NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BACTERIOXIN CỦA LOÀI Lactobacillus plantarum L24 Nguyễn Thị Hoài Hà, Phạm Văn Ty, Nguyễn Thị Kim Quy Trung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội I MỞ ĐẦU Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn Gram (+), không sinh bào tử, có khả lên men đường để tạo axitlactic Vi khuẩn lactic sử dụng rộng rãi đời sống chế biến thức ăn lên men, ủ chua thức ăn cho gia súc, sản xuất axitlactic xử lý môi trường để tránh mùi hôi thối Tuy nhiên vi khuẩn lactic quan tâm nhiều chúng có khả sinh bacterioxin, loại protein có khả tiêu diệt vi khuẩn khác tạo thành kênh làm thay đổi tính thấm màng tế bào, nhiều loại bacterioxin cịn có khả phân giải ADN, ARN công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào Vì bacterioxin dùng nhiều bảo quản thực phẩm, sữa tươi, nước giải khát xử lý môi trường, chế biến thức ăn chăn nuôi Trong báo cáo giới thiệu chủng vi khuẩn lactic sinh bacterioxin phân lập tù nước dưa II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU a Vi sinh vật Chủng vi sinh vật phân lập từ nước dưa giữ bảo quản Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật, Trung tâm Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội b Môi trường MRS dùng nghiên cứu có thành phần sau (g/l): Casein peptone, tryptic digest 10, cao thịt - 10, cao nấm men - 5, glucose -20 Tween 80, K2HPO4 - 2, Naacetate - 5, (NH4)2 citrate - 2.00, MgSO4 H2O - 0.20, MnSO4 H2O - 0.05, nước 1000 ml, pH to 6.2 - 6.8 Khử trùng 121oC 15 phút c Xác định hàm lượng bacterioxin theo phương pháp Brarford [1] d Xác định bacterioxin gel polyacrylamit (SDSPAGE) theo phương pháp Laemmli [4 5] III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN a Đặc điểm hình thái ni cấy Chủng vi khuẩn L24 phân lập từ nước dưa có khuẩn lạc trịn, nhẵn, màu trắng sữa, tế bào có dạng hình que, bắt màu Gram dương, khơng có khả di động, không sinh bào tử, phản ứng catalaza âm tính, có khả đồng hố cacbonhydrat amygdalin, arabinnoza, xenlobioza, fructoza, glucoza, lactoza, maltoza, manitol, melezitoza, saccaroza, không sử dụng sorbitoi Căn vào đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá, dựa theo khoá phân loại Bergey’s [5], chủng L24 xác định thuộc chi Lactobacillus Hình Đặc điểm hình thái tế bào chủng vi khuẩn lactic L24 chụp kính hiển vi điển tử độ phóng đại x 20 000 lần b Xác định thành phần axit diaminopimelic (DAP) thành tếa bào chủng vi khuẩn lactic L24 Các tác giả Schliifer Kandlu [3] cho đồng phân DAP có thành phần peptidoglycan thành tế bào vi khuẩn Gram dương đặc biệt xạ khuẩn vi khuẩn lactic Để xác định đồng phân DAP chủng L24 tiến hành lấy 50mg tế bào ướt cho vào ống thuỷ tinh nút xoáy (cỡ 3x100mm), thuỷ phân 1ml 6N HCl nồi ổn nhiệt 100oC 16 Làm nguội dịch thuỷ phân tới nhiệt độ phòng Dùng giấy sắc ký mỏng TLC để xác định meso-DAP Chấm chừng l dung dịch lên giấy sắc ký mỏng TLC Dùng 1l 0,01M DLdiaminopimelic axit (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) làm dung dịch chuẩn Đặt giấy sắc ký mỏng bồn thuỷ tinh chứa 50ml hỗn hợp methanol - nước 6N HCl - pyridine (80:26:4:10, v/v) lâu Phun dung dịch 0,2% ninhydrin (trong nước bão hoà n - butanol) lên giấy sắc ký mỏng, đặt tủ sấy nhiệt độ 100oC phút) Vết meso-DAP tách rời, xuất từ TLC vết màu xanh đen Hình Kết xác định meso-DAP chủng vi khuẩn lactic sắc ký mỏng Chú thích: Chẩm - meso-DAP chuẩn (Sigma) Chấm 4: Meso - DAP chủng L24 Kết sắc ký cho thấy chủng L24 chứa meso-DAP vi khuẩn có thành tế bào thuộc nhóm IV Dựa vào đặc điểm sinh lý, sinh hoá typ thành tế bào chủng L24, đối chiếu với khố phân loại Ber’sgey xác định chủng thuộc chi Lactobacilus [2] Việc đưa chủng vi sinh vật sống vào môi trường việc làm hệ trọng, phải đảm bảo chắn chủng khơng gây hậu xấu sức khoẻ người môi trường, tiến hành xác định trình tự rADN 16S để định danh xác đến lồi Sau tiến hành phản ứng PCR, trình tự rADN 16S đọc máy đọc trình tự tự động 3100 Avant đoạn mồi đặc hiệu Trình tự đoạn gen tổng hợp có chiều dài 645bp Đây đoạn bền vững so với trình tự đoạn rADN 16S Lactobacillus plantarum, ký hiệu AL 935261 ngân hàng liệu gen Nhật Bản độ tương đồng lên đến 98% Dưới số liệu vế kết so sánh trình tự gen sản phẩm tổng hợp phản ứng PCR với trình tự đoạn gen ngân hàng liệu gen Nhật Bản Hình Điện di sản phẩm PCR chủng L24 gel agaroza 5%, nhuộm bạc Chú thích: M - ADN chuẩn 1kb Ladder (10 000bp) Băng biểu đoạn tổng hợp chủng L24 c Xác định bacterioxin loài Lactobacillus plantarum L24 gel polyacrylamit 15% Bacterioxin vi khuẩn lactic sinh phân tử protein mang điện tích dương, kích thước nhỏ gồm 30 - 60 axit amin, có điểm đẳng điện cao có khả ức chế vi khuẩn có quan hệ chủng loại gần với vi khuẩn sinh bacterioxin [4] Bacterioxin có mặt tất nhóm vi khuẩn lactic như: Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Leuconostoc và, Pediococcus, Trong đó, hai nhóm là: Lactobacillus, Lactococcus đóng vai trò quan trọng Theo hệ thống phân loại Kleen - hammer, bacterioxin chia thành nhóm, dựa trọng lượng phân tử, độ bền nhiệt, có mặt axit amino Do đó, để xác định rõ Lactobacillus plantarum L24 chúng tơi nghiên cứu thuộc nhóm sinh bacterioxin Chủng L24 nuôi cấy tĩnh sau 24 tiến hành phá vỡ tế bào hạ pH xuống 2.5, để qua đêm 4oC Sau chỉnh pH 7,0 đem tủa với aceton 100%, lạnh (giữ -22oC) với thể tích thể tích mẫu Ly tâm 10000vịng trong15 phút Làm khơ mẫu hoà tan trở lại dung dịch đệm l mẫu bacterioxin thô tra vào giếng gelmSorensen pH = 7,0 Lấy 10 polyacrymit 15% Chạy với cường độ dòng điện 1,5A/giếng Cuối nhuộm bạc Kết trình bày hình 34 Hình Điện di đồ gel polyacrylamit 15% Chú thích: Giếng protein chuẩn 200 kDa (Sigma) Giếng băng bacterioxin Lactobacillus plantarum L24, trọnglượng phân tử 15kDa Kết cho thấy trọng lượng phân tử bacterioxin Lactobacillus plantanrum L24 thuộc nhóm lớn, nhóm bacterioxin II, protein kháng khuẩn có trọng lượng phân tử nhỏ từ 10 - 30kDa d Ảnh hưởng nguồn nitơ (N) vô đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp bacterioxin Lactobacillus plantarum L24 Nguồn nitơ vô dễ hấp thụ vi sinh vật muối amon muối nitrat nguồn thức ăn khơng thích hợp nhiều loại vi khuẩn Hầu loại vi sinh vật có khả đồng hố muối amơn Đơi có lồi khơng sử dụng muối ngun nhân chất NH4+ mà sau đồng hố gốc amơn, mơi trường tích lũy gốc anion vô SO4-, HPO42-, làm giảm pH mơi trường Đối với vi khuẩn lactic đặc điểm quan trọng trình sinh trưởng chúng phụ thuộc nhiều vào pH Lactobacillus plantarum L24 tiến hành nuôi tĩnh ổn nhiệt môi trường dịch thể MRS, với tỷ lệ giống 0.5%, có bổ sung nguồn nitơ vơ 0,1% khác thời gian nuôi 48 Xác định khả sinh trưởng sinh tổng hợp bacterioxin Lactococcus plantarum L24 Kết trình bày hình Hình Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp bacterioxin loài Lactobacillus plantarum L24 Một điều dễ nhận thấy bổ sung vào mơi trường lượng nitơ định trước có ảnh hưởng đến sinh trưởng sinh tổng hợp bacterioxin Lactobacillus plantarum L24 Rõ ràng amoni photphat nguồn nitơ vơ thích hợp cho sinh tổng hợp bacterioxin Lactobacillus plantarum L24 Nguyên nhân gây khác gốc phọtphat có tính đệm cao tính axit yếu nên khơng làm giảm pH môi trường nhiều gốc khác Trên môi trường thường sử dụng nguồn nitơ vô khác, sinh trưởng mật độ OD tế bào đạt 2 sinh tổng hợp bacterioxin đạt 52g/ml Điều thuận lợi bổ sung chất khống ni cấy vi sinh vật IV KẾT LUẬN Chủng vi khuẩn lactic L24 có khuẩn lạc trịn, nhẵn, màu trắng sữa, tế bào có dạng hình que, bất màu Gram dương, khơng có khả di động, khơng sinh bào tử, phản ứng catalaza âm tính Có khả đồng hoá cacbonhydrat đặc biệt xyloza Chủng L24 vừa có khả sinh axitlactic vừa có khả sinh bacterioxin II, protein kháng khuẩn có trọng lượng phân tử 10-30kDa Các phân tích trình tự rADN 16S cho thấy chủng L24 Lactobacillus plantarum SUMMARY STUDY ON BACTERIOCIN PRODUCTION OF NEWLY ISOLATEDSTRAIN Lactobacillus plantarum L24 Nguyen Thi Hoai Ha et al The strain of lactic acid bacteriocin L24 was isolated from fermented sour vegetables cell are rods, non sporing, nonnotile, catalase negative Metabolision was predominantly fermentative, lactic acid being formed from glucose homofermentatively, xylose was fermented The analysis of 16S rDNA sequence shows that this strain L24 was identified as Lactobacillus plantarum Bacteriocin II was produced Antibacterial protein with molecular weigh 15kDa were detected by using gel electrothesis SDS-PAGE method TÀI LIỆU THAM KHẢO Bradford, M M 1976 Arapid and Sensitive- Method for the Quantitation of Laemmli, U K.1970 Nature Vol 227 680-685 Buchanan, R.E., and Gillons, N.E Bergey s Manual Determinative Bacteriology Ed William Wilkins Co., Baltimore, 1974 Helo, H; Nilssen O; 1991 Lactococcin A, new bacteriocin from Lactococcus lactis subsp cremoris isolation and characterization of the protein and it’s gene J Bacteriol 173, 3879 – 3887 Kelly, W J 1998 Charaterization of Lactococci isolated from minimally processed fresh fruits and vegetables Int J Food Microbiol., 45 85-92 Yang, R, Johnson, M and Ray, B.1992 Novel method to extract large amounts of bacteriocins from lactic acid bacteria Appl Environ Microbiol 38 3355-3559 ... Xác định khả sinh trưởng sinh tổng hợp bacterioxin Lactococcus plantarum L24 Kết trình bày hình Hình Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp bacterioxin loài Lactobacillus plantarum. .. có ảnh hưởng đến sinh trưởng sinh tổng hợp bacterioxin Lactobacillus plantarum L24 Rõ ràng amoni photphat nguồn nitơ vơ thích hợp cho sinh tổng hợp bacterioxin Lactobacillus plantarum L24 Nguyên... nguồn nitơ (N) vô đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp bacterioxin Lactobacillus plantarum L24 Nguồn nitơ vô dễ hấp thụ vi sinh vật muối amon muối nitrat nguồn thức ăn khơng thích hợp nhiều loại vi