Sản xuất protein tái tổ hợp có dược tính sinh học (phần II) Ki ểm tra các điểm mạnh của quy trình Các tế bào là các hệ thống phản ứng sinh học nhỏ sản xuất hiệu quả nhiều hay ít các protein tái tổ hợp dựa vào các yếu tố đã biết hay ch ưa biết. Sản phẩm quá trình lên men chứa nhiều loại protein, mặc d ù quy trình đã đựơc thiết kế tốt trong giai đoạn này. Điều này phụ thuộc rất nhiều vào các bước tinh sạch. Trong một quy trình hiệu quả, các chất nền cột có thể gắn nhiều protein (10-20% nhiều hơn hay ít hơn số lượng mong đợi). Tốc độ dòng chảy cột và số lượng mẫu có khả năng chứa có thể được mất nhiều trong suốt quá trình chạy cột và độ sạch của quá trình phân tách. Các bước kiểm tra cần được thực hiện để tính toán khoảng thời gian hiệu quả của cột và sản phẩm được tinh sạch để xác định các điều kiện mà protein vẫn có khả năng hoạt động. Cuối cùng, tính hiệu quả của quy trình phụ thuộc mạnh vào các thông số như pH, độ dẫn điện và tính phân cực. Nhìn chung, một cột tinh sạch linh động thì tính hiệu quả của quy trình càng tăng thêm. Tính toán ở quy mô nhỏ Một khi tính hiệu quả của quy tr ình đã được kiểm tra, quy trình này c ần lặp lại từ ba đến năm lần để xác định các thông số, bắt đầu từ tế b ào nuôi cấy đến sản xuất quy mô lớn. Mục đích là để xác định độ lập lại và tính hiệu quả của mỗi bước liên quan đến chất lương và đặc tính của các chất trung gian và các chất thuốc ở nồng độ lớn. Sau khi vận hành thành công ở quy mô phòng thí nghiệm, quy trình được nâng cấp từ từ thành quy mô pilot lớn hơn gấp 10 lần quy mô phòng thí nghiệm và sau đó là sản xuất ở quy mô lớn. Tất cả các thông số của các bước đơn rẽ được kiểm tra tất cả ngay cả khi quy trình đã vận hành ở quy mô lớn thành công, quy trình cần được kiểm tra ở quy mô nhỏ một lần nữa đễ tính toán tổ hợp các thông số kỹ thuật trong một hệ thống đầy đủ. Lúc này, khi quy trình nhỏ được thẩm định lại. quá trình làm sạch virus phải được thực hiện. Loại bỏ virus Một thành phần cần thiết của các nghiên cứu thẩm định quy trình c ủa các sản phẩm thu nhận từ tề bào eukaryotic là hiểu được quy trình tinh sạch để loại bỏ các các thành phần virus bất hoạt bị nhiễm. Các virus nhiễm vào quy trình sinh học được chia thành loại: Các virus nội sinh tồn tại nh ư một phần của tế bào đư ợc sử dụng để biểu hiện sản phẩm protei n (retrovirus chu ột). Các virus không thuộc loại virus nội sinh l à các virus từ các nguồn b ên ngoài hiện diện trong các ngân hàng t ế bào cao cấp (nh ư Epstein Barr virus). Các virus ngoại sinh thư ờng nhiễm vào s ản phẩm thông qua trình sản xuất cũng như nhiễm t ừ nguyên li ệu thô hay do tạp nhiễm (parvovirus). Ngày hôm nay các s ản phẩm công ngh ệ sinh học thu nhận từ các dòng tế bào b ắt buộc không có chứa bất kể thành phần virus n ào. Nhưng trong các quy trình s ản xuất hiện nay, do thiên nhiên có thể bị nhi ễm từ các nguồn virus ngoại sinh. Do đó, đ ể chắc chắn có sản phẩm an toàn, giám định các bư ớc làm sạch virus phải trở thành m ột phần của quá trình sản xuất. Loại nhiễm virus Các bước làm virus phải đư ợc giám định trứơc giai đo ạn I của sản phẩm và được thực hiện bởi chuyên gia. Phương pháp chung cho các nhà sản xuất là sử dùng các dòng tế b ào chuột lang (rodent cell lines) để giám sát các bước tinh sạch virus để loại bỏ hay bất hoạt các virus gây ung thư máu ở chuột (murine leukemia virus), virus này đón g vai trò như là một mô hình chuyên biệt đối với các tiểu phần giống retrovirus được sản xuất bởi các hệ thống biểu hiện trong dòng tế bào chuột và để thêm vào và giám sát bước tinh sạch parvo virus trong quá trình sản xuất sản phẩm ở giai đoạn I. Sự bất hoạt virus có thể được thực hiện bằng nhiệt độ, pH, chất tẩy rửa, phóng xạ và các dung môi sự loại bỏ virus có thể được thực hiện bằng phương pháp lọc và chạy sắc ký. Trong một nghiên cứu giám sát virus , đư ợc thực hiện truớc khi sản xuất các vật liệu cho giai đoạn III củ sản phẩm, các nhà xuất sẽ chọn một quy trình bao gồm từ hai tới bốn bước kiểm tra bổ sung. Sự lựa chọn virus phụ thuộc vào dòng tế bào và nguồn gốc của môi trường bao gồm vả hai loại virus mô hình chuyên biệt và không chuyên biệt. Các dòng virus được lựa chọn để bất hoạt và loại bỏ nhiều loại virus trong quá trình sản xuất mà v ẫn suy trì hoạt tính và chất lượng sản phẩm. Một virus đáng quan tâm là cũng như virus được xác định cũng như các chủng loài virus đư ợc biệt cũng như nhiễm vào vật liệu trong quá trình sản xuất. Một mô hình virus chuyên biệt cần được chính xác nhất các chủng loại virus (cùng chủng hay họ), có các đặc tính hoá học và vật lý tương tự nhau. Cuối cùng, một mô hình virus chuyên biệt được sự dụng để đặc tính hoá khả năng loại bỏ hay bất hoạt virus tổng số… cho thấy tính hiệu quả của quy trình tinh sạch. Quan trọng là, virus trong hạn mục là sự lựa chọn đầu tiên. Nếu sử dụng đã biết chính xác là điều không thể. Các nhà sản xuất chọn một mô hình virus chuyên bi ệt nhất để làm một mô hình virus cần khảo sát. Để khảo sát “sự sạch của virus”, các nghiên cứu hỗ trợ để tính toán sự sạch của virus của một nhóm virus không chuyên biệt nào đó. Những virus này được kết hợp cac mộ hình chuyên biệt và tương đương để tạo ra một quy trình ki ểm tra sự hiện diện của virus từ các bộ gene khác nhau (DNA và RNA), kích thước và các đặc tính bề mặt (virus có vỏ hay không) Nghiên cứu về sự bổ sung virus để giám sát Trong nghiên cứu về sự bổ sung virus để giám sát, các bước này nằm trong một quá trình sản xuất với tính hiệu quả cao nhất để loại bỏ hay bất hoạt các thành phần [...]... nghiên cứu này cho phép nhà sản xuất tiên lượng được khả năng loại bỏ toàn bộ virus của quy trình sản xuất và xác định quy trình sản xuất nào có khả năng cung cấp một mức thích hợp trong quy trình làm sạch virus để chắc chắn rằng các sản phẩm thuốc được an toàn Yếu tố khử Cần thiết để biết có bao nhiêu virus có trong mẩu không qua chế biến bởi vì qua trình phải được thiết kế để có khả năng loại bỏ toàn... và các bước hiệu qủa ở mức tương đối rơi vào một trong hai yếu tố có tính quyết định Thiết kế quy trình vẫn còn là một thách thức trong việc phát triển quy trình ở mức độ nhỏ và các yếu tố có tính phân tích bởi vì quy trình phải thích hợp với sự sản xuất các protein có hoạt tính trong một tiêu chuẩn nghiêm gặt theo các quy định an toàn dược phẩm ... biệt theo quy trình đã được thiết kế sẳn, các nhà sản xuất bổ sung các bước làm sạch virus vào quy trình và thực hiện các bước có tính giám sát để theo dõi tính hiệu quả của quá trình làm sạch virus khi vận hành một vài hệ thống Điều cơ bản của yếu tố khử và tính hiệu quả, tính hiệu quả được đặt lên hàng đầu Một sự vận hành có thể được tính toán theo tính hiệu quả, không hiệu quả hay hiệu quả tương... Yếu tố khử được xác định theo log10 theo tỷ lệ giữa tổng số virus cho vào trước khi làm sạch và tổng số virus cho vào được đo lường trong sản phẩm sau khi làm sạch Nhìn chung các đòi hỏi về yếu tố khử được thiết kế chuyên biệt cho các virus đã biết nhiễm vào quy trình sản xuất Các tiểu phần giống như retrovirus được sản xuất bởi các hệ thống biểu hiện protein trong các tế bào chuột là các mẫu phổ biến... lượng virus có thể bị nhiễm vào trong vật liệu ban đầu vào bước sản xuất phải được giám sát càng nhiều càng tốt Tuy nhiên khôn phải thành phần ban đầu nào quá trình sản xuất cũng được chấp nhận Thể tích cho vào phải được giữ ở mức thấp, bình thường phải thấp hơn 10% Trong khi nghiên cứu lượng cần được thêm vào, mô hình virus được bổ sung trực tiếp vào các bước thích hợp ở quy mô nhỏ đã được tính toán . Sản xuất protein tái tổ hợp có dược tính sinh học (phần II) Ki ểm tra các điểm mạnh của quy trình Các tế bào là các hệ thống phản ứng sinh học nhỏ sản xuất hiệu quả. thích hợp ở quy mô nhỏ đã được tính toán trước. Những nghiên cứu này cho phép nhà sản xuất tiên lượng được khả năng loại bỏ toàn bộ virus của quy trình sản xuất và xác định quy trình sản xuất. buộc không có chứa bất kể thành phần virus n ào. Nhưng trong các quy trình s ản xuất hiện nay, do thiên nhiên có thể bị nhi ễm từ các nguồn virus ngoại sinh. Do đó, đ ể chắc chắn có sản phẩm