõ ràng của các hạt latex trong các ô trên tấm nhựa. Phản ứng âm tính: tạo một huyền đòch lợn cợn, không có sự ngưng kết sau 2 phút. Thử nghiệm bán đònh lượng bằng cách pha loãng với dung dòch đậm glycin NaCl với tỷ lệ 1/ 2, 1/ 3, 1/ 4, 1/ 5,…đọc độ pha loãng cuối cùng còn có sự ngưng kết. Kết quả : 200 IU/ml x độ pha loãng. Giá trò chẩn đoán: Hiệu giá ASO tăng có liên quan đến sốt thấp khớp (Rheumatoid fever) và viêm cầu thận. Hiệu giá ASO tăng cao hơn 200 IU/ml trong trường hợp nhiễm Stertococcus cấp. Hiệu giá ASO nên được theo dõi 2 tuần / lần trong 4-6 tháng. 9 _____________________________________________________________Phương pháp miễn dòch đònh lượng II.Miễn dòch ngưng kết độ đục (immuno- turbidity) Phương pháp này phù hợp cho các cơ chất có trọng lượng phân tử không quá nhỏ như: α-1 anti Trypsine, α-1 acid glycoprotein, Apo A 1 , Apo B, C 3 , C 4 , CRP, Feritin, IgA, IgG, IgM, Microalbumine, Tranferine… Độ nhạy tiêu biểu của kỹ thuật này là 1 đến 20 mg/dl cơ chất đo. Kỹ thuật: thuốc thử là 1 huyền trọc KT trong dung môi có polyethylene glycol, phản ứng xảy ra khi trộn đều với mẫu thử và ủ 10-20 phút ở nhiệt độ PTN hay 37 o C, và đo độ hấp thu quang ở bước sóng 334,340 hay 365 nm. Đường cong chuẩn được xác lập bằng cách đo 5-7 nồng độ chuẩn. Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, chỉ cần trang bò máy quang phổ kế đo được bước sóng 340 nm và ủ nhiệt ở 37 o C. Khuyết điểm là chỉ hạn chế trong 1 số thử nghiệm cho phép mà thôi, và độ nhạy của cơ chất phát hiện khá thấp. 10 [...]... ePhoton (620nm) [Ru(bpy)32+] 17 _Phương pháp miễn dòch đònh lượng D SƠ LÏC ỨNG DỤNG MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH ĐỊNH LƯNG PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH Miễn dòch ngưng kết độ đục Các hệ thống máy Sinh hóa tự động CÁC XÉT NGHIỆM ĐỊNH LƯNG Apo A1 , Apo B , C3 , C4 , CRP, Ferritin IgA, IgG, IgM, Microalbumin… và bán tự động Miễn dòch men (ELISA, MEIA) Các hệ thống ELISA thủ công • Các... _Phương pháp miễn dòch đònh lượng VI Miễn dòch phóng xạ (RIA: radio immuno assay) Kỹ thuật thực hiện bao gồm các giai đoạn cơ bản như kỹ thuật ELISA, ngoại trừ 2 điểm sau: Chất đánh dấu là một đồng vò phóng xạ của một nguyên tố như I 125 hay Co63 Phát hiện (đònh lượng) chất đo bằng một máy đếm phóng xạ (Geiger Meter) Trong thực tế, phương pháp này có độ nhạy tốt, nhưng... so sánh với MD men: phân tử Acridinium ester có trọng lượng phân tử nhỏ (480), nhỏ hơn đáng kể khi so sánh với kỹ thuật EIA 16 _Phương pháp miễn dòch đònh lượng (Alkaline phosphatase có trọng lượng 68.000) gia tăng khả năng thâm nhập vào cơ chất và giảm thiểu hiệu ứng che lấp vò trí gắn kết (binding site) KN-KT VIII .Miễn dòch Điện hóa phát quang (ECLIA: Electrochemiluminescense... Insulin, Testosteron, BioMerrieux (Vidas, MiniVidas) Miễn dòch huỳnh quang Progesteron… Abbott (iMX, AxSYM) Hóa phát quang trực tiếp Abbott (Architect i2000 ) Bayer (ACS:180SE, ADVIA centaur) Điện hóa phát quang Roche (Elecsis 1010, Elecsis 2010) 18 _Phương pháp miễn dòch đònh lượng KẾT LUẬN Các kỹ thuật miễn dòch đònh lượng ngày càng được nghiên cứu và áp dụng vào việc... Giúp tự động hóa kỹ thuật rửa, giúp rửa sạch hơn 13 _Phương pháp miễn dòch đònh lượng V Miễn dòch huỳnh quang (FIA: fluoro immuno assay) Kỹ thuật thực hiện bao gồm các giai đoạn cơ bản như kỹ thuật ELISA, ngoại trừ 2 điểm sau: Thay thế chất đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang Phát hiện (đònh lượng) chất đo bằng một quang kế huỳnh quang (fluorometer) Khuyết điểm cơ bản nhất... tương đối thấp,thuận tiện cho những nơi có số lượng mẫu thử thấp Khuyết điểm: Kỹ thuật gồm nhiều giai đoạn, thời gian lâu Các hệ thống kín tự động hóa 1 phần các khâu ủ và rửa, làm giảm bớt thao tác thủ công, và sai số do ủ và rửa Khuyết điểm: giá thành cao, phụ thuộc vào nhà cung cấp 12 _Phương pháp miễn dòch đònh lượng IV .Miễn dòch vi hạt : MEIA : micro-particle enzyme... _Phương pháp miễn dòch đònh lượng VII .Miễn dòch Hóa phát quang trực tiếp (DCLIA: Directchemiluminescense immuno assay) Chất đánh dấu là một phân tử Acridinium Ester, có khả năng phát quang khi thay đổi pH môi trường Phức hợp KN-KT sau khi rửa sẽ thêm vào một chất acid, sau đó khi cho vào chất kiềm, trong vòng 2 giây phân tử Acridinium Ester sẽ phát quang Để đònh lượng ánh sáng phát... _Phương pháp miễn dòch đònh lượng III ELISA: enzyme linked immuno sorbent assay Dựa trên nguyên tắc kết hợp KN và KT và phát hiện (đònh lượng) bằng chất đánh dấu là một enzyme, thường dùng alkaline phosphataze hoặc peroxidaza ELISA thuộc hệ thống kỹ thuật MD enzym pha... Cellulose, agarose… Các thành phần phản ứng được gắn bởi các liên kết hóa học Đo mật độ quang Cơ chất Kháng nguyên Máy ủ Cộng hợp Máy rửa Kháng IgM Máy đo quang 11 _Phương pháp miễn dòch đònh lượng 3.Phản ứng gồm các giai đoạn cơ bản: • Kết hợp KN và KT (giai đoạn 1) • Kết hợp chất đánh dấu (conjugate enzyme) vào phức hợp KN và KT (g.đoạn 2) • Giai đoạn hiện màu và đọc kết quả... tiến triển của các giai đoạn bệnh lý Việc tìm ra các phương pháp để phát hiện dấu hiệu thay đổi bệnh lý của các bệnh hiểm nghèo (tiểu đường, nhồi máu cơ tim, ung thư, viêm gam siêu vi, AIDS…) càng chính xác và nhanh chóng giúp cho các thầy thuốc có hướng chẩn đoán và điều trò kòp thời và hiệu quả hơn cho bệnh nhân Tuy nhiên việc chuẩn hóa các phương pháp và tập trung hóa các trung tâm xét nghiệm để có . [Ru(bpy) 3 2 + ] [Ru(bpy) 3 2 + ] Photon (620nm) H + e - ____________________________________________________________ _Phương pháp miễn dòch đònh lượng D. SƠ LÏC ỨNG DỤNG MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH ĐỊNH LƯNG PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH CÁC XÉT NGHIỆM ĐỊNH LƯNG Miễn dòch ngưng kết độ đục Các. kế. 7 ____________________________________________________________ _Phương pháp miễn dòch đònh lượng C.CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯNG ĐỀ CẬP TRONG CHUYÊN ĐỀ 1 .Miễn dòch ngưng kết (agglutination): Dựa trên nguyên. tháng. 9 ____________________________________________________________ _Phương pháp miễn dòch đònh lượng II .Miễn dòch ngưng kết độ đục (immuno- turbidity) Phương pháp này phù hợp cho các cơ chất có trọng lượng phân tử không quá nhỏ như: