Tiểu luận CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG CHỌN TẠO GIỐNG CÂY TRỒNG Đề tài: Detection of RAPD Polymorphisms in Gladiolus Cultivars With Differing Sensitivities to Fusarium oxysporum f. sp. Gladioli Đa hình RAPD ở các giống Hoa Layơn cảm ứng khác nhau với Fusarium oxysporum f. sp. Gladioli bai bao fusarium.pdf Sinh viên: Nông thị Quỳnh Anh Lớp: CNSH K52 Mục lục References Results and Discussion Materials and Methods Introduction Abstract Abstract • Fusarium oxysporum Schlecht.Cha. F. sp. gladioli (FOG) là tác nhân gây bệnh cây layơn quan trọng nhất. • Một trong những phương pháp thân thiện môi trường nhất để kiểm soát lây lan của nó là sử dụng giống cây trồng nhạy cảm ít nhất với tác nhân gây bệnh. • Tại vị trí mô nằm ở gốc thân trong nhiều giống kháng đã sinh ra các lớp suberin ức chế sự tăng trưởng sợi nấm. • Sử dụng chỉ thị phân tử RAPD phân tích bộ gen từ 9 cây layơn lựa chọn là kháng và nhạy cảm với FOG, tiến hành xác minh mức độ đa hình DNA. • Nucleic acid tổng số khai thác được thực hiện với phương pháp sử dụng DNA chiết tách từ mô cây theo phương pháp chloroform-phenol ở 3 giai đoạn sinh trưởng. • thực hiện thí nghiệm bằng cách sử dụng 14 mồi với Taq polymerase và nồng độ mồi khác nhau. • 5 trong những đoạn mồi được thử nghiệm không cho đa hình, 5 mồi cho đa hình. Thông qua đó xac định đươc một hoăc nhiều tính kháng. Các test cho kết quả lặp lai ở cả 3 giai đoan sinh trưởng. • Nhân dòng các đoạn DNA đa hình quan tâm sẽ cho thấy sự hiện diện khác nhau của các gen đặc trưng liên quan đến tính kháng FOG ở cây lay ơn. Introduction Introduction • Cây lay ơn là một hoa kinh tế quan trọng, canh tác trên toàn thế giới như là một cây trồng trong vườn hoặc cho sản xuất hoa cắt. Các loại nấm soilborne, Fusarium oxysporum Schlecht: Fr F. sp. gladioli (Massey) Snyd. Và Hans. (FOG) (Massey, 1926;. Nelson và cộng sự, 1981), gây vàng và thối thân và củ, là chính. Nó làm giảm chất lượng cành và hoa thương phẩm. Nấm này được tìm thấy trên toàn thế giới và được lan truyền qua vật liệu nhân giống, (et al Garcia-Jimenez, 1986.). Introduction • Để kiểm soát và sự lây lan của loại nấm này, các giống cây ít nhạy cảm với tác nhân gây bệnh, và các hóa chất được đưa vào thí nghiệm. • Điều quan trọng là tìm được những giống cây phù hợp nhạy cảm hay kháng để xác định sự hiện diện của gen liên quan đến sự biểu hiện tính kháng. Introduction • Một loạt các xét nghiệm kháng FOG, chủ yếu dựa vào xét nghiệm sinh học đã được báo cáo bởi (Palmer và Pryor, 1958; Jones và Jenkins, 1975; Dallavalle và Zechini D'Aulerio năm 1994; Löffler và cộng sự, 1997; Straathof et al, 1998) Tuy nhiên, các cơ chế kháng vẫn chưa được hiểu rõ • (Remotti và Loffler, 1996). đã quan sát cơ chế xâm nhập của sợi nấm FOG vào cây và mô chỉ qua các chu bì thân , chủ yếu là ở gốc qua các đốt thân, và vết thương (Dallavalle và Pisi, 1993). • Các mô của nhiều mẫu cây đem thí nghiệm thể hiện kháng qua việc phản ứng với suberization tế bào, tạo thành rào cản ngăn chặn các tác nhân nấm. Introduction • Dùng chỉ thị RAPD phân tích bộ gen của 9 mẫu giống cây lay ơn với mức độ kháng, mẫn cảm khác nhau với FOG đã được thực hiện để xác định khả năng áp dụng phương pháp sàng lọc ADN phân biệt mức độ nhạy cảm và kháng ở cây lay ơn. Materials and Methods • Sử dụng mô cây lay ơn ở đỉnh ngọn lấy mắt ngủ hay chồi 3 khoảng cm, lá từ cây cao 30 cm • Cây mẹ được trồng trong một nhà kính chống côn trùng trong đất tiệt trùng. [...]... tách từ 2 giai đoạn sinh trưởng của cv WP Trong khi giống NL hiển diện nhóm 0.9kbp Sử dụng mồi AL16 (hình 4b), mẫu WP thiếu một đoạn 0,7-kbp hiện diện trong tất cả các giai đoạn của các mẫu khác Băng 0.5-kbp chỉ xuất hiện trong tất cả các giai đoạn của mẫu WP và trong thể không hoạt động của mẫu NL Results and Discussion • Hình 3 Đa hình liên quan đến tính kháng FOG thu được từ 5 cvs cây lai ơn sau khi... mồi (36-45 °C) đã được thử nghiệm trước khi thiết lập các điều kiện phản ứng tối ưu Các điều kiện tiêu chuẩn được sử dụng trong 45 chu kỳ như sau: • 94 ° C trong 1 phút, • 38 ° C trong 1 phút, • 72 ° C trong 2 phút, • biến tính ban đầu ở 94 ° C trong 2 phút, và mở rộng ở 72 ° C trong 8 phút Ống có chứa các thành phần phản ứng ngoại trừ DNA đối chứng âm Results and Discussion • Sau các thí nghiệm trên,... AG12 trong mix C (Bảng 1) Một mẫu không (H2O) là đối chứng âm Results and Discussion Hình 4 hình ảnh RAPD với 2 mồi AD14 ở (a) và mồi AL16 ở (b) cho thấy kết quả cơ bản giống hệt nhau được thể hiện cho tất cả ở cả 3 giai đoạn sinh trưởng trong điều kiện C (bảng 1) Đa hình liên quan đến nhiều tính kháng của WP và NL Đối chúng âm là H2O, và lader Results and Discussion Đa hình đã được quan sát trong. .. Acid nucleic tổng số được chiết xuất từ 1 g mô tươi trong nitơ lỏng theo phương pháp chloroform-phenol được mô tả bởi Prince et al (1993), ngâm trong 100 μLof1XTEbuffer (10 mM Tris Cl [pH 8], 1 mM EDTA [pH 8]) và pha loãng tới 20 ng / μL Cuối cùng tập trung trong nước deionized ( nước khử ion) vô trùng 1 μL DNA tổng số pha loãng này đã được sử dụng trong các xét nghiệm khuyếch đại mô tả dưới đây và... AM14 +) không có các cấu hình đa hình cho giống mẫu và giai đoạn tăng trưởng khác nhau • Bốn mồi (AL7, AF07, M18, AF13) sản xuất băng đa hình không tương quan với mức độ nhạy cảm FOG của mẫu thử nghiệm Results and Discussion • Năm mồi cho các cấu hình tiêu biểu cho một hoặc nhiều giống mẫu kháng Đặc biệt, các mồi AG12 đã không tạo ra một đoạn 0,5kbp trong giống WP nhưng đã tạo ra một dải chênh lệch... quan tới độ nhạy cảm của các giống thử nghiệm Primer AD14 (hình 4a) Results and Discussion • Hình 1 hình ảnh rapd với 3 mồi thử ngiệm dài 10-mers thử nghiệm bằng cách sử dụng Polymed Taqpolymerase với mix A (a) và mix B ở (b) • Một mẫu không có (H2O),1 mẫu có (H2O) đại diện đối chứng âm • 1-kbp DNA ladder Results and Discussion Hình 2 Đa hình cấu hình thu được từ 6 giống cây lai ơn sau khi khuếch đại... sát trong tất cả các giai đoạn sinh trưởng của mẫu NL với 2 mồi (AL16 + và AM14) thấy rằng các nhóm khác biệt được hiện diện đoạn 0,7 và 1 kbp, tương ứng (Hình 2b ) Đối chứng không có mẫu có hoặc không có sự khuếch đại các cấu hình khác biệt rõ ràng từ những mẫu cây lay ơn với tất cả các mồi sử dụng Results and Discussion • Đây là báo cáo đầu tiên RAPD sử dụng trên cây lay ơn để phát hiện đa hình... Primer 0.2 nM (µL) Taq 5U/µL(µL) Mix A 2.50 3.00 0.50 2.00 0.125 Mix B 2.00 3.00 0.50 2.00 0.125 Mix C 2.50 0.50 2.00 0.50 0.20 Materials and Methods Thí nghiệm RAPD được lặp lại 2-4 lần của mỗi giống mẫu trong 25 μL Thử nghiệm riêng rẽ với 2 nồng độ dNTP và taq polymerase (Bảng 1) Bảng 1 RAPD hỗn hợp sử dụng Thành phần Buffer (10X) (µL) MgCl2 2mM(µL) d-NTP 50 µM(µL) Primer 0.2 nM (µL) Taq 5U/µL(µL)... hiện đa hình liên quan đến tính kháng FOG • Các kết quả cho phép xác định các cấu hình đa hình cụ thể với mẫu 2 kháng nhất trong số những mẫu được thử nghiệm với FOG (Dallavalle và Zechini D'Aulerio, 1994) • RAPD đánh dấu liên quan đến sự nhạy cảm khác nhau với FOG đã được phát hiện trong lily (al Straathof và cộng sự, 1996.) Results and Discussion • Đánh dấu RAPD cũng đã được báo cáo để giải thích 85%... âm Results and Discussion • Sau các thí nghiệm trên, các xét nghiệm được thường xuyên thực hiện với tất cả các mồi bằng cách sử dụng nồng độ các thành phần khác nhau (Bảng 1C) • phân tích bằng điện di trong gel agarose 2% với 1 bộ đệm X TBE (0.09 M Trisborat, 0,002 M EDTA, 1 M EDTA [pH 8]), • Sau đó nhuộm gel với ethidium bromide và chụp ảnh Results and Discussion • Các thí nghiệm so sánh 2 Taq polymerase . Tiểu luận CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG CHỌN TẠO GIỐNG CÂY TRỒNG Đề tài: Detection of RAPD Polymorphisms in Gladiolus Cultivars. Materials and Methods • Sử dụng mô cây lay ơn ở đỉnh ngọn lấy mắt ngủ hay chồi 3 khoảng cm, lá từ cây cao 30 cm • Cây mẹ được trồng trong một nhà kính chống côn trùng trong đất tiệt trùng. Materials. chuẩn được sử dụng trong 45 chu kỳ như sau: • 94 ° C trong 1 phút, • 38 ° C trong 1 phút, • 72 ° C trong 2 phút, • biến tính ban đầu ở 94 ° C trong 2 phút, và mở rộng ở 72 ° C trong 8 phút.