BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LÊ THIÊN MINH NGHIÊN CỨU TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA ASPERGILLUS FLAVUS KHƠNG SINH ĐỘC TỐ ĐỂ PHỊNG CHỐNG AFLATOXIN TRÊN NGƠ VÀ LẠC Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 62420201 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2014 Cơng trình hồn thành Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: GS TS NGUYỄN THÙY CHÂU PGS TS NGUYỄN THN XUÂN SÂM Phản biện 1: PGS TS LÊ LƯƠNG TỀ Phản biện 2: PGS TS NGUYỄN THN HOÀI TRÂM Phản biện 3: GS TS NGUYỄN VĂN TUẤT Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Trường họp Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi … giờ… ngày… tháng…… năm……… Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Tạ Quang Bửu – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Thư Viện Quốc gia NHỮNG CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN Lê Thiên Minh, Nguyễn Tiến Nam, Nguyễn Thùy Châu (2010) Hiệu chế ph m Aspergillus flavus (AF) khơng sinh aflatoxin để phịng chống afltoxin lạc Tạp chí Nơng nghiệp Phát Triển Nơng thơn, (5/2010) pp (81-85) Lê Thiên Minh, Nguyễn Thùy Châu (2010) Tác dụng chủng A.flavus DA2 không sinh phịng chống aflatoxin ngơ giai đoạn ngồi đồng q trình bảo quản Tạp Chí Nơng nghiệp Phát triển Nông thôn, (6/2010) pp (3034) Lê Thiên Minh, Nguyễn Hồng Hà, Nguyễn Thị Xuân Sâm, Nguyễn Thùy Châu (2011) Nghiên cứu sản xuất chế ph m Aspergillus flavus khơng sinh aflatoxin để phịng chống aflatoxin Hội nghị Khoa học Tồn quốc Cơ điện Nơng nghiệp Bảo quản Chế biến Nông sản, Thực phNm NXB Khoa học Kỹ thuật (1/2011) pp.213-219 MỞ ĐẦU Aflatoxin chất chuyển hóa có độc tính cao, sinh tổng hợp chủ yếu bới loài nấm mốc Aspergillus Các độc tố tồn nông sản thực phNm, làm giảm giá trị dinh dưỡng thực phNm mà nguyên nhân gây nên bệnh nguy hiểm cho người động vật viêm gan cấp tính, ung thư gan, suy dinh dưỡng trẻ em Việc kiểm sốt hàm lượng aflatoxin có mặt nơng sản thực phNm nghiên cứu từ lâu với nhiều biện pháp khác nhau, biện pháp có ưu nhược điểm định chưa có biện pháp đạt hiệu mong đợi Những năm gần đây, xu hướng sử dụng chủng nấm đối kháng Aspergillus flavus khơng sinh độc tố có tính cạnh tranh cao làm tác nhân kiểm soát phát triển tỏ hiệu Chế phNm nấm Aspergillus flavus đối kháng nghiên cứu, ứng dụng cấp sáng chế, sử dụng rộng rãi nông nghiệp số quốc gia Mỹ, Ấn Độ, Trung Quốc Việt Nam nằm miền khí hậu nhiệt đới nóng, Nm điều kiện thuận lợi cho loài nấm mốc phát triển, xâm nhiễm vào trồng từ giai đoạn canh tác, suốt trình bảo quản chế biến khơng có biện pháp kiểm sốt nghiêm ngặt Do đó, việc tạo lập chế phNm nấm A flavus đối kháng từ chủng phân lập nguồn tự nhiên địa chắn mang lại hiệu giảm thiểu nhiễm aflatoxin Xuất phát từ lý trên, thực đề tài: “Nghiên cứu tính đối kháng Aspergillus flavus khơng sinh độc tố để phịng chống aflatoxin ngơ lạc”, với mục đích nội dung nghiên cứu sau đây: Mục đích nghiên cứu Kiểm sốt nhiễm aflatoxin ngô, lạc chế phNm Aspergillus flavus không sinh aflatoxin Nội dung nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn chủng Aspergillus flavus khơng sinh aflatoxin có khả cạnh tranh cao ổn định với chủng A flavus sinh aflatoxin Nghiên cứu quy trình nuôi cấy tạo chế phNm bào tử từ chủng Aspergillus flavus không sinh aflatoxin Nghiên cứu ứng dụng chế phNm Aspergillus flavus không sinh aflatoxin nhằm giảm thiểu nhiễm aflatoxin ngô, lạc quy mô phịng thí nghiệm đồng ruộng Những đóng góp luận án Là cơng trình nghiên cứu Việt Nam sử dụng chế cạnh tranh sinh học chủng A flavus không sinh aflatoxin kiểm sốt aflatoxin nhiễm ngơ lạc Luận án nghiên cứu sử dụng kỹ thuật multiplex PCR để làm sáng tỏ chất sinh học phân tử chủng A flavus DA2 không sinh aflatoxin phân lập từ ngô (Việt Nam) Chủng A flavus DA2 không mang gen (ver, aflR nor) cụm gen sinh tổng hợp aflatoxin Luận án nghiên cứu tạo công nghệ nuôi cấy bề mặt cho sản xuất chế phNm bào tử chủng A flavus DA2 đạt sản lượng cao (109CFU/g) với công nghệ đơn giản, giá thành rẻ Chế phNm có tác dụng giảm nhiễm nấm mốc aflatoxin ngô, lạc giai đoạn đồng ruộng trình bảo quản từ 86,55% đến 97%, đảm bảo tính khả thi cao đưa ứng dụng quy mô lớn Bố cục luận án Luận án gồm 124 trang, 35 bảng 26 hình; Mục lục trang; Mở đầu: trang; Chương Tổng quan tài liệu: 27 trang; Chương Vật liệu phương pháp nghiên cứu: 11 trang; chương Kết thảo luận: 51 trang; Kết luận kiến nghị: trang; Tài liệu tham khảo: 12 trang ( Bao gồm 11 tài liệu tiếng Việt, 129 tài liệu tiếng Anh); Phụ lục: 15 trang CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN Aflatoxin nhóm hợp chất có nhân difuranocumarin, sản phNm trao đổi chất chủ yếu hai loài nấm mốc Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus Aflatoxin chất có khả gây ung thư, gây đột biến gen, tác nhân làm giảm khả miễn dịch Người bị nhiễm aflatoxin ăn phải loại ngũ cốc bị nhiễm ăn thịt động vật nuôi ngũ cốc bị nhiễm aflatoxin Các nghiên cứu vùng có tỷ lệ ung thư cao giới cho thấy nhiễm độc aflatoxin nguy gây ung thư gan 1.2 PHỊNG CHỐNG SỰ NHIỄM AFLATOXIN Trên thực tế, có số biện pháp kiểm soát aflatoxin ứng dụng như: biện pháp canh tác nông nghiệp, biện pháp sau thu hoạch, phương pháp sinh học, sử dụng vi sinh vật đối kháng… Việc sử dụng chủng vi sinh vật đối kháng khơng có hại cho người thực phNm mà lại có khả giảm tạo độc tố ức chế hoàn toàn việc tạo độc tố biện pháp lý tưởng Các nghiên cứu Dorner cho thấy, lạc bị nhiễm Aspergillus flavus aflatoxin từ giai đoạn trước thu hoạch Vì vậy, nhiều Quốc gia Mỹ, Ấn Độ, Thái Lan, Nigeria có chiến lược phòng chống nhằm giảm tổn thất aflatoxin gây nên lạc giai đoạn trước sau thu hoạch Việc sử dụng chủng A flavus không sinh độc tố để ức chế chủng A flavus sinh độc tố nhiễm đất trồng lạc theo chế loại trừ cạnh tranh thực nước Cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ cho phép đưa vào danh mục chủng Aspergillus flavus AF36 tác nhân sinh học an tồn để phịng chống aflatoxin ngô, lạc Chế phNm AF36 sản xuất từ chủng A flavus AF36 công nhận thuốc bảo vệ thực vật tích cực để giảm aflatoxin ngô, lạc việc cạnh tranh thay chủng A flavus sinh aflatoxin vốn nhiễm tự nhiên đất trồng ngô, lạc Chủng A flavus AF36 chứa gen mã hoá cho tạo aflatoxin bị đột biến trao đổi vật chất di truyền với chủng sinh aflatoxin Sử dụng chủng nấm A.flavus không sinh độc tố phân lập để kiểm soát aflatoxin dự án quan trọng Bộ Nông nghiệp Mỹ Cách tiếp cận chấp nhận Châu Phi trở thành hợp phần dự án “đánh giá mức độ nhiễm aflatoxin can thiệp cách sử dụng biện pháp kiểm soát sinh học” tài trợ quan phát triển Đức (BMZ) CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU - 55 mẫu ngô, 45 mẫu lạc 140 mẫu đất thu thập tỉnh Nghệ An, Đắc Nông, Vĩnh Phúc Hà Nội - Chuột nhắt trắng giống Swiss Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp - Mẫu ngô Viện Nghiên cứu ngô kiểm tra không bị nhiễm độc tố aflatoxin 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phân lập phân loại A.flavus không sinh độc tố theo Rapper Fennel; Sàng lọc xác định khả cạnh tranh chủng A.flavus không sinh aflatoxin theo phương pháp Tanaka công sự; Xác định có mặt số gen tham gia vào trình sinh tổng hợp aflatoxin theo phương pháp Criseo cộng sự; Xác định hàm lượng aflatoxin TLC theo phương pháp OAOC, phương pháp sắc ký lỏng cao áp theo tiêu chuNn Việt Nam TCVN 6953:2001 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG A.FLAVUS KHÔNG SINH AFLATOXIN LÀM CHỦNG SẢN XUẤT CHẾ PHẨM AF 3.1.1 Phân lập chủng Aspergillus flavus ngô, lạc Từ 100 mẫu ngô, lạc lấy số địa điểm khác nhau, phân lập 85 chủng nấm mốc có hình thái giống lồi A flavus Trong đó, n Thành, Nghệ An số chủng nấm mốc phân lập số mẫu 27/30, chiếm 90% Ở Cư’Mgar, Đắc Nông số lượng chủng nấm mốc A flavus phân lập số mẫu 24/30, chiếm 80% Yên Lạc, Vĩnh Phúc số lượng chủng nấm mốc A flavus phân lập số mẫu 21/25, chiếm 84% Tỷ lệ nhiễm mốc 15 mẫu ngô Đông Anh, Hà Nội 86% tỷ lệ nấm mốc A flavus phân lập /tổng số mẫu trung bình 85% Kết cho thấy, mẫu ngô, lạc tỉnh khảo sát bị nhiễm A flavus với tần suất cao (80-90%) khơng có chênh lệch đáng kể vùng Như vậy, nói A flavus lồi nấm mốc nhiễm ngô lạc Việt Nam 3.1.2 Sàng lọc chủng Aspergillus flavus không sinh aflatoxin Theo số tài liệu công bố tất chủng A flavus sinh aflatoxin Do vậy, để sàng lọc chủng không sinh aflatoxin, từ 85 chủng A flavus phân lập tiến hành nuôi cấy môi trường ngô theo phương pháp Tanaka cộng Sau ngày nuôi cấy, mẫu tách chiết xác định hàm lượng aflatoxin B1 tạo thành kỹ thuật sắc ký mỏng (TLC) Từ 85 chủng A flavus phân lập sàng lọc 21 chủng A flavus khơng sinh aflatoxin sử dụng cho thí nghiệm tiếp sau Kết phân tích 70,5% số chủng phân lập có khả tạo aflatoxin dao động từ 80-600 ppb Dựa khả sinh aflatoxin mức độ phát triển chủng A.flavus phân lập, 05 chủng A flavus (DA1, DA2, AL21, AL22 AL23) không sinh aflatoxin 01 chủng A flavus AF14 sinh aflatoxin chọn sử dụng cho nghiên cứu 3.1.3 Khả cạnh tranh chủng A.flavus không sinh aflatoxin Theo kết thu trên, 05 chủng A flavus (DA1, DA2, AL21, AL22 AL23) sau phân loại, sàng lọc khóa phân loại xác định không sinh aflatoxin đánh giá khả cạnh tranh với chủng A flavus AF14 sinh aflatoxin thông qua giảm hàm lượng aflatoxin môi trường ngô Chủng A flavus AF14 sinh aflatoxin nuôi hỗn hợp với chủng A flavus không sinh aflatoxin tuyển chọn theo tỉ lệ 1:1 (số bào tử chủng 1,5 x 105CFU/g) chất ngơ khơng có aflatoxin nhiệt độ 28oC, độ Nm 25% thời gian ngày Sau chiết xuất phân tích hàm lượng aflatoxin tạo thành Hình 3.1 Sắc ký đồ thể hàm lượng aflatoxin B1 hỗn hợp chủng A flavus nuôi cấy môi trường ngô Hình 3.1 rằng, ni riêng chủng A flavus AF14, sau ngày nuôi cấy hàm lượng aflatoxin B1 600 ppb Kết phân tích cho thấy, chủng A flavus không sinh aflatoxin khảo sát thể khả canh tranh làm giảm hàm lượng aflatoxin B1 chủng AF14 với mức độ khác nhau, dao động từ 42-85% Hiệu giảm khác chủng A flavus DA2, A flavus DA1, A flavus AL21, A flavus AL22, A flavus AL23 có khả cạnh tranh khác chủng A flavus A14 Khi nuôi hỗn hợp chủng A flavus A14 chủng A flavus DA2 hàm lượng aflatoxin mơi trường ngơ giảm nhiều nhất, cịn 90 ppb, hiệu giảm aflatoxin B1 85% 3.1.4 Sự có mặt số gen thuộc cụm gen mã hóa cho enzym tham gia vào trình sinh tổng hợp aflatoxin chủng A.flavus DA2 Chủng A flavus DA2 xác định không sinh aflatoxin dựa phương pháp ni cấy, phân tích TLC, sắc ký lỏng cao áp HPLC có khả cạnh tranh cao với chủng A flavus AF14 sinh độc tố Theo nhiều tài liệu nghiên cứu, chủng A flavus không sinh aflatoxin thiếu số gen mã hóa cho enzym trình sinh tổng hợp aflatoxin có đầy đủ gen mã hóa cho q trình sinh tổng hợp aflatoxin khơng sinh độc tố chúng bị đột biến gen Để hiểu chất không sinh aflatoxin chủng A flavus DA2 phân lập mức độ gen, kỹ thuật multiplex PCR sử dụng để xác định thiếu hụt gen cụm gen sinh tổng hợp aflatoxin, là: aflR, nor, omt ver Kết hình 3.2 cho thấy, chủng sinh độc tố A flavus AF14 có đầy đủ gen cần thiết cho tạo aflatoxin chủng A flavus DA2 có gen omt Ba gen mục tiêu aflR, ver nor gen quan trọng mã hóa cho trình hình thành sản phNm trung gian đường sinh tổng hợp aflatoxin hồn tồn khơng có Trong đó, gen aflR gen điều khiển nhân tố phiên mã quan trọng cho hầu hết gen cấu trúc, kiểm sốt q trình sinh tổng hợp aflatoxin Theo Criseo chủng khơng có khả tạo aflatoxin khơng có đầy đủ gen aflR, nor, omt ver cụm gen chứng minh gen chìa khóa cho tạo aflatoxin AflR Omt Ver Nor 1650 bp 1000 bp 850 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp 1034 bp 795 bp 537 bp 399 bp Hình 3.2 Sản ph m multiplex PCR chủng A flavus DA2 AF14 Chú thích: Line 1: A flavus DA2; Line 2: A flavus AF14; Line 3: Marker 3.2.3 Hoàn thiện chế phẩm AF từ chủng A.flavus DA2 3.2.3.1 Nghiên cứu lựa chọn chất mang Mật độ bào tử chủng A flavus DA2 không giảm sau tháng bảo quản giảm nhẹ chất bảo quản canxi alginate than bùn, từ 1x109CFU/g xuống 7x108CFU/g từ 1x109CFU/g xuống 8x108CFU/g, theo thứ tự sau 12 tháng bảo quản Mật độ bào tử giảm mạnh chất mang cám gạo, từ 1x109CFU/g, xuống 1x107CFU/g sau tháng bảo quản 1x 105 CFU/g sau 12 tháng bảo quản Do giá thành chất mang canxi alginat đắt than bùn nên chọn than bùn để làm chất bảo quản bào tử chủng A flavus DA2 3.2.3.2 Quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm A.flavus DA2 quy mô pilot Từ kết nghiên cứu thu nhận được, quy trình cơng nghệ nhân ni, thu hồi tạo chế phNm A.flavus DA2 đưa sau: Chủng A.flavus DA2 Trong ống nghiệm môi trường thạch nghiêng PDA Nhân giống cấp bình tam giác 500ml Nhân giống cấp hệ thống tăng lên men chìm sục khí 100 lít/mẻ Ni cấy bề mặt Thu hồi sinh khối bào tử nấm Phối trộn chất mang Đóng gói Chế phẩm AF 10 Thuyết minh quy trình: + Giữ giống Chủng A.flavus DA2 khơng sinh aflatoxin giữ giống ống thạch nghiêng có mơi trường PDA sau cấy sang mơi trường khoai tây lỏng bình tam giác 500ml Thành phần mơi trường khoai tây lỏng: Glucoza 20g/l, dịch chiết khoai tây 1000ml, pH điều chỉnh đến 5,5 + Nhân giống cấp Ni cấy lắc chủng A.flavus DA2 bình tam giác có mơi trường PDA lỏng máy lắc điều chỉnh nhiệt độ Sanyo (Nhật Bản), vận tốc 200 v/ph, nhiệt độ 300C thời gian 48h + Nhân giống cấp Sinh khối chủng A.flavus DA2 chuyển sang hệ thống tăng lên men chìm sục khí 100 lít/mẻ chứa môi trường PDA (pH 5,5) khử trùng làm nguội đến nhiệt độ 300C (điều kiện khử trùng 1atm, thời gian 30 phút) Tỷ lệ tiếp giống 10%, nuôi cấy thời gian 48h, vận tốc khuấy 200 v/ph, nhiệt độ nuôi cấy 300C + Nuôi cấy bề mặt ChuNn bị môi trường cám trấu: cám trấu trộn theo tỷ lệ 4:1 Bổ sung lượng nước để đạt độ Nm 65% độ Nm thích hợp để ni cấy chủng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin Cho nguyên liệu cám trấu vào túi nilong bao PP dệt, túi chứa 5kg cám trấu, hấp khử trùng nhiệt độ 1210C Để nguyên liệu cám trấu nguội đến 300C đổ vào khay có kích thước 80cmx50cmx15cm, độ dày cám trấu 6cm/khay, khay có 5kg mơi trường Tiếp giống với tỷ lệ 10% vào môi trường cám trấu, trộn thật hỗn dịch chủng giống A.flavus DA2 không sinh aflatoxin cám trấu Nuôi cấy chủng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin nhiệt độ 300C ngày Các khay nuôi cấy đặt dàn sắt có kích thước dài 1,2m, rộng 0,6m, cao 1,5m + Thu hồi bào tử tạo chế ph m AF từ chủng A.flavus DA2 Sau kết thúc nuôi cấy, sấy khô sinh khối nhiệt độ 450C 48h Phối trộn lượng sinh khối thu sau sấy với than bùn tỉ lệ sinh khối chủng A flavus DA2 khơng sinh aflatoxin than bùn 1:1 Đóng gói chế phNm AF vào túi polyetylen bảo quản chế phNm nơi khô mát 11 3.3 ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM AF TRÊN NGÔ VÀ LẠC 3.3.1 Nghiên cứu quy mơ phịng thí nghiệm 3.3.1.1 Nghiên cứu tỷ lệ chủng sinh aflatoxin chủng không sinh aflatoxin A flavus DA2 + Khả cạnh tranh chế ph m A.flavus DA2 tỷ lệ khác Hình 3.5 Sắc ký đồ thể khả cạnh tranh chế ph m A flavus DA2 tỷ lệ khác Chú thích: Chu n: ChuNn aflatoxin; Mẫu M1: Tỷ lệ AF14/DA2 = 3/1; Mẫu M2: Tỷ lệ AF14/DA2 = 2/1; Mẫu M3: Tỷ lệ AF14/DA2 = 1/1; Mẫu M4: Tỷ lệ AF14/DA2 =1/2 Chủng sinh độc tố A.flavus AF14 tiến hành nuôi cấy đồng thời với chế phNm chứa chủng không sinh độc tố A flavus DA2 môi trường ngô hạt trùng với tỷ lệ (chủng AF14/DA2): 3/1, 2/1, 1/1 1/2 cho mật độ bào tử tổng số đạt 1,5x105 CFU/g ngô Sau ngày nuôi cấy tiến hành tách chiết độc tố xác định hàm lượng aflatoxin sắc ký TLC Kết phân tích cho thấy khả ức chế tạo aflatoxin không cao tỉ lệ chủng A flavus DA2 không sinh aflatoxin sử dụng thấp chủng AF14 sinh aflatoxin Vết aflatoxin hồn tồn mẫu ngơ tỉ lệ A flavus DA2 cao A.flavus AF14 sinh aflatoxin + Khả cạnh tranh chế ph m A flavus DA2 đất trồng ngô, lạc quy mơ phịng thí nghiệm Tiến hành nhiễm đồng thời chủng A.flavus AF14 sinh độc tố A flavus DA2 đất trồng ngô, lạc tiệt trùng với mật độ tổng số 2x105 CFU/g Kết nghiên cứu khả cạnh tranh chủng A flavus DA2 không sinh aflatoxin đất trồng ngô, lạc tỷ lệ khác trình bày bảng 3.1 12 Bảng 3.1 Khả cạnh tranh chủng A flavus DA2 bón vào đất tỷ lệ khác Tỷ lệ chủng AF14/DA2 nhiễm vào đất (%) Tỷ lệ chủng AF14/DA2 sau nhiễm vào đất 01 tháng (%) AF14 DA2 AF14 DA2 100 100 60 40 25,13 74,87 50 50 100 40 60 100 20 80 100 Chủng A.flavus DA2 thể tính cạnh tranh cao chủng A flavus AF14 sinh aflatoxin Sau nhiễm vào đất trồng ngô, lạc tháng, tỷ lệ chủng A flavus AF14:DA2 từ 60:40; 50:50; 40:60 20:80 chuyển thành 25,13: 74,87; 0:100; 0:100; 0:100, theo thứ tự Với tỉ lệ 1/1 chủng A flavus DA2 ức chế hồn tồn chủng A.flavus AF14 sinh aflatoxin, cao so với kết nghiên cứu Brown cộng nuôi cấy hỗn hợp hai chủng sinh không sinh độc tố với tỷ lệ 1/1 (giảm aflatoxin ngô 78%) Kết 3.1 rằng, để đạt hiệu cạnh tranh cao cần bổ sung chế phNm DA2 vào môi trường với mật độ lớn chủng A flavus sinh độc tự nhiên 3.3.1.2 Ảnh hưởng thời điểm sử dụng đến khả cạnh tranh chế phẩm A flavus DA2 Chủng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin chủng A.flavus AF14 sinh aflatoxin cấy đồng thời cấy cách 24 lên môi trường ngô hạt trùng (tỉ lệ 1/1 mật độ tổng 1,5.105 CFU/g ngô) Sau ngày nuôi 28oC, tiến hành tách chiết độc tố kiểm tra hàm lượng aflatoxin môi trường ni cấy sắc kí mỏng để xác định thời điểm sử dụng chế phNm hợp lí cho hiệu cạnh tranh cao 13 Mẫu Mẫu Mẫu Chu n Hình 3.6 Sắc ký TLC thể khả đối kháng chế ph m A flavus DA2 thời điểm cấy khác Chú thích: ChuNn: ChuNn aflatoxin B1; Mẫu 4: Chủng A flavus DA2 cấy trước chủng A flavus AF14 24h; Mẫu 5: Cấy đồng thời chủng A flavus DA2 A flavus AF14; Mẫu 6: Chủng A flavus AF14 cấy trước chủng A.flavus DA2 24h Kết phân tích aflatoxin hình 3.6 cho thấy, mẫu ngơ cấy chế phNm A.flavus DA2 trước AF14 24h, không phát aflatoxin Ở mẫu ngô cấy đồng thời A.flavus DA2 AF14 cho hiệu giảm nhiễm aflatoxin cao, vết aflatoxin mờ so với mẫu cấy chủng A.flavus AF14 sinh aflatoxin trước chế phNm A.flavus DA2 Hiệu giảm nhiễm aflatoxin đạt trường hợp chủng A.flavus DA2 cấy trước cấy đồng thời với chủng AF14 cao Do đó, khẳng định, triển khai đồng ruộng nên sử dụng chế phNm A.flavus từ đầu vụ trước gieo trồng để tạo ưu cạnh tranh Sử dụng lượng lớn chế phNm A.flavus DA2 hiệu cạnh tranh cao cho dù đất bị nhiễm A.flavus sinh độc tố từ trước 3.3.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng thuốc bảo vệ thực vật hóa học đến sinh trưởng, phát triển khả cạnh tranh chủng A flavus DA2 + Ảnh hưởng thuốc bảo vệ thực vật hóa học đến khả phát triển chủng A.flavus DA2 Thuốc bảo vệ thực vật người dân sử dụng phổ biến để diệt sâu trừ cỏ ngô, lạc thuốc trừ sâu Sumithion 50EC (chứa 95% hoạt chất Fenitrothion công ty Sumitomo Chem Co.,Ltd Nhật Bản sản xuất) thuốc diệt cỏ Saicoba 800EC (chứa 80% hoạt chất Acetochlor công ty Cổ phần Bảo vệ Thực vật Sài Gòn sản xuất) chọn để sử dụng thí nghiệm 14 Kết nghiên cứu cho thấy, thuốc trừ sâu Sumithion 50EC thuốc trừ cỏ Saicoba 800EC không ảnh hưởng đến phát triển sinh khối A.flavus DA2 điều kiện phịng thí nghiệm Khi tăng lượng thuốc bảo vệ thực vật gấp lần nồng độ sử dụng ngồi thực tế khơng thấy có ảnh hưởng đến phát triển sinh khối A flavus DA2 (Nồng độ khuyến cáo sử dụng Sumithion 50EC 2,5ml/l, Saicoba 800EC 1,5ml/l) + Ảnh hưởng thuốc bảo vệ thực vật hóa học đến khả cạnh tranh chế ph m A.flavus DA2 Chủng A.flavus DA2 chủng sinh độc tố A.flavus AF14 nuôi cấy đồng thời môi trường PDA lỏng (tỉ lệ 1:1, với mật độ tổng 1,5x105 CFU/ml), lắc 200 vòng/phút 300C để nghiên cứu ảnh hưởng loại thuốc trừ sâu Sumithion 50EC thuốc trừ cỏ Saicoba 800EC đến khả cạnh tranh chế phNm AF A.flavus AF14 Các loại thuốc bổ sung vào mẫu thí nghiệm với nồng độ thông thường khuyến cáo sử dụng (thuốc trừ sâu 2,5 ml/l, thuốc diệt cỏ 1,5 ml/l) Sau ngày nuôi, tiến hành thu dịch nuôi, tách chiết xác định hàm lượng aflatoxin phương pháp sắc kí mỏng TLC Hình 3.7 Khả đối kháng chủng A flavus DA2 có mặt thuốc bảo vệ thực vật TLC Chú thích: 1: Aflavus DA2 ni cấy mơi trường có thuốc trừ cỏ; 2: Aflatoxin B1 chuNn; 3: Aflavus AF14 ni cấy mơi trường có thuốc trừ cỏ; 4: Hỗn hợp DA2 AF14 nuôi cấy mơi trường có thuốc trừ cỏ; 5: Aflavus DA2 ni cấy mơi trường có thuốc trừ sâu; 6: Hỗn hợp DA2 AF14 nuôi cấy môi trường có thuốc trừ sâu; 7: Aflavus AF14 ni cấy mơi trường có thuốc trừ sâu; Kết hình 3.7 cho thấy, thuốc diệt cỏ Saicoba 800EC thuốc trừ sâu Sumithion 50EC không làm giảm khả cạnh tranh chủng A.flavus DA2 Khi nuôi cấy hỗn hợp chủng DA2 AF14 môi trường khoai tây lỏng có 15 bổ sung loại thuốc hóa học vết aflatoxin mỏng mờ đi, chứng tỏ hiệu giảm nhiễm aflatoxin đạt cao 3.3.2 Nghiên cứu quy mô đồng ruộng 3.3.2.1 Đánh giá mức độ nhiễm A flavus đất trồng ngô, lạc Một vấn đề quan trọng nhiều nhà khoa học quan tâm có mặt lồi nấm gây hại A flavus đất trồng số tỉnh Việt Nam Mật độ có ảnh hưởng lớn đến chất lượng nơng sản nói chung giai đoạn sau thu hoạch Các chủng nấm mốc A flavus nhiễm đất trồng ngô, lạc tỉnh Vĩnh Phúc, Nghệ An, Đắc Nông phân lập theo phương pháp Raper Fennel Kết nghiên cứu rằng, mật độ nhiễm A flavus đất trồng ngô, lạc Việt Nam cao (>104CFU/g đất), cần có biện pháp phịng chống nấm mốc độc tố chúng từ giai đoạn đồng ruộng Những kết điều tra khảo sát mức độ nhiễm loài A flavus sinh aflatoxin đất trồng ngô, lạc tỉnh sở quan trọng việc xây dựng liều sử dụng thích hợp chủng A flavus DA2 không sinh aflatoxin dùng để phịng chống aflatoxin ngơ, lạc địa phương 3.3.2.1 Khả cạnh tranh chủng A flavus DA2 (Chế phẩm AF) đất trồng ngô ngơ giai đoạn đồng ruộng q trình bảo quản + Khả cạnh tranh chế ph m AF đất trồng ngô Kết bảng 3.2 rằng, ruộng ngô đối chứng không sử dụng chế phNm AF tổng mật độ nấm A.flavus đất trồng ngơ 2,0x104 CFU/g, mật độ chủng A.flavus sinh aflatoxin chiếm 90% số chủng A.flavus phân lập Khi sử dụng lần, lần lần chế phNm AF, tỷ lệ chủng A.flavus sinh aflatoxin đất trồng ngô giảm từ 90% xuống 39,4%, 7,3% 4,5% theo thứ tự Như vậy, chủng A flavus DA2 có khả cạnh tranh cao thay chủng A flavus sinh aflatoxin tồn tự nhiên đất, làm giảm rõ rệt mật độ chủng A flavus sinh aflatoxin đất trồng ngô Kết phù hợp với nghiên cứu Robert công sử dụng chủng A flavus AF36 để phòng chống A flavus aflatoxin ngơ, chủng có tác dụng giảm 95% A flavus sinh aflatoxin đất trồng ngô 16 Bảng 3.2 Khả cạnh tranh A flavus DA2 không sinh aflatoxin đất trồng ngô sử dụng chế ph m AF Mật độ A.flavus tổng số đất x104 (CFU/g) Mật độ chủng A flavus sinh aflatoxin đất x104 (CFU/g) Tỷ lệ chủng A.flavus sinh aflatoxin (%) Ngô không sử dụng chế phNm AF (ĐC) 2,00 ± 0,05 1,800 ± 0,12 90,0 Ngô sử dụng lần chế phNm AF 2,10 ± 0,13 0,828 ± 0,04 39,4 Ngô sử dụng lần chế phNm AF 2,16 ± 0,08 0,158 ± 0,07 7,3 Ngô sử dụng lần chế phNm AF 2,20 ± 0,11 0,100 ± 0,05 4,5 Cơng thức thí nghiệm + Khả giảm A.flavus sinh aflatoxin aflatoxin ngô bắp trước thu hoạch chế ph m AF Christensen Clyde có nghiên cứu công phu nguyên nhân nhiễm nấm mốc q trình bảo quản nơng sản Tác giả cho thấy, đất nơi phát sinh nấm mốc Các nấm nhiễm vào rễ cây, phát tán theo gió, trùng nhiễm vào bên hạt lương thực Vì vậy, nơng sản bị nhiễm A.flavus aflatoxin từ giai đoạn đồng ruộng Khi ứng dụng chế phNm AF quy mô đồng ruộng, chủng A.flavus không độc dần thay chủng độc, kết chủng gây độc giảm, chủng không độc tăng với giảm hàm lượng aflatoxin Các bắp ngô ruộng sử dụng không sử dụng chế phNm AF lấy mẫu theo phương pháp đường chéo, ruộng thí nghiệm lấy 100 bắp tẽ lấy hạt sau trộn lấy 1kg làm mẫu đại diện, sau lấy 100g làm mẫu phân tích aflatoxin sắc ký mỏng TLC Hiệu giảm nấm mốc aflatoxin ngô hạt trước thu hoạch thể bảng 3.3 17 Bảng 3.3 Hiệu giảm A.flavus sinh aflatoxin aflatoxin A flavus DA2 ngô bắp giai đoạn trước thu hoạch Các tiêu đánh giá Cơng thức thí nghiệm Tỷ lệ hạt Hàm lượng Hiệu nhiễm A aflatoxin giảm flavus sinh ngô aflatoxin aflatoxin (%) hạt (ppb) (%) Ngô không sử dụng chế phNm AF 15 ± 1,24 ± 0,05 Ngô sử dụng lần chế phNm AF ± 1,70 100 Ngô sử dụng lần chế phNm AF 0 100 Ngô sử dụng lần chế phNm AF 0 100 Ngô bắp thu hoạch từ lô không sử dụng chế phNm AF (ĐC), tỷ lệ hạt nhiễm A.flavus sinh aflatoxin trung bình 15%, hàm lượng aflatoxin trung bình ngơ lơ khơng bón chế phNm AF ppb Trong đó, ngơ bắp thu hoạch từ lơ thí nghiệm sử dụng lần chế phNm AF tỷ lệ hạt nhiễm A.flavus sinh aflatoxin trung bình 5%, khơng phát thấy aflatoxin mẫu ngơ hạt phân tích Ở ngơ bắp thu hoạch từ lơ bón lần chế phNm AF, không phát chủng A.flavus sinh aflatoxin hạt ngô không phát aflatoxin hạt ngơ phân tích Chứng tỏ chủng A flavus DA2 có khả cạnh tranh cao với chủng A.flavus sinh aflatoxin vốn nhiễm tự nhiên hạt ngô giai đoạn trước thu hoạch ức chế tạo aflatoxin chủng + Khả giảm A.flavus sinh aflatoxin aflatoxin ngô bảo quản chế ph m AF Ngô thu hoạch từ đợt sử dụng chế phNm AF (từ đợt thứ đến đợt thứ 3) đưa vào bảo quản theo dõi thời gian tháng để đánh giá hiệu cạnh tranh chế phNm AF từ chủng A flavus DA2 Toàn thử nghiệm tiến hành từ tháng 12/2007 - 6/2009 kho bảo quản xã Tam Hồng, huyện Yên Lạc, tỉnh Vĩnh Phúc; quy mơ bảo quản 01 tấn/mơ hình Hiệu phịng chống nấm mốc aflatoxin ngơ chế phNm AF trình bảo quản trình bày bảng 3.4 18 Bảng 3.4 Hiệu phòng chống A.flavus sinh aflatoxin aflatoxin chế ph m AF ngô sau thời gian bảo quản tháng Các tiêu đánh giá Cơng thức thí nghiệm Tỷ lệ hạt nhiễm A.flavus sinh aflatoxin (%) Hàm lượng aflatoxin trung bình hạt ngơ (ppb) Hiệu giảm aflatoxin (%) Ngô không sử dụng chế phNm AF 100 98,0 ± 1,02 Ngô sử dụng 01 lần chế phNm AF 50 55,0 ± 0,75 53,9 Ngô sử dụng 02 lần chế phNm AF 10 12,6 ± 1,05 87,1 Ngô sử dụng 03 lần chế phNm AF 3,0 ± 0,93 97,0 Sau tháng bảo quản, ngô hạt thu hoạch từ lô không sử dụng chế phNm AF 100% hạt bị nhiễm A flavus sinh aflatoxin, hàm lượng aflatoxin trung bình ngơ hạt 98ppb Trong đó, ngơ hạt thu hoạch từ lô sử dụng lần chế phNm AF có 50% hạt bị nhiễm A flavus sinh aflatoxin, hàm lượng aflatoxin trung bình 55ppb, hiệu giảm aflatoxin 56% so với ngô thu hoạch từ lô không sử dụng chế phNm AF Ngô thu hoạch từ ruộng sử dụng 02 lần chế phNm AF có 10% hạt bị nhiễm A flavus sinh aflatoxin, hàm lượng aflatoxin trung bình ngơ hạt 12,6%, hiệu giảm aflatoxin so với lô đối chứng 87,1% Ngô hạt thu hoạch lô sử dụng lần chế phNm AF hồn tồn khơng có A flavus sinh aflatoxin, hàm lượng aflatoxin trung bình 3ppb, hiệu giảm aflatoxin so với lô đối chứng 97% Kết cho thấy, chủng A flavus DA2 có khả cạnh tranh cao với chủng A flavus sinh aflatoxin vốn nhiễm tự nhiên với tần suất cao ngô trình bảo quản ức chế phát triển giảm tạo aflatoxin chủng 19 3.3.2.2 Khả cạnh tranh chủng A flavus DA2 không sinh aflatoxin đất trồng lạc lạc giai đoạn đồng ruộng trình bảo quản + Khả giảm nhiễm A.flavus sinh aflatoxin aflatoxin lạc trước thu hoạch chế ph m AF Chế phNm AF sử dụng đợt cho lạc quy mô 01ha vụ lạc liên tiếp từ 2/2007-12/2008 xã Tam Hồng, huyện Yên Lạc, tỉnh Vĩnh Phúc Liều sử dụng 01 kg/sào, giai đoạn lạc 15-20 ngày sau trồng Sau vụ tiến hành lấy mẫu đất lơ thí nghiệm đối chứng, phâp lập đánh giá tỷ lệ chủng A.flavus sinh không sinh aflatoxin đất Hiệu cạnh tranh chủng A flavus DA2 đất trồng lạc trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5 Khả cạnh tranh A flavus DA2 không sinh aflatoxin đất trồng lạc sử dụng chế ph m AF Lơ thí nghiệm Mật độ A Mật độ Tỷ lệ chủng A flavus tổng chủng A flavus sinh số đất flavus sinh aflatoxin trồng lạc aflatoxin đất trồng lạc (%) x10 (CFU/g) đất trồng lạc x104 (CFU/g) Lạc không sử dụng chế phNm AF 2,50 ± 0,13 2,00 ± 0,15 80,0 Lạc sử dụng lần chế phNm AF 2,56 ± 0,31 1,48 ± 0,23 58,0 Lạc sử dụng lần chế phNm AF 2,62 ± 0,16 0,290 ± 0,06 11,0 Lạc sử dụng lần chế phNm AF 2,70 ± 0,10 0,135 ± 0,02 5,0 Kết bảng 3.5 rằng, lô lạc không sử dụng chế phNm AF tổng mật độ nấm A.flavus trung bình đất trồng lạc 2,5x104 CFU/g, mật độ chủng A.flavus sinh aflatoxin (chủng phát quang màu xanh nước biển môi trường Czapek cải tiến) 2x104 CFU/g, chiếm 80% số chủng A.flavus phân lập Ở lơ thí nghiệm sử dụng 01 lần chế phNm AF, mật độ chủng 20 A.flavus sinh aflatoxin 1,48x104 CFU/g, chiếm 58% tổng số chủng A.flavus phân lập đất trồng lạc Khi sử dụng 02 lần chế phNm AF, mật độ chủng A.flavus sinh aflatoxin trung bình 2,9x103 CFU/g, chiếm 11% số chủng A.flavus phân lập Ở lô lạc dùng 03 lần chế phNm AF, mật độ chủng A.flavus sinh aflatoxin trung bình 1,35x103 CFU/g, chiếm 5% tổng số chủng A.flavus phân lập đất trồng lạc Điều chứng tỏ, chủng A flavus DA2 có khả cạnh tranh cao thay chủng A.flavus sinh aflatoxin tồn tự nhiên đất trồng lạc lơ thí nghiệm, làm giảm rõ rệt mật độ chủng A.flavus sinh aflatoxin đất trồng lạc Kết phù hợp với nghiên cứu Cotty cộng sử dụng chủng khơng sinh aflatoxin A flavus 36 để phịng chống A.flavus aflatoxin lạc, chủng có tác dụng giảm 80-95% A flavus sinh aflatoxin đất trồng lạc Bảng 3.6 Hiệu giảm A.flavus sinh aflatoxin aflatoxin chủng A flavus DA2 lạc củ giai đoạn trước thu hoạch Các tiêu đánh giá Cơng thức thí nghiệm Tỷ lệ hạt Hàm lượng nhiễm A.flavus aflatoxin sinh aflatoxin lạc (%) (ppb) Hiệu giảm aflatoxin (%) Lạc không sử dụng chế phNm AF 10 ± 1,95 15,24 ± 1,03 Lạc sử dụng 01 lần chế phNm AF 7,0 ± 1,23 9,13 ± 1,48 40,10 Lạc sử dụng lần chế phNm AF 3,0 ± 0,78 5,62 ± 0,89 63,13 Lạc sử dụng lần chế phNm AF 2,05 ± 0,72 86,55 Lạc hạt từ mẫu lạc củ giai đoạn trước thu hoạch từ lô không sử dụng chế phNm AF tỷ lệ hạt nhiễm A flavus sinh aflatoxin trung bình 10%, hàm lượng aflatoxin 15,24 ppb Trong đó, lạc hạt từ mẫu lạc củ giai đoạn trước thu hoạch từ lô sử dụng 01 lần chế phNm AF có 7% hạt bị nhiễm A flavus sinh aflatoxin, hàm lượng aflatoxin lạc 9,13 ppb, hiệu giảm 40,10 % Ở lạc hạt từ mẫu lạc củ thu thập giai đoạn trước thu hoạch từ lô sử dụng lần chế phNm AF, không phát A flavus sinh aflatoxin Hàm lượng aflatoxin lơ thí nghiệm sử dụng lần chế phNm AF 2,05 ppb (Hiệu 21 giảm aflatoxin 86,55%) Kết cho thấy, chủng A flavus DA2 sau bón vào đất có khả cạnh tranh cao với chủng A flavus sinh aflatoxin vốn nhiễm tự nhiên lạc giai đoạn trước thu hoạch ức chế tạo aflatoxin chủng + Khả giảm A.flavus sinh aflatoxin aflatoxin lạc bảo quản chế ph m AF Lạc thu hoạch từ lô sử dụng không sử dụng chế phNm AF phơi khơ đến độ Nm 10%, đóng bao dứa tráng polyethylen đưa vào bảo quản kho bảo quản xã Tam Hồng, huyện Yên Lạc, tỉnh Vĩnh Phúc nhiệt độ từ 250C đến 350C Quy mơ bảo quản 01 tấn/mơ hình Sau tháng bảo quản tiến hành lấy mẫu phân tích tỷ lệ nhiễm mốc hàm lượng aflatoxin hạt Hiệu cạnh tranh chủng A flavus DA2 lạc bảo quản trình bày bảng 3.7 Bảng 3.7 Hiệu giảm A.flavus sinh aflatoxin aflatoxin chủng A flavus DA2 lạc sau thời gian bảo quản tháng Các tiêu đánh giá Cơng thức thí Tỷ lệ hạt Hàm lượng Hiệu giảm nghiệm aflatoxin (%) nhiễm A.flavus aflatoxin lạc hạt (ppb) sinh aflatoxin (%) Lạc khơng bón chế 100 112 ± 2,08 phNm AF Lạc bón lần chế 45 62 ± 2,64 45,0 phNm AF Lạc bón lần chế 25 ± 1,52 77,7 phNm AF Lạc bón lần chế ± 1,05 95,6 phNm AF Sau tháng bảo quản, lạc từ lô không sử dụng chế phNm AF có 100% hạt bị nhiễm A flavus sinh aflatoxin, hàm lượng aflatoxin trung bình lạc hạt 112 ppb, lạc hạt bảo quản lơ thí nghiệm sử dụng 01 lần chế phNm AF tỷ lệ hạt nhiễm A flavus sinh aflatoxin 45%, hàm lượng aflatoxin trung bình 62 ppb, hiệu giảm aflatoxin 45% so với lạc thu hoạch từ lô không sử dụng chế phNm AF 22 Lạc thu hoạch từ lơ thí nghiệm sử dụng 02 lần chế phNm AF tỷ lệ hạt nhiễm A flavus sinh aflatoxin 8ppb, hàm lượng aflatoxin trung bình hạt 25 ppb, hiệu giảm aflatoxin so với lô đối chứng 77,7% Lạc thu hoạch lô sử dụng 03 lần chế phNm AF, không phát thấy nhiễm A flavus sinh aflatoxin, hàm lượng aflatoxin trung bình lạc 5ppb, hiệu giảm aflatoxin so với lô đối chứng 95,6% Kết cho thấy, chủng A flavus DA2 có khả cạnh tranh cao với chủng A flavus sinh aflatoxin vốn nhiễm tự nhiên với tần suất cao lạc bảo quản, đồng thời làm giảm hàm lượng aflatoxin lạc trình bảo quản KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã phân lập chủng A flavus DA2 không sinh aflatoxin có khả cạnh tranh cao chủng A flavus AF14 sinh độc tố, hiệu giảm aflatoxin đạt 85% A flavus DA2 khơng mang gen aflr, verb nor A.flavus DA2 ổn định mặt di truyền, không sinh aflatoxin sau cấy chuyền 15 hệ, khơng gây độc tính cấp chuột bạch, không xác đinh liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (LD50) Đã xây dựng quy trình nuôi cấy bề mặt chủng A.flavus DA2 để thu nhận tạo chế phNm AF đối kháng không sinh aflatoxin môi trường nuôi cấy cám trấu (tỷ lệ 4:1) với độ Nm 65%, pH =5,5, nhiệt độ nuôi cấy 30oC, thời gian nuôi cấy ngày, mật độ bào tử đạt 2,0x109CFU/g Tạo chế phNm AF không sinh aflatoxin với chất mang than bùn, tỷ lệ sinh khối nấm/than bùn 1:1 chế phNm trì hoạt tính đối kháng sau năm bảo quản nhiệt độ thường túi PE Đã xây dựng mơ hình thử nghiệm chế phNm AF từ chủng Aspergillus flavus DA2 ngô Hiệu giảm aflatoxin ngô bắp giai đoạn trước thu hoạch 100% sau đất trồng ngơ bón lần chế phNm AF Hiệu giảm aflatoxin ngơ hạt có sử dụng chế phNm AF sau tháng bảo quản 97% Đã xây dựng mơ hình thử nghiệm chế phNm AF từ chủng Aspergillus flavus DA2 lạc Hiệu giảm aflatoxin lạc củ giai đoạn trước thu hoạch 86,55% sau đất trồng lạc bón lần chế phNm AF Hiệu 23 giảm aflatoxin lạc hạt có sử dụng chế phNm AF sau tháng bảo quản 95,6% KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu số điều kiện nuôi cấy tạo chế phNm bào tử nấm A.flavus DA2 quy mô pilot Nghiên cứu đánh giá hiệu chế phNm A.flavus DA2 diện rộng nhiều đối tượng nông sản vùng miền khác 24 ... thiểu nhiễm aflatoxin Xuất phát từ lý trên, thực đề tài: ? ?Nghiên cứu tính đối kháng Aspergillus flavus khơng sinh độc tố để phịng chống aflatoxin ngơ lạc? ??, với mục đích nội dung nghiên cứu sau đây:... đây: Mục đích nghiên cứu Kiểm sốt nhiễm aflatoxin ngô, lạc chế phNm Aspergillus flavus không sinh aflatoxin Nội dung nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn chủng Aspergillus flavus không sinh aflatoxin. .. chủng A flavus sinh aflatoxin Nghiên cứu quy trình ni cấy tạo chế phNm bào tử từ chủng Aspergillus flavus không sinh aflatoxin Nghiên cứu ứng dụng chế phNm Aspergillus flavus không sinh aflatoxin