Chuyên đề 3 KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC I. MỞ ĐẦU Trong ngành Dược có nhiều phương pháp khác nhau để kiểm tra chất lượng của thuốc như phương pháp hoá học, phương pháp vật lý, phương pháp sinh học. Phương pháp hoá, lý tiến hành nhanh, chính xác nhưng chỉ áp dụng được với các chất thành phần hoá học đã biết. Một số dược phẩm có yêu cầu về hiệu lực tác dụng, hoặc những tính chất riêng biệt như độ an toàn của vaccine, độc tính bất thường hay yếu tố gây sốt của một số loại thuốc…Những tiêu chuẩn này không thể xác định được bằng phương pháp lý, hoá mà phải dùng phương pháp sinh học. I.1. Nguyên tắc • Phương pháp sinh học dựa trên nguyên tắc: So sánh hiệu lực tác dụng hoặc các đặc tính riêng của chất thử với chất chuẩn tương ứng trong cùng điều kiện và thời gian thí nghiệm. Trong lĩnh vực kiểm nghiệm thuốc, hai loại thử nghiệm được áp dụng nhiều nhất là: - Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp thử trên động vật - Kiểm nghiệm thuốc bằng các thử nghiệm vi sinh vật. I.2. Chất chuẩn Trong thử nghiệm sinh học chất chuẩn là một yếu tố quan trọng để đánh giá chất lượng chất thử. Chất chuẩn được chia làm hai loại: - Chất chuẩn gốc: là những chất đồng nhất cố độ tinh khiết cao. Chất chuẩn thường được làm ở các viện nghiên cứu quốc gia hoặc quốc tế về chất chuẩn sinh học. - Chất chuẩn thứ cấp: cũng là chất có độ tinh khiết cao, có hoạt tính sinh học được xác định theo chuẩn gốc quốc tế tương ứng. Chất chuẩn phải được bảo quản trong các ống thuỷ tinh ở nhiệt độ thích hợp tuỳ theo mẫu (thường ở nhiệt độ < 5 0 C) trong điều kiện khô, tránh ánh sáng. I.3. Đánh giá kết quả Thử nghiệm sinh học thường có thời gian thí nghiệm kéo dài và phụ thuộc vào nhiều yếu tố như tính chất đáp ứng của sinh vật thí nghiệm, người làm thí nghiệm, các điều kiện thử nghiệm. Các yếu tố này thường không ổn định. Vì vậy kết quả thử nghiệm sinh học phải được đánh giá bằng toán thống kê. Độ chính xác của phép thử được thể hiện bằng giới hạn tin cậy. II. KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỬ TRÊN ĐỘNG VẬT II.1. Nguyên tắc Kiểm nghiệm thuốc bằng các phép thử trên động vật dựa trên sự đáp ứng của động vật thí nghiệm đối với các chế phẩm được đưa vào cơ thể một liều lượng theo qui định của từng thí nghiệm để đánh giá chất lượng của chế phẩm cần thử. II.2.Động vật thí nghiệm Động vật dùng trong thí nghiệm phải đồng đều, thuần khiết về nòi giống, khoẻ mạnh không nhiễm bệnh, không có thai và được nuôi dưỡng đầy đủ. Mỗi thí nghiệm có nhu cầu khác nhau về trọng lượng. Chất lượng của động vật quyết định sự chính xác của phép thử. II.3. Thử Invivo và Invitro. - Thử nghiệm được tiến hành trên cơ thể động vật sống gọi là Invivo. Người ta dựa trên các thông số như nhiệt độ cơ thể, nhịp tim, điện tâm đồ, điện não đồ, sự thay đổi huyết áp, phản xạ hệ thần kinh hoặc tỷ lệ sống, chết của động vật thí nghiệm …để đánh giá tác dụng và chất lượng của thuốc. - Phép thử có thể được tiến hành trên các cơ quan cô lập của động vật, như tim, tử cung, ruột, máu… gọi là thử Invitro. II.4. Liều(Dose) Liều là lượng chế phẩm thử đưa vào cơ thể động vật một lần cho từng mục đích thí nghiệm. Ví dụ: Liều LD 0 , LD 50, LD 100 , MLD, liều thử chất hạ áp, liều thử chất gây sốt. II.5. Một số thử nghiệm trên động vật áp dụng trong kiểm nghiệm thuốc II.5.1. Thử độc tính bất thường • Nguyên tắc: Độc tính bất thường của mẫu thử được đánh giá bằng số chuột nhắt sống và chết trong thời gian 48 giờ sau khi chuột nhận được một lượng thuốc thử thích hợp bằng đường tiêm hoặc đường uống. Thí nghiệm này thường được áp dụng cho các thuốc đông dược có dược liệu độc như ô đầu, phụ tử hay các chế phẩm đông dược mới. • Động vật thí nghiệm : Dùng chuột nhắt trắng khoẻ mạnh, nếu chuột cái không được có thai, cân nặng từ 18g đến 22g. • Nguyên tắc tiến hành: Chất thử được hoà tan trong NaCl 0,9% hoặc nước cất pha tiêm để tạo dung dịch có nồng độ quy định cho từng chuyên luận. Thí nghiệm được thử trên 5 chuột, cho mỗi chuột 0,5 ml dung dịch chất thử bằng một trong các đường dùng sau: + Tiêm tĩnh mạch: Tiêm liều thử vào tĩnh mạch đuôi của chuột với tốc độ không đổi trong thời gian từ 15 giây đến 30 giây. + Tiêm màng bụng: Tiêm thuốc qua da bụng vào hốc bụng chuột. + Tiêm dưới da: Tiêm vào một chỗ của mặt lưng hoặc trên bụng hay đùi. + Uống: Bơm dung dịch thử qua một dụng cụ thích hợp vào thực quản hay dạ dày chuột. • Đánh giá kết quả: Sau 48 giờ dùng thuốc ở lần thứ nhất, nếu không có chuột nào chết, mẫu thử đạt yêu cầu. Nếu có một hay nhiều chuột chết trong thời gian trên phải làm lại thí nghiệm lần thứ hai. Thí nghiệm lần thứ hai được tiến hành với 10 chuột cân nặng từ 20 gam. Sau 48 giờ nếu không có chuột nào chết thì mẫu thử đạt yêu cầu. Nếu có một hay nhiều chuột chết, mẫu thử không đạt yêu cầu. II.2.2. Thử chất gây sốt • Nguyên tắc: Thử chất gây sốt là một phương pháp sinh học để kiểm tra chất lượng mẫu thử, dựa trên sự tăng thân nhiệt của thỏ sau khi được tiêm thuốc thử cần thử vào tĩnh mạch tai. Các dịch tiêm truyền yêu cầu bắt buộc phải thử chất gây sốt. Các thuốc tiêm nếu ghi trên nhãn “không có chất gây sốt” hoặc có thể tích từ 15ml trở lên cũng phải thử chất gây sốt. • Động vật thí nghiệm: Thí nghiệm được thực hiện trên thỏ trưởng thành, khoẻ mạnh, đực hoặc cái ( không có thai) nặng từ 1,5kg trở lên, có thể dùng lại thỏ đã thử chất gây sốt nhưng phải cho nghỉ 2 ngày (nếu lần thử trước âm tính) hoặc 14 ngày (nếu lần thử trước dương tính), không dùng lại thỏ đã thử các thuốc gây dị ứng. Thỏ được nuôi đầy đủ với các chất kháng sinh. Nhiệt độ nhà chăn nuôi và phồng thí nghiệm không chênh lệch nhau quá 3 o C. Trong 3 ngày trước ngày thí nghiệm , thỏ được lấy nhiệt độ mỗi ngày 3 lần vào buổi sáng, mỗi lần cách nhau 1 giờ. Khi đo nhiệt độ, để sâu nhiệt kế 5 cm trong trực tràng thỏ, thời gian tối thiểu 5 phút. Chỉ dùng thỏ có nhiệt độ nằm trong khoảng 38 - 39,8 o C. Trong thời gian lấy nhiệt độ không cho thỏ ăn, nhưng có thể cho uống nước. Những con thỏ có sự chênh lệch nhiệt độ giữa các lần đo trong ngày ≥0,6 O C không được dùng để thí nghiệm. • Dụng cụ thí nghiệm: Các dụng cụ thuỷ tinh như bơm tiêm, kim tiêm phải được rửa sạch và khử trùng 250 o C trong 30 phút hoặc 200 o C trong 1 giờ. Nhiệt kế phải có độ chính xác ± 0,1 o C. Dùng các nhiệt kế có đường kính nhỏ để không gây kích ứng mạnh. • Phương pháp tiến hành: Thí nghiệm được thực hiện trên 3 thỏ có nhiệt độ khác nhau không quá 1 o C Lấy nhiệt độ ban đầu: Trước khi tiêm chất thử, lấy nhiệt độ thỏ 2 lần, mỗi lần cách nhau 30 phút. Hai nhiệt độ này không được chênh nhau quá 0,2 o C. Nhiệt độ ban đầu là trung bình cộng của 2 lần đo. Tiêm thuốc: Liều lượng và cách xử lý mẫu được quy định trong từng chuyên luận. Thể tích tiêm nói chung nằm trong khoảng 0,5 – 10ml cho 1kg thỏ. Đối với các dung dịch nhược trương cần đẳng trương hoá bằng NaCl đã được vô trùng. Tốc độ tiêm từ 4- 6ml /phút, Thời gian tiêm không dài quá 4 phút. Nếu thể tích tiêm lớn phải làm nóng dung dịch lên 38 o C trước khi tiêm. Theo dõi nhiệt độ thỏ ở những khoảng thời gian ít nhất 30 phút trong 3 giờ sau khi tiêm. Nhiệt độ tăng của thỏ là hiệu số giữa nhiệt độ tối đa sau khi tiêm thuốc và nhiệt độ ban đầu. • Đánh giá kết quả: Nếu không có thỏ nào tăng nhiệt độ bằng hoặc lớn hơn 0,6 o C hoặc tổng nhiệt độ của 3 thỏ nhỏ hơn hoặc bằng 1,4 o C thì chế phẩm thử đạt yêu cầu. Nếu một thỏ trở lên tăng nhiệt độ bằng hoặc lớn hơn 0,6 o C hoặc tổng tăng nhiệt độ của 3 thỏ > 1,4 o C thì phải thử lại trên 5 thỏ khác. Nếu 4 thỏ trở lên trong 8 con của hai lần thí nghiệm tăng nhiệt độ ≥0,6 o C, hoặc nếu tổng số tăng nhiệt độ của 8 con > 3,7 o C thì chế phẩm coi như không đạt yêu cầu thử chất gây sốt. Phương pháp thử trên động vật còn được áp dụng để kiểm nghiệm nhiều loại dược phẩm có tính chất đặc biệt: Định lượng các hormon, corticotropin (ACTH), insulin, adrenalin, định lượng heparin, vitamin Động vật, Oxytcin, digitalin và các chế phẩm chứa glucosid chứa tim. Kiểm tra độ an toàn và hiệu lực của vaccine… III. KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG CÁC PHÉP THỬ VI SINH VẬT III.1. Đại cương về vi sinh vật Vi sinh vật là những cơ thể sống có kích thước rất nhỏ mà mắt thường không nhìn thấy được. Nếu cần quan sát hình dạng của chúng phải dùng kính hiển vi. Trong tự nhiên, vi sinh vật tồn tại rất phong phú và đa dạng, chúng đóng vai trò tích cực vào vòng tuần hoàn vật chất. Nhiều loại vi sinh vật được ứng dụng trong các lĩnh vực y tế, công nghiệp, nông nghiệp như các vi sinh vật có khả năng lên men rượu, sinh tổng hợp kháng sinh, vitamin, acid amin, vi sinh vật cố định đạm ở thực vật … Trong quá trình hoạt động sống, bên cạnh những đặc tính có ích, vi sinh vật cũng gây nhiều tác hại cho người, động vật, thực vật như: làm biến đổi chất lượng thuốc, hỏng thực phẩm, một số có khả năng gây bệnh hoặc sinh độc tố có hại. Để phục vụ cho việc kiểm nghiệm thuốc bằng các thử nghiệm vi sinh vật, ta cần tìm hiểu một số đặc điểm chính của hai nhóm vi sinh vật là vi khuẩn và vi nấm. III.1.1. Vi khuẩn (Bacteria) • Đặc điểm: Vi khuẩn là những vi sinh vật đơn bào có cấu tạo tế bào tiền nhân (Procaryote), có kích thước rất nhỏ. Đường kính tế bào phần lớn thay đổi trong khoảng 0,2- 2,0 μm, chiều dài từ 2- 8 μm. Vi khuẩn có nhiều hình dáng khác nhau như hình cầu, hình que, xoắn, dấu phẩy. Vi khuẩn chỉ sinh sản vô tính, một số tạo bào tử. Mỗi tế bào vi khuẩn chỉ có một bào tử. Một số vi khuẩn có khẳ năng di động nhờ sự có mặt của một hay nhiều lông (flagella) • Phân loại: Việc phân loại vi khuẩn rất phức tạp, phải dựa nhiều vào đặc điểm, hình thái, sinh lý, sinh hoá để chia vi khuẩn thành các họ, chi , loài khác nhau. Với mục đích phục vụ cho công tác kiểm nghiệm thuốc, ta không đi sâu vào nghiên cứu phân loại, nhưng cần tìm hiểu vi khuẩn, theo các nhóm dựa trên hình thể, tính chất bắt màu thuốc nhuộm Gram và khẳ năng hô hấp của chúng. Theo hình thể: + Cầu khuẩn (Coccus) Vi khuẩn hình cầu có thể đứng riêng rẽ (Micrococcus), thành từng đám (Staphylococcus), hoặc chuỗi (Streptococcus), hay xếp thành từng đôi (Diplococcus). + Trực khuẩn (Bacillus): Vi khuẩn hình que ngắn đứng riêng rẽ hay thành chuỗi (Bacillus anthracis) hoặc hình que hai đầu tròn (Escherichia coli). + Xoắn khuẩn (Spirillum): Vi khuẩn hình lò xo như Treponema pallidum. + Phẩy khuẩn (Vibrio): Vi khuẩn hình dấu phẩy như Vibrio cholerae. Theo tính chất bắt mầu thuốc nhuộm Gram + Vi khuẩn có màu tím sau khi nhuộm Gram: Vi khuẩn Gram (+) + Vi khuẩn có màu đỏ sau khi nhuộm Gram: Vi khuẩn Gram (–) Theo đặc tính của quá trình hô hấp + Sử dụng oxy tự do trong quá trình hô hấp: Vi khuẩn hiếu khí. + Phát triển được cả trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí, có quá trình hô hấp nitrat: vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc. + Chỉ sống trong điều kiện kỵ khí, có quá trình hô hấp sulfat: Vi khuẩn kỵ khí bắt buộc. • Sinh sản của vi khuẩn: - Vi khuẩn sinh sản bằng cách phân đôi tế bào. Sự phân chia tế bào xảy ra rất nhanh. Trong điều kiện môi trường thích hợp và không có các yếu tố kìm hãm thì một tế bào vi khuẩn sau 6 giờ có thể sinh ra 250.000 tế bào mới. Tuy nhiên sự nhân lên của vi khuẩn không phải là vô tận, nó còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Trong môi trường nuôi cấy, sự sinh sản của vi khuẩn sau một thời gian nhất định sẽ bị ngừng lại vì nhiều nguyên nhân như: thức ăn bị hết dần, hoặc vi khuẩn có thể tiết ra những chất kìm hãm sự phát triển của chúng. - Tốc độ phát triển của vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy tĩnh thay đổi theo thời gian và tuân theo một quy luật nhất định bao gồm 4 pha: Pha lag, pha logarit, pha ổn định và pha tủ vong (Hình 1) 4 3 1 2 Log N thời gian Hình 1: Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn - Sự phát triển của vi khuẩn trong môi trường lỏng có thể quan sát sau khoảng 18- 24 giờ nuôi cấy. Chúng có thể làm đục môi trường, tạo váng trên bề mặt hoặc lắng cặn ở đáy ống nghiệm. - Trong môi trường đặc, vi khuẩn tạo thành các khuẩn lạc. Mỗi vi khuẩn có đặc tính khuẩn lạc riêng về hình dạng, kích thước, màu sắc. Một số vi khuẩn có thể tạo sắc tố trong môi trường. Những tính chất trên giúp cho việc xác định vi khuẩn trong quá trình kiểm nghiệm thuốc. III.1.2. Vi nấm (Microfungi) • Đặc điểm: Vi nấm có cấu tạo tế bào nhân thật(Eucaryote). Tế bào vi nấm rất nhỏ. Muốn quan sát cần dùng kính hiển vi. Nấm không có chất diệp lục, sống hoại sinh hoặc ký sinh, sinh sản vô tính hoặc hữu tính. Vi nấm bao gồm hai loại là nấm men và nấm mốc. Trong kiểm nghiệm vi sinh vật, cần phát hiện hai loại này có trong thực phẩm. • Nấm men (Yeast): - Nấm men có cấu tạo đơn bào, sinh sản chủ yếu bằng nẩy chồi. Tế bào nấm men có kích thước, hình dạng khác nhau tuỳ loài. Chúng có thể hình cầu, bầu dục, hình quả chanh, hình ống… - Khuẩn lạc nấm men bao gồm nhiều cá thể thường thuộc một loài phát triển từ một cá thể mẹ tạo thành một khối. Khuẩn lạc nấm men thường to hơn khuẩn lạc vi khuẩn, bề mặt có nếp nhăn hoặc trơn nhẵn, không tạo sợi. - Nấm men được sử dụngnhiều trong công nghiệp thực phẩm như làm bánh mỳ, bia, rượu…Nhưng nhiều nấm men gây bệnh hoặc làm hư hỏng thực phẩm, thuốc. [...]... Nuôi c y 3 0- 35 0C/ 7 ng y đối với vi khuẩn, và 2 5- 280C/ 7 ng y đối với vi nấm Trong thời gian nuôi c y, nếu vi sinh vật phát triển giống nhau (mọc nhanh và phong phú) trong các ống chứng và ống kiểm tra, chế phẩm thử được coi là không có tác dụng ức chế Nếu các ống có chất thử, vi sinh vật phát triển y u hoặc không phát triển so với các ống không có chất thử, chế phẩm có chất ức chế Tác dụng ức chế. .. vật Cho vào mỗi đĩa 1 5- 20 ml môi trường đã để nguội dưới 45oC Ủ 3 0- 35 oC/ 2 4- 48 giờ (đối với vi khuẩn) và 2 5- 28oC/ 4 8- 72 giờ (đối với C.albicans) - Trong khoảng nồng độ đã chọn sự phụ thuộc giữa logarit của nồng độ với đường kính vòng vô khuẩn tương ứng là tuyến tính V: là tổng các hiệu giá trị đường kính lớn nhất và nhỏ nhất của một nồng độ Ta= (T1+ T2 + T3) – (S1 + S2 + S3) Tb = (T3 + S3) - (T1+... L y 1- 2 ống (hoặc bình) môi trường mới làm ủ ở 3 0- 35 0C ít nhất trong 4 ng y đối với môi trường phát hiện vi khuẩn, và 2 5- 280C ít nhất trong 7 ng y với môi trường phát hiện vi nấm Sau thời gian nuôi c y, các ống môi trường không được có vi sinh vật mọc (có thể ủ các ống môi trường song song với các ống được c y chất thử) - Khả năng dinh dưỡng: C y vào mỗi ống môi trường thích hợp khoảng 100 tế bào. .. trong cùng một điều kiện là một lô thuốc Thông thường, khi một lô có ít hơn 100 đơn vị, l y 3 đơn vị để kiểm nghiệm Nếu nhiều hơn thì cứ 50 đơn vị l y thêm 1 đơn vị nhưng không quá 10 Tuy nhiên, khi l y mẫu cũng cần dựa vào tiêu chuẩn nghành hoặc tiêu chuẩn cơ sở của từng sản phẩm để l y mãu cho thích hợp III .3. 5 Kiểm tra tác dụng ức chế vi sinh vật của chế phẩm thử Một số thuốc trong quá trình sản xuất... thời các chế phẩm dược phải được quy định giới hạn vi sinh vật cho phép III.2 Môi trường nuôi c y vi sinh vật Môi trường nuôi c y là những chất dinh dưỡng thích hợp nhằm đảm bảo cho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển Môi trường cần có 3 điều kiện sau: Đ y đủ chất dinh dưỡng theo y u cầu thí nghiệm, có PH trong khoảng quy định và phải vô trùng Môi trường gồm 3 loại: - Môi trường tự nhiên: nguyên liệu... n y có thể ảnh hưởng dến sự phát hiện vi sinh vật có trong chế phẩm Một chế phẩm chưa biết có tác dụng ức chế hay không thì cần phải kiểm tra tác dụng ức chế đối với vi sinh vật sau: L y ít nhất 2 ống của mỗi loại môi trường páht hiện vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí, vi nấm c y vào 1 trong 2 ống chế phẩm cần thử C y khoảng 100 tế bào (0,1 ml nhũ dịch vi sinh vật được pha loãng ở nồng độ thích hợp) Staphylococcus... hiện được với các chế phẩm có tác dụng ức chế và các chất kháng sinh, vì khi thí nghiệm chất thử được c y trực tiếp vào các môi trường nuôi c y thích hợp cho các vi khuẩn, vi nấm • Lượng mẫu thử dùng trong thí nghiệm: Lượng mẫu thử cần c y vào các môi trường tuỳ thuộc vào từng loại mẫu (bảng 2) Bảng 2: Lượng mẫu thử dùng cho thí nghiệm nuôi c y trực tiếp Lượng chế phẩm trong Lượng tối thiểu cho một môi... vi nấm theo số lượng quy định Chất rắn là dạng bột có thể cho trực tiếp vào môi trường hoặc làm thành dung dich hay nhũ dịch 1% sau đó c y vào môi trường Mẫu thử là băng gạc, chỉ khâu phẫu thuật nếu kích thước và hình dạng cho phép, nhúng toàn bộ mẫu thử vào 100 ml môi trường Mẫu thử là d y truyền dịch: cho dung dịch pepton 0,1% vô trùng ch y qua để thu được ít nhất 15 ml và c y vào 100ml môi trường... Staphylococcus aureus Baccillus subtilis Pseudomonas aeruginosa + Vi khuẩn kỵ khí: Clostridium sporogenes + Vi khuẩn nấm: Candida albicans Aspergillus niger Các ống thử vi khuẩn được nuôi c y 3 0- 35 0C/ 3 ng y, ống thử vi nấm ủ ở 2 5- 280C/ 5 ng y Sau thời gian nuôi c y vi sinh vật phải phát triển tốt trên vác môi trường III .3. 4 L y mẫu thử: Trong thử vô trùng, có thể coi toàn bộ số ống hoặc lọ thuốc. .. vật, vi sinh vật bị chết Các tế bào sinh dưỡng thường bị chết ở nhiệt độ 600C/ 20 – 30 phút Các nha bào chỉ bị tiêu diệt ở nhiệt độ 1200C/ 30 – 40 phút Tính chất n y sự phát triển của vi sinh vật • Độ ẩm: Hầu hết các quá trình sống của vi sinh vật có liên quan đến nước Khi thiếu nước x y ra hiện tượng loại nước khỏi tế bào vi sinh vật, trao đổi chất bị giảm, tế bào sẽ chết Vì v y, để bảo quản dược . Trong lĩnh vực kiểm nghiệm thuốc, hai loại thử nghiệm được áp dụng nhiều nhất là: - Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp thử trên động vật - Kiểm nghiệm thuốc bằng các thử nghiệm vi sinh vật kháng sinh. Nhiệt độ nhà chăn nuôi và phồng thí nghiệm không chênh lệch nhau quá 3 o C. Trong 3 ng y trước ng y thí nghiệm , thỏ được l y nhiệt độ mỗi ng y 3 lần vào buổi sáng, mỗi lần cách nhau. vi khuẩn được nuôi c y 3 0- 35 0 C/ 3 ng y, ống thử vi nấm ủ ở 2 5- 28 0 C/ 5 ng y. Sau thời gian nuôi c y vi sinh vật phải phát triển tốt trên vác môi trường III .3. 4. L y mẫu thử: Trong thử