Phytase, enzyme phân giải phytate và tiềm năng ứng dụng công nghệ sinh học A. Giới thiệu về phytate Phytate là một dạng phospho hữu cơ chiếm từ 1 đến 5% (w/w) của đậu hạt, ngũ cốc, hột chứa dầu, phấn hoa và hạnh nhân (Cheryan, 1980); hầu hết thực phẩm có nguồn gốc thực vật chứa từ 50% đến 80% phospho tổng là phytate (Harland và Morris, 1995) và dĩ nhiên phytate chứa khoáng liên kết với acid amin và protein. Theo Posternak (1902) là người đầu tiên phát hiện ra phytin. Ông dùng phytin để chỉ một chất phospho trong các loại hạt mà ông khám phá ra và xem nó như sản phẩm trung gian trong quá trình tổng hợp diệp lục tố nhưng Pfeffer tìm ra acid phytic từ năm 1872. Trong tự nhiên, acid phytic tồn tại chủ yếu trong các dạng muối phytate dưới dạng phức hợp với các cation quan trọng cho dinh dưỡng như Ca2+, Zn2+ và Fe2+ và phytate chứa 14-25% phospho, 1,2-2% Canxi, 1-2% kẽm và sắt. Lượng phytate cao nhất trong các loại ngũ cốc, bắp (0,83-2,22%) và trong các loại hạt đậu (5,92- 9,15%) (Reddy, et al., 1989). Phytate làm giảm khả năng tiêu hóa protein, tinh bột và lipit vì phytate tạo phức với protein làm protein kém tan và kháng lại được sự phân giải protein. Acid phytic có thể ảnh hưởng đến sự tiêu hóa tinh bột thông qua sự tương tác với enzyme amylase (Kerovuo, et al., 2000). Ở pH thấp [acid], acid phytic có điện tích âm mạnh vì các nhóm phosphate phân ly không hoàn toàn. Dưới điều kiện này, acid phytic có ảnh hưởng xấu đến khả năng hòa tan protein vì liên kết ion của các nhóm phosphate của acid phytic và các gốc acid amin bị ion hóa (lysyl, histidyl, arginyl). Trong pH acid, acid phytic có thể gắn chặt với các protein thực vật, vì điểm đẳng điện của protein này nằm trong pH 4,0-5,0. Ở pH 6,0-8,0, acid phytic và protein thực vật đều có điện tích âm, phức hợp acid phytic và protein vẫn được hình thành. Việc gắn kết này làm giảm giá trị dinh dưỡng của protein thực vật (Vohra, et al., 2003). B. Thành phần Phytase trong tự nhiên * Phytase từ thực vật Phytase có nhiều trong các loại ngũ cốc như lúa mì, bắp, lúa mạch, gạo, và từ các loại đậu như đậu nành, đậu trắng,… Phytase cũng được tìm thấy trong mù tạt, khoai tây, củ cải, rau diếp, rau bina, và phấn hoa huệ tây (Dvorakova, 1998). Trong hạt đang nảy mầm hoặc trong hạt phấn, phytase có vai trò phân giải phytin (Greene, et al., 1975). Suzuki et al., (1907) là những người đầu tiên sản xuất chế phẩm phytase từ cám gạo và lúa mì. * Phytase từ động vật Collum và Hart (1908) đã phát hiện thấy phytase từ thận và máu dê, phytase cũng phát hiện trong máu các động vật có xương sống bậc thấp hơn như chim, bò sát, cá, rùa biển (Rapoport et al, 1914). Vì phytate hoạt động như một nguyên tố kháng dưỡng trong cơ thể động vật nên các nhà khoa học đã quan tâm và khảo sát hoạt động của phytase trong đường tiêu hóa của nhiều loài động vật. Phytase được tìm thấy trong đường ruột (Patwaradha, 1937) của heo, cừu, bò (Spitzer và Phillip, 1972). Tuy nhiên, phytase trong hệ động vật không đóng vai trò quan trọng trong việc tiêu hóa phytate (Williams và Taylor, 1985). Phytase ruột người cũng có hoạt tính thấp 30 lần so với phytase từ ruột chuột và cũng không có ý nghĩa trong việc tiêu hóa phytate, phytate được tiêu hóa trong hệ tiêu hóa người nhờ lượng phytase trong thực phẩm (Frolich, 1990). Động vật nhai lại tiêu hóa được phytate nhờ hoạt động của phytase được sản xuất bởi hệ vi sinh vật trong dạ cỏ. Lượng phosphate vô cơ giải phóng ra nhờ hoạt động của phytase lên phytate được cả hệ vi sinh vật đường ruột và vật chủ sử dụng (Kerovuo et al., 2000). * Phytase từ vi sinh vật Những vi sinh vật sản xuất phytase có từ nhiều nguồn khác nhau như đất (Cosgrove et al., 1970; Richardson và Hadobas, 1997), động vật dạ cỏ (Lan et al.,2002), bột đậu (Choi et al., 2001), nước biển (Kim et al., 2003), hạt thực vật (Nakano et al., 2000; Greiner, 2004; Greiner và Egki, 2003), điều này cho thấy khả năng thủy phân của phytase có thể được đóng góp một cách rộng rãi trong hệ sinh thái. Được biết là những vi sinh vật sản xuất phytase bao gồm cả những vi khuẩn hiếu khí như Pseudomonas spp (Richardson và Hadobas, 1997; Kim et al., 2002), Bacillus subtilis (Shimizu, 1992) và Klebsiella spp (Greiner et al., 19993), vi khuẩn kị khí như Escherichia coli (Greiner et al., 1993) và Mitsuokella spp (Lan et al., 2002), nấm như Aspergillus spp (Ullah, 1998; Shimizu, 1992) và Penicillum spp (Tseng et al., 2002). Những vi khuẩn hiếu khí như Pseudomonas, Arthrobacter, Staphylococcus và Bacillus thì được xác nhận là có phytase có hoạt tính. + Vi khuẩn sản xuất phytase Phytase có mặt rộng rãi trong thực vật, mô động vật và vi sinh vật kể cả con người. Tuy nhiên, những nghiên cứu đã chỉ ra rằng phytase ở vi sinh vật có ứng dụng nhiều nhất trong kỹ thuật sinh học. Mặc dù việc sản xuất phytase thương mại đều chủ yếu tập trung ở nấm Aspergillus, những nghiên cứu đã đề nghị rằng phytase của vi khuẩn có thể thay thế enzyme phytase từ nấm bởi vì mật độ tập trung cao và nét riêng biệt của chúng, độ bền với sự thủy phân protein cao và hiệu quả xúc tác tốt nhất. Những vi khuẩn sản xuất phytase có thể phân lập từ vùng cạn hoặc từ môi trường nước và phytase thì có mặt rộng rãi trong nhiều loại vi khuẩn khác nhau, như Bacillus, Enterbacteria, vi khuẩn kị khí ở dạ cỏ động vật nhai lại và ở Pseudomonas (Jorquera et al., 2008). Đối với vi khuẩn, phytase được tổng hợp ở cả vi khuẩn gram dương (B. subtilis) và gram âm (Aerobacter aerogegnes, E. coli, các chủng Pseudomonas, Klebsiella). Phytase từ các vi khuẩn gram âm là các protein nội bào trong khi phytase từ các vi khuẩn gram dương là các protein ngoại bào (Choi et al., 2001). Theo kết quả nghiên cứu của Kerovuo et al., (2000), 21 dòng từ giống Bacillus được kiểm tra cho khả năng sản xuất enzyme phytase trên môi trường Luria broth (LB) và trong môi trường có bột bắp, không có dòng nào sản xuất phytase trong môi trường LB. Tuy nhiên, trong môi trường bột bắp thì có 2 dòng B. amyloliquefaciens và 1 dòng B. subtilis sản xuất số lượng lớn phytase. Có 3 dòng thì có khả năng phóng thích lân vô cơ trong môi trường là B. subtilis VTT E- 68013, B. amyloliquefaciens VTT E- 71015, B. amyloliquefaciens VTT E-90408 trong đó dòng B. subtilis VTT E 68013 thì có hoạt tính phytase cao nhất. (Jane et al., 2007). + Phytase từ vi nấm Đối với nấm mốc, hầu hết các chủng nấm mốc đều thuộc các giống Aspergillus, Penicillium, Mucor và Rhizoous ( Liu et al, 1998) và đều sản xuất phytase nội bào có hoạt tính. A. niger được xem là loại nấm mốc sản xuất phytase nấm có hoạt tính cao nhất. A. ficuum NRRL 3135 cũng sản xuất phytase trong môi trường lên men rắn với cơ chất là bột canola (Vohra et al., 2003). Một số nhóm Aspergillus niger thì sản xuất phytase ngoại bào mà chúng có thể cắt phospho từ Calcium phytate trong môi trường acid. Được phân lập từ đất nhưng A. ficuum NRRL 3135 sản xuất hầu hết phytase có hoạt tính trong môi trường tinh bột ngô. Việc sản xuất phytase bị ức chế một cách mạnh mẽ bởi phosphate vô cơ và tỉ lệ C/P trong môi trường (Shieh và Ware, 1968). Hơn 2.000 loài thì được phân lập từ 68 mẫu đất trong môi trường giàu dinh dưỡng. Hoạt tính của phytase ngoại bào thì được tìm thấy trong một vài nấm mốc khác nhau đã được kiểm tra trên môi trường (Shieh và Ware, 1968). C. Tiềm năng ứng dụng của phytase * Dinh dưỡng động vật Các phần của thực vật là một trong những thành phần thức ăn của gia cầm và hơn hai phần ba phospho trong phần phụ phẩm là acid phytic (phytate) (Houssin et al., 2009) và số lượng này rất khó tiêu hóa (Nelson, 1967). Đối với thú nhai lại thì phần phospho này được các enzyme trong các túi của thú này giúp tiêu hóa dễ dàng nhưng với thú một túi như con người, gia cầm, heo, thủy sản lại rất ít enzyme này nên khó tiêu hóa phytate. Nhu cầu phospho này trong bã đậu nành và có loại ngũ cốc khác cùng với những bột xương (chứa phospho) thỏa mãn nhu cầu dinh dưỡng nhưng phần dư thừa phospho trong phân của các loại động vật này sẽ gây ô nhiễm môi trường đồng thời lượng phospho này sẽ là nguồn thức ăn cho vi khuẩn gây bệnh sống trong đất phát triển và phát tán trong nước gây ra hiện tượng nở hoa (Mullaney et al., 2000; Bali và Satyanarayana, 2001) như vậy tại sao chúng ta lại không sử dụng phytase để phân giải phospho trong thức ăn, không cần bổ sung bột xương, giảm thiểu sự thất thoát phospho vào môi trường (Mohanna và Nys, 1999), chỉ cần bổ sung 250 đến 1.000U phytase/kg thức ăn có thể thay thế hoàn toàn lượng bột xương bổ sung (Golovan et al., 2001). * Dinh dưỡng thực phẩm Chế biến thực phẩm cho con người cũng là một lãnh vực ứng dụng của phytase vì cho đến bây giờ chưa có sản phẩm nào có bổ sung phytase vì thế nghiên cứu tập trung vào lãnh vực hấp thu khoáng chất cho hiệu quả hay cải thiện công nghệ chế biến thực phẩm mà thôi (Hussin et al., 2009). Sự hiện diện phytase trong thành phần thực vật đã được ứng dụng nhiều trong đó nấm mốc lên men đậu nành cho sản phẩm đậu nành lên men, có tên là tempe (Fardiaz và Markakis, 1981) vì phytate liên kết với protein và protein phân lập từ đậu nành lại giàu phytate. Ngoài ra, phytase được bổ sung trong sản phẩm protein - đậu nành trước khi xuất xưởng (Simell et al., 1989) vì phytase dễ bị hư trong quá trình nấu nướng nên phytate khó được tiêu hóa và dĩ nhiên ảnh hưởng đến khả năng hấp thu khoáng chất. Bổ sung phytase từ nấm Aspergillus niger vào trong bột mì gia tăng hấp thu sắt (Fe) ở người (Sandberg et al., 1996), làm bánh mì giàu sắt, phospho, protein dễ tiêu vì bánh mì bán ngoài thị trường chứa từ 0,29 đến 1,05% (w/w) acid phytic bằng cách bổ sung nấm mốc này trong quá trình nhồi bột trước khi nướng sẽ làm phytate phân giải hoàn toàn (Knorr et al., 1981) và thành tích đạt được trong lãnh vực chế biến bánh mì là rút ngắn được quá trình lên men bánh mì, gia tăng thể tích bánh (bánh mì nổi hơn bình thường) cũng như cải thiện dinh dưỡng của bánh mì (Haros et al., 2001). * Gia tăng độ phì của đất trồng Findenegg và Nelemans (1993) nghiên cứu phytase trên hàm lượng P dễ tiêu trong đất trồng bắp (ngô), kết quả cho thấy cây bắp phát triển tương quan thuận với hàm lượng phytate được phân giải khi phytase được bổ sung vào đất, nghiên cứu này cũng cho thấy sự gia tăng hàm lượng phytase trong rễ bắp có thể gia tăng hàm lượng P trong rễ cây. Idriss et al. (2002) nhận thấy phytase tiết ra từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens FZB45 kích thích sự phát triển của cây bắp con trồng trong hệ thống vô trùng chứa môi trường dinh dưỡng kiểm soát P trong sự hiện diện của phytate. Kết quả này một lần nữa chứng minh vi sinh vật đất tổng hợp phytase đóng góp một cách có ý nghĩa đến sự dinh dưỡng phospho trong cây (Richardson et al., 2001). * Tổng hợp Inositol phosphate thấp Esters phosphoric thấp (lower inositol phosphates) của myo-inositol (mono, bis, tris and tetrakis-phosphates) giữ một vai trò quan trọng trong quá trình phát tín hiệu vận chuyển qua màng tế bào và cố định Ca trong mô động vật cũng như thực vật (Dasgupta et al., 1996; Kryptofova et al., 1994). Những cơ chế này đã được chứng minh, nhưng tổng hợp hợp chất trên rất khó khăn. Trái lại, sự tổng hợp một enzyme phytase lại dễ dàng hơn trong điều kiện bình thường trong đó sử dụng phytase cho thấy rất là hiệu quả để sản xuất các inositol phosphate khác nhau ví dụ như Siren (1986) sản xuất thành công D-myo-inositol 1,2,6-triphosphate, D-myo- inositol 1,2,5 triphosphate, L-myo-inositol 1,3,4-triphosphate và myo-inositol 1,2,3-triphosphate với sự hỗ trợ của phytase từ nấm men Saccharomyces cerevisiae; tương tự phytase tổng hợp từ nấm mốc Aspergillus niger cho thấy thủy phân hiệu quả IP6 thành nhiều dẫn xuất phosphorylate thấp từ IP5 đến IP2 tùy thuộc vào số lượng enzyme (Dvorakova et al., 2000). * Tiềm năng trong nuôi trồng thủy sản Như chúng ta đã biết, thức ăn chiếm đến 70% giá thành sản phẩm từ vật nuôi (Rumsey, 1993) thế nhưng trong thành phần thức ăn cho thủy sản, heo, gia cầm lại thiếu enzyme thích hợp cho việc phân giải phytin nên vật nuôi khó hấp thu phospho và lượng phospho này sẽ được đào thải ra môi trường. Phytase sẽ bổ sung vào thành phần thức ăn với một lượng nhỏ nhưng đem lại hai lợi ích: hạ giá thành sản phẩm thông qua việc tận dụng lượng Ca, P, Fe, protein dễ tiêu và thải một lượng P rất thấp vào môi trường (Yohra và Satyariatayana, 2003) và nhiều thí nghiệm ứng dụng phytase vào trong thành phần thủy sản đã chứng minh kết luận này (Robinson et al., 1999). Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã và đang nỗ lực tìm cách làm giảm ô nhiễm từ các chất thải ra trong chăn nuôi. Trong quá trình nghiên cứu, các nhà khoa học đã xác định được rằng cần cải thiện khả năng sử dụng các dưỡng chất trong khẩu phần của vật nuôi để hạn chế tối đa lượng phân thải ra. Trước đây, do ít quan tâm đến lượng chất dinh dưỡng bị thải ra ngoài nên hậu quả của việc cho ăn quá nhiều chất dinh dưỡng nhằm tối đa hóa năng suất đã dẫn đến hậu quả là lượng chất dinh dưỡng thải ra quá nhiều qua phân và nước tiểu (chủ yếu là hàm lượng protein, phospho và canxi). Qua những phần trình bày ở trên, phytase được bổ sung vào thành phần thức ăn cho vật nuôi để cải thiện lượng dinh dưỡng hấp thu như phospho, acid amin, khoáng chất và năng lượng nhưng nó cũng góp phần bảo vệ môi trường. Tuy nhiên, phytase từ vi sinh vật nhất là từ vi khuẩn rất khó kiểm soát vì chúng ta chưa giải thích được rõ về cơ chế tổng hợp phytase đặc biệt là các gene điều khiển sinh tổng hợp phytase luôn biến đổi (Liu et al., 1998). Tùy theo nhóm vi sinh vật, như vi khuẩn cũng tùy vào mỗi giống và loài, điều kiện môi trường nuôi cấy, cơ chất… sẽ ảnh hưởng đến năng suất và hoạt tính của phytase (Pandey et al., 2001). Như vậy, nghiên cứu và sản xuất phytase từ vi sinh vật, tối ưu hóa môi trường và điều kiện sinh tổng hợp phytase tốt nhất cũng như bảo quản hoạt tính phytase… để thành một sản phẩm thương mại phải còn nhiều bước nghiên cứu nữa. Bài được tổng hợp từ tài liệu: 1. Hussin, A S M, Farouk A và Salleh H M. 2009. Phytate-degrading enzyme and its potential biotechnological application: A review. J. Agrobiotech 1:1-13. 2. Jorquera M, Martinez D, Maruyama F, Marschner P, và Maria De La Luz Mora. 2008. Current and Future Biotechnological Applications of Bacterial Phytases and Phytase-Producing Bacteria. Microbes Environ. 23:182-191. và những tài liệu khác PGS.TS Cao Ngọc Điệp Viện NC&PT Công ngjhệ sinh học - Đại học Cần Thơ . Phytase, enzyme phân giải phytate và tiềm năng ứng dụng công nghệ sinh học A. Giới thiệu về phytate Phytate là một dạng phospho hữu cơ chiếm từ. tận dụng lượng Ca, P, Fe, protein dễ tiêu và thải một lượng P rất thấp vào môi trường (Yohra và Satyariatayana, 2003) và nhiều thí nghiệm ứng dụng phytase vào trong thành phần thủy sản đã chứng. trong thực vật, mô động vật và vi sinh vật kể cả con người. Tuy nhiên, những nghiên cứu đã chỉ ra rằng phytase ở vi sinh vật có ứng dụng nhiều nhất trong kỹ thuật sinh học. Mặc dù việc sản xuất