Nghiên cứu khoa học NUÔI CẤY MÔ MỘT SỐ GIỐNG KEO LAI MỚI CHỌN TẠO 1 NUÔI CẤY MÔ MỘT SỐ GIỐNG KEO LAI MỚI CHỌN TẠO Đoàn Thị Mai, Nguyễn Thị Mỹ Hương, Vũ Thị Ngọc Trần Thanh Hương, Văn Thu Huyền Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam TÓM TẮT Phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô cho 3 dòng keo lai BV71, BV73, BV75 mới chọn tạo được áp dụng như các dòng keo lai khác. Hoá chất để khử trùng thích hợp là HgCl 2 nồng độ 0,1%. Thời gian khử trùng là 8 phút. Môi trường nhân chồi : MS* (cải tiến) + BAP 1,5 mg/l cho cả 3 dòng, hệ số nhân đạt 75 đến 8,2 chồi/ cụm.Môi truờng ra rễ : 1/2 MS* (cải tiến)+ IBA 1,5 mg/l tỷ lệ ra rễ đạt từ 89,45% đến 92,27%. Trong giai đoạn nhân chồi có thể phối hợp giữa IBA 1,5 mg/l +NAA 0,5mg/l để nâng cao chất lượng chồi. Tỷ lệ sống của cây đạt trên 90% cho cả 3 dòng Từ khoá : Nuôi cấy mô, Keo lai giống (BV71, BV73, BV75) ĐẶT VẤN ĐỀ Thực tế sản xuất nhiều năm qua cho thấy nhân giống bằng nuôi cấy mô là một công cụ rất hữu ích cho các chương trình chọn giống cây lâm nghiệp. Đây là một trong những phương thức nhân giống làm sạch bệnh có hiệu quả nhất để đưa nhanh các giống cây lâm nghiệp mới chọn tạo vào sản xuất. Trong các nghiên cứu về chọn giống cho keo lai, trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng thuộc ệViện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã tiếp tục chọn lọc được một số dòng keo BV71, BV73, BV75. Đây là những dòng đã được công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật, có tiềm năng sinh trưởng tốt và thích nghi trên nhiều loại lập địa khác nhau. Việc nhân và phát triển các giống này vào sản xuất lâm nghiệp là một yêu cầu thiết yếu của các chương trình chọn, tạo và phát triển các giống cây lâm nghiệp có năng suất cao. Để thực hiện được yêu cầu này, việc nghiên cứu nhân giống cho các đối tượng mới chọn tạo bằng nuôi cấy mô là một việc làm có ý nghĩa trong nghiên cứu và sản xuất. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nuôi cấy - Vật liệu dùng trong nuôi cấy là chồi lấy từ cây gốc các dòng keo lai BV71, BV73, BV75 một năm tuổi . - Các thí nghiệm nhân giống bằng nuôi cấy mô được tiến hành tại phòng nuôi cấy mô của Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng- Viện KHLN. Với các điều kiện: + Số giờ chiếu sáng trong ngày : 10h/ ngày + Cường độ ánh sáng khoảng 2000 - 3000 Lux. + Nhiệt độ phòng nuôi 25 - 28 o C. + pH của các môi trường nuôi cấy được điều chỉnh ở 5,8. Phương pháp nghiên cứu - Các bước của thí nghiệm nhân giống cho các đối tượng nghiên cứu từ khâu xử lý mẫu, khử trùng, nhân chồi, ra rễ và huấn luyện cây con được tiến hành dựa trên quy trình nhân giống cho các dòng keo lai đã được công nhận trước đây (Lê Đình Khả, 1999 Đoàn ịThị Mai và các cộng sự 1998,2001). - Các môi trường nuôi cấy được sử dụng + McCown Woody plant Medium (WPM) + Murashige & Skoog (MS) + Gamborg (B5) 2 tất cả các môi trường được bổ sung về thành phần và liều lượng các chất khác nhau tuỳ theo yêu cầu mỗi thí nghiệm - Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, thí nghiệm được quan sát, theo dõi thường xuyên, số liệu được xử lý thống kê trên máy tính bằng chương trình Exell (Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khôi, 1966). KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Xác định loại hoá chất khử trùng thích hợp Bảng 1. Kết quả thí nghiệm khử trùng Tỷ lệ bật chồi hữu hiệu(%) Hoá chất Thời gian (phút) Tỷ lệ nhiễm (%) Tỷ lệ chết (%) Sd TB Sd 6 80,11 5,08 1,28 2,22 0,00 8 71,13 1,46 2,57 11,11 2,22 10 58,52 0,00 3,39 8,15 1,28 HgCl 2 0,1% 12 45,17 2,24 5,13 4,44 0,00 10 90,50 2,09 3,39 2,96 1,28 15 72,17 10,79 9,25 4,44 0,00 20 71,21 2,12 2,22 2,96 1,28 25 60,14 2,82 7,14 5,19 1,28 Canxihypoclorit 10% 30 52,34 1,73 2,57 2,96 1,28 Kết quả thí nghiệm cho thấy, đối với keo lai nói riêng và một số loài cây rừng nói chung, HgCl 2 là loại hoá chất khử trùng có hiệu quả nhất. Qua các thí nghiệm khử trùng tỷ lệ mẫu nhiễm khi được khử trùng bằng HgCl 2 chiếm từ 45,17% đến 80,11% tổng số mẫu thí nghiệm, trong khi đó tỷ lệ này chiếm từ 52,34% đến 90,50% khi sử dụng Canxihypoclorit để khử trùng. Kết quả thí nghiệm khử trùng cũng cho thấy, đối với các dòng keo lai nghiên cứu, việc sử dụng HgCl 2 trong khoảng thời gian từ 8 đến 10 phút là thích hợp nhất. Mẫu vật được khử trùng theo phương pháp này có tỷ lệ mẫu nhiễm thấp (chỉ từ 45,17% đến 80,11%) và tỷ lệ bật chồi khá cao (đạt từ 8,15 đến 11,11%). Hình 1: Kết quả khử trùng keo lai Đánh giá khả năng tái sinh chồi cho từng đối tượng nghiên cứu Để đánh giá khả năng nhân giống từng đối tượng nghiên cứu, việc theo dõi khả năng tái sinh chồi sau quá trình khử trùng cho từng đối tượng đã được tiến hành. Với kết quả xác định nồng độ, hoá chất và phương pháp khử trùng thích hợp từ các thí nghiệm trước. Các dòng Keo lai tự nhiên được khử trùng bằng HgCl 2 0,1% trong thời gian 8 phút, thí nghiệm được tiến hành 3 lần lặp với số mẫu 30 mẫu/dòng/lần lặp, kết quả thu được ở bảng sau: 3 Bảng 2: Đánh giá khả năng tái sinh chồi các dòng keo Tỷ lệ nhiễm (%) Tỷ lệ bật chồi (%) Dòng Trung bình Sd Trung bình Sd BV71 54,81 2,57 12,59 1,28 BV73 51,11 3,85 15,56 2,22 BV75 52,59 5,59 14,81 1,28 Kết quả thí nghiệm cho thấy, cùng một loại hoá chất và phương pháp khử trùng nhưng khả năng tái sinh chồi của từng dòng Keo lai tự nhiên nghiên cứu là khác nhau. Tỷ lệ mẫu nhiễm trung bình của dòng BV73 là thấp nhất trong các dòng nghiên cứu (51,11%), và tỷ lệ mẫu bật chồi cũng đạt cao nhất (15,56%) so với các dòng còn lại. Tuy nhiên, đây chỉ là kết quả bước đầu trong quá trình nhân giống. Để đánh giá khả năng nhân giống cho từng dòng còn phụ thuộc vào các nghiên cứu về nhân chồi và ra rễ tiếp theo. Xác định môi trường nuôi cấy cơ bản cho từng đối tượng Việc xác định môi trường nuôi cấy cơ bản cho các đối tượng nghiên cứu là một bước làm quan trọng trong nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật, là tiền đề cơ bản để có thể thiết kế các thí nghiệm nhân giống tiếp theo. Thí nghiệm được tiến hành trên 3 môi trường khác nhau là: MS, WPM và B5. Đây là ữcác môi trường đã được sử dụng tương đối rộng rãi cho nghiên cứu nhân giống cây rừng bằng nuôi cấy mô. Kết ủquả thí nghiệm được trình bày trong bảng 3. Bảng 3. Kết quả thí nghiệm xác định môi trường nuôi cấy cơ bản Dòng BV71 Dòng BV73 Dòng BV75 Số chồi/cụm Chiều dài chồi (cm) Số chồi/cụm Chiều dài chồi (cm) Số chồi/cụm Chiều dài chồi (cm) Môi trường TB Sd TB Sd TB Sd TB Sd TB Sd TB Sd WPM 3,5 1,2 3,4 1,2 3,6 1,2 3,3 1,1 3,4 1,2 3,3 1,2 MS 4,3 1,1 3,3 0,8 4,7 1,3 3,4 1,1 4,4 1,3 3,7 1,1 B5 3,3 2,1 2,8 1,1 3,3 1,1 3,1 0,9 3,2 1,1 3,2 1,3 Qua kết quả thí nghiệm, môi trường MS là tương đối thích hợp cho quá trình nuôi cấy mô Keo lai, hệ số nhân chồi cao hơn khi sử dụng các loại môi trường còn lại đạt từ 4,3 đến 4,7 chồi/cụm và chiều dài trung bình của chồi đạt từ 3,3 đến 3,7cm, các chồi có chất lượng tốt. Kết quả thí nghiệm này cũng phù hợp với các kết quả nghiên cứu về nhân giống cho các dòng Keo lai trước đây (Nguyễn Ngọc Tân và cộng sự, Đoàn Thị Mai và cộng sự). Hình 2. Chồi Keo lai nuôi cấy sau 20 ngày trong 3 loại môi trường khác nhau Xác định môi trường nhân chồi thích hợp B5 MS WPM 4 Để xác định môi trường nhân chồi thích hợp cho các đối ttượng nghiên cứu, môi trường MS đã được thay đổi về thành phần, tỷ lệ các khoáng chất, vitamin, các axit amin cần thiết cho quá trình phát triển của các mẫu vật nuôi cấy mô (ký hiệu là MS*) được bổ sung BAP và Kinetin riêng rẽ ở các nồng độ từ 1,0 đến 2,0mg/l. Số liệu theo dõi số chồi được hình thành, sự tăng trưởng chiều cao chồi được tổng hợp trong bảng 4 Bảng 4. Ảnh hưởng của BAP và Kn tới khả năng nhân chồi Dòng BV71 Dòng BV73 Dòng BV75 Số chồi/cụm Chiều dài chồi (cm) Số chồi/cụm Chiều dài chồi (cm) Số chồi/cụm Chiều dài chồi (cm) Môi trường MS* + T. b Sd T.b Sd T.b Sd T.b Sd T.b Sd T.b Sd Đối chứng 4,3 1,1 3,3 0,8 4,7 1,3 3,4 1,1 4,4 1,3 3,7 1,1 BAP 1,0 mg/l 6,7 1,3 3,5 1,2 6,5 2,3 3,2 1,2 6,8 1,3 3,7 1,5 BAP 1,5 mg/l 7,5 1,6 4,5 1,4 8,2 1,7 4,6 1,3 7,7 2,1 4,4 1,2 BAP 2,0 mg/l 7,7 1,5 4,1 1,5 7,7 2,1 4,1 1,2 7,6 1,7 4,3 1,7 Kn 1,0 mg/l 4,5 1,4 3,3 1,2 4,5 1,3 3,2 1,3 4,8 1,3 3,6 1,3 Kn 1,5 mg/l 5,5 1,7 3,5 1,2 5,8 1,5 3,6 1,2 5,7 1,4 4,1 1,2 Kn 2,0 mg/l 5,2 1,3 3,1 1,1 4,7 1,4 3,1 1,5 5,5 1,6 4,0 1,3 Kết quả từ bảng 4 cho thấy việc bổ xung chất điều hoà sinh trưởng vào môi trường nuôi cấy đã kích thích mạnh sự phát triển của chồi, kể cả khi sử dụng BAP và Kn ở nồng độ thấp cũng cho số chồi cao hơn so với đối chứng, các công thức dùng BAP đều có tác dụng rõ lên quá trình tạo chồi so với công thức dùng Kn ở cùng nồng độ. Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy ở công thức có BAP nồng độ 1,5mg/l số lượng chồi đạt cao nhất từ 7,5 đến 8,2 chồi/cụm. Riêng dòng BV71 lại có hệ số chồi/cụm cao ở công thức BAP + 2,0mg/l, tuy nhiên chiều cao chồi chỉ đạt trung bình từ 4,1 đến 4,3cm còn (chỉ số này đạt 4,4 đến 4,6cm khi sử dụng BAP nồng độ 1,5mg/l). ¶nh hưởng tổ hợp Cytokinin và Auxin đến chất lượng chồi Để tạo chồi có chất lượng tốt với số lượng lớn chuẩn bị cho giai đoạn ra rễ, các công thức thí nghiệm được bổ sung thêm NAA ở nồng độ khác nhau từ 0,25; 0,5; 0,75mg/l. Số liệu thu thập được thể hiện trong bảng 5 Bảng 5. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA tới khả năng tạo cụm chồi Dòng BV71 Dòng BV73 Dòng BV75 Số chồi/cụm Chiều dài chồi (cm) Số chồi/cụm Chiều dài chồi (cm) Số chồi/cụm Chiều dài chồi (cm) Môi trường MS* + BAP 1,5 mg/l + T. b Sd T.b Sd T.b Sd T.b Sd T.b Sd T.b Sd NAA 0.25 mg/l 6,8 2,6 4,2 1,2 7,2 2,1 4,5 1,3 7,1 2,2 4,4 1,4 NAA 0.5 mg/l 7,5 2,3 5,2 1,5 7,9 1,5 5,5 1,4 7,8 1,9 5,1 2,1 NAA 0.75 mg/l 6,3 2,5 4,8 1,1 6,7 2,3 5,2 1,5 6,6 1,8 4,7 1,8 Như vậy, khi bổ sung thêm NAA vào môi trường nuôi cấy mặc dù hệ số nhân chồi cao nhất chỉ đạt từ 6,3 đến 7,9 chồi/cụm, thấp hơn so với khi chỉ sử dụng BAP riêng lẻ, nhưng chất lượng chồi cũng như chiều cao chồi đã tăng lên rõ rệt, đạt trên 60% số chồi thu được. Từ kết quả thí nghiệm nhân chồi có thể thấy rằng cùng một nồng độ chất thì khả năng nhân chồi của dòng BV73 vẫn cao hơn cả, tiếp theo là dòng BV75 và thấp nhất trong các dòng là BV71. Như vậy, trong quá trình nhân chồi cho các dòng Keo lai này có thể sử dụng IBA riêng rẽ hay phối hợp IBA với NAA tuỳ thuộc vào từng giai đoạn, mục đích nghiên cứu. Ảnh hưởng của các Auxin đến khả năng ra rễ Để xác định môi trường ra rễ thích hợp cho từng đối tượng nghiên cứu các chồi keo đủ tiêu chuẩn được cắt rời cấy vào môi trường 1/2MS* có bổ sung thêm IBA và NAA 5 ở các nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l, số liệu được thu thập sau 20 ngày nuôi cấy. Kết quả được tổng hợp trong bảng 6. Bảng 6. Ảnh hưởng của IBA và NAA đến khả năng ra rễ các dòng keo Dòng BV71 Dòng BV73 Dòng BV75 Môi trường 1/2 MS* + Tỷ lệ ra rễ (%) Chiều dài rễ (cm) Số rễ TB (cái) Tỷ lệ ra rễ (%) Chiều dài rễ (cm) Số rễ TB (cái) Tỷ lệ ra rễ (%) Chiều dài rễ (cm) Số rễ TB (cái) Đối chứng 0,24 1,7 1,4 5,20 2,0 1,7 3,43 1,9 1,8 IBA 0,5 mg/l 75,25 3,5 3,2 77,36 3,7 3,4 77,12 3,7 3,4 IBA 1,0 mg/l 81,23 3,8 3,5 83,48 4,0 3,7 83,4 3,9 3,9 IBA 1,5 mg/l 89,45 3,8 4,2 92,27 4,5 4,5 91,06 3,7 4,3 IBA 2,0 mg/l 83,36 3,2 4,5 91,24 4,3 4,6 86,45 3,2 4,1 NAA 0,5 mg/l 65,24 4,2 2,6 72,47 3,7 3,1 68,14 3,8 3,2 NAA 1,0 mg/l 68,35 3,5 3,1 75,46 3,9 3,5 70,53 4,2 3,6 NAA 1,5 mg/l 70,48 3,2 3,4 77,23 4,4 3,6 75,45 3,6 3,8 NAA 2,0 mg/l 68,52 3,3 3,7 72,6 3,8 3,8 72,18 3,2 4,0 Kết quả cho thấy, đối với 3 dòng Keo lai mới chọn tạo, IBA có tác dụng mạnh mẽ đến quá trình ra rễ, tỷ lệ chồi ra rễ cao hơn so với khi sử dụng NAA ở tất cả các nồng độ. Tỷ lệ ra rễ của các dòng này khi sử dụng IBA đạt từ 75,25 đến 92,27%, trong khi đó NAA đạt cao nhất 77,23%, còn công thức đối chứng tỷ lệ ra rễ chỉ đạt 5,20% là cao nhất. Từ số liệu thu được cho thấy, môi trường 1/2MS* bổ sung IBA với nồng độ 1,5mg/l là thích hợp nhất cho quá trình ra rễ của các dòng. Khi sử dụng môi trường này, tỷ lệ ra rễ của các dòng đạt từ 89,45% đến 92,27%. Do đó, có thể kết luận với các dòng Keo lai môi trường ra rễ thích hợp là môi trường 1/2MS* + IBA nồng độ 1,5mg/l. Về khả năng ra rễ cuả từng dòng Keo lai, từ bảng số liệu thu được có thể nhận xét rằng dòng BV73 cũng là dòng cho tỷ lệ ra rễ cao và đều hơn so với các dòng còn lại. Các chồi ra rễ được huấn luyện và chăm sóc như các dòng Keo lai trước đây ngoài vườn ươm, tỷ lệ sống cao trên 90%, cây con có khả năng sinh trưởng tốt, chất lượng tốt. Hình 4 . Ra rễ Keo lai trong lọ KẾT LUẬN 1. Hoá chất khử trùng thích hợp cho các dòng Keo lai (BV71, BV73, BV75) là HgCl 2 nồng độ 0,1%, thời gian khử trùng thích hợp là 8 phút. 2. Môi trường nuôi cấy thích hợp cho các đối tượng thí nghiệm là MS . 3. Môi trường nhân chồi thích hợp cho cả 3 dòng là MS*(cải tiến) có bổ sung BAP nồng độ 1,5mg/l. 4. Môi trường nâng cao chất lượng chồi cho các dòng Keo lai thí nghiệm là MS* + BAP nồng độ 1,5mg/l + NAA nồng độ 0,5mg/l. 6 5. Môi trường ra rễ thích hợp là 1/2MS* + IBA nồng độ 1,5mg/l. 6. Các chồi ra rễ được huấn luyện và chăm sóc tại vườn ươm như áp dụng cho các giống Keo lai trước đây, tỷ lệ sống cao đạt trên 90%. 7. Trong các dòng Keo lai thí nghiệm, dòng BV73 là dòng có hệ số nhân chồi và tỷ lệ ra rễ cao nhất. TÀI LIỆU THAM KHẢO Đoàn Thị Mai, và cộng sự, 2001. Nhân giống cho một số giống cây rừng có năng suất cao. Hội nghị CNSH toàn quốc, Hà Nội 11/2001. Đoàn Thị Mai , Trần Hồ Quang, Ngô Thị Minh Duyên (1998), Kỹ thuật nhân giống Keo lai bằng nuôi cấy mô phân sinh, Tạp chí Lâm nghiệp,(7), trang 35-36 Lê Đình Khả (1999), Nghiên cứu sử dụng giống lai tự nhiên giữa Keo tai tượng và Keo lá tràm ở Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, trang 170-172 . Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khôi, 1996. Xử lí thống kê kết quả nghiên cứu thực nghiệm nông nghiệp trên máy vi tính. Nhà XB Nông nghiệp. Nguyễn Thiên Hương, (2002). Nhân giống Keo lai và Bạch đàn lai bằng phương pháp nuôi cấy mô. Khoá luận tốt nghiệp, trường đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội. Vũ Thị Ngọc, 2008. Nghiên cứu nhân giống một số dòng Keo lai bằng phương pháp nuôi cấy mô, Khoá luận tốt nghiệp, trường đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội. TISSUE CULTURE FOR SOME NEW SELECTED ACACIA HYBRID CLONES Đoan Thi Mai, Nguyen Thi My Huong, Vu Thi Ngoc Tran Thanh Huong, Van Thu Huyen Forest Tree Improvement Research Centre Forest Science Institute of Vietnam SUMMARY Recently, tissue culture has become a useful tool for forest tree breeding programs. The main advantage of tissue culture technology lies in the production of high quality and uniform planting material that can be multiplied on a year-round basis under disease-free conditions anywhere, irrespective of the season and weather. Propagation research for some new selected acacia hybrid clones has been conducted by the Research Centre for Forest Tree Improvement. The results show that: 1. The most suitable method for new selected acacia hybrid shoot sterilization is soaking in mercuric chloride (HgCl2) 0.1% solution for 8 minutes. 2. As with previous research results, the MS modified media is the best media for all in vitro research steps. 3. The MS modified medium with 1.5 mg/l BAP is suitable for shoot induction. 4. The MS modified medium with 1.5 mg/l BAP and 0.5 mg/l NAA has been used for pre-rooting stage. 5. The 1/2 MS modified medium with 1.5mg/l IBA supplementary is used for in vitro rooting. 6. The percentage of survivors in the nursery reached at least 90%. 7. Of three clones, the BV73 clone has a higher propagative ability than the others. Key words: Tissue culture, tree breeding, Acacia hybrid (BV 71, BV 73, BV 75) . Nghiên cứu khoa học NUÔI CẤY MÔ MỘT SỐ GIỐNG KEO LAI MỚI CHỌN TẠO 1 NUÔI CẤY MÔ MỘT SỐ GIỐNG KEO LAI MỚI CHỌN TẠO Đoàn Thị Mai, Nguyễn. đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội. Vũ Thị Ngọc, 2008. Nghiên cứu nhân giống một số dòng Keo lai bằng phương pháp nuôi cấy mô, Khoá luận tốt nghiệp, trường đại học Khoa học. Trong các nghiên cứu về chọn giống cho keo lai, trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng thuộc ệViện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã tiếp tục chọn lọc được một số dòng keo BV71, BV73, BV75. Đây