ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ (in situ hybridization) phát hiện tác nhân gây bệnh đục thân trên ấu trùng tôm càng xanh (macrobrachium rosenbergii de man, 1879)

72 645 2
ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ (in situ hybridization) phát hiện tác nhân gây bệnh đục thân trên ấu trùng tôm càng xanh (macrobrachium rosenbergii de man, 1879)

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA NUÔI TR ỒNG THỦY SẢN PHẠM THỊ THANH NH ÀN ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI TẠI CHỖ (IN SITU HYBRIDIZATI ON) PHÁT HIỆN TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỤC THÂN TR ÊN ẤU TRÙNG TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879) ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành Bệnh học Thủy Sản Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2008 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA NUÔI TR ỒNG THỦY SẢN PHẠM THỊ THANH NH ÀN ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI TẠI CHỖ (IN SITU HYBRIDIZATION) PHÁT HIỆN TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỤC THÂN TR ÊN ẤU TRÙNG TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879) ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành Bệnh học Thủy Sản Cán bộ hướng dẫn: 1. TS. LÝ THỊ THANH LOAN 2. CN. ĐOÀN VĂN CƯ ỜNG Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2008 i LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành c ảm ơn quý thầy cô trường Đại Học Thuỷ Sản Nha Trang đặc biệt là thầy cô trong bộ môn Bệnh Học Thuỷ Sản đ ã tận tình truyền đạt kiến thức cho chúng em trong thời gian qua. Để hoàn thành tốt luân văn tốt nghiệp n ày tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của cán bộ trong viện nghi ên cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II. V ì vậy em: Chân thành cảm ơn Tiến Sĩ Lý Thị Thanh Loan đ ã hướng dẫn và tạo điều kiện tốt nhất để em ho àn thành báo cáo này. Chân thành cảm ơn CNSH Đoàn Văn Cường đã giúp đỡ và chỉ bảo cho em trong quá trình th ực hiện và hoàn thành báo cáo này. Chân thành cảm ơn anh Nguyễn Doãn Duẩn, người đã giúp đỡ em tận tình và chỉ bảo cho em trong suốt quá tr ình thực hiện báo cáo n ày. Qua đây em cảm ơn các anh chị thuộc Trung Tâm Quan Trắ c đặc biệt là anh chị trong phòng mô học và phòng sinh học phân tử Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Tr ường và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thuỷ Sản Khu Vực Nam Bộ - Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II. Do trình độ bản thân còn hạn chế và thời gian có hạn nên trong báo cáo không tránh kh ỏi sai sót, rất mong được sự đóng góp ý ki ến của thầy cô v à bạn bè. Tp. HCM tháng 11/2008 Sinh viên thực hiện Phạm Thị Thanh Nh àn ii MỤC LỤC ĐỀ MỤC TRANG LỜI CẢM ƠN. i DANH MỤC CÁC BẢNG ii DANH MỤC CÁC HÌNH iii DANH SÁCH CÁC CH Ữ VIẾT TẮT iv PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1 PHẦN 2. TỔNG QUAN T ÀI LIỆU 3 2.1. Đặc điểm sinh học của tôm c àng xanh 3 2.1.1. Hình thái tôm càng xan h 3 2.1.2. Vòng đời 4 2.1.3. Đặc điểm sinh sản 4 2.1.4. Sự phân bố 5 2.1.5. Đặc điểm của ấu tr ùng 6 2.2. Bệnh trên ấu trùng tôm càng xanh 8 2.2.1.Các bệnh do vi khuẩn 8 2.2.1.1. Bệnh hoại tử do vi khuẩn 8 2.2.1.2. Bệnh phát sáng 8 2.2.1.3. Bệnh đốm nâu 9 2.2.1.4. Bệnh do Ricketsia. 9 2.2.2. Bệnh hoại cơ (Idiopathic Muscle Necrosis) (IMN). 9 2.2.3. Bệnh do nguyên sinh động vật 10 2.2.4. Một số bệnh chưa xác định rõ tác nhân gây bệnh 10 2.2.4.1. Bệnh giữa chu kỳ ấu tr ùng 10 2.2.4.2. Bệnh lột xác dính vỏ. 10 2.3. Bệnh đục thân trên ấu trùng tôm càng xanh 11 2.3.1. Tình hình nghiên c ứu bệnh đục thân tr ên tôm càng xanh 11 2.3.2. Dấu hiệu của bệnh đục thân 11 iii 2.3.3.Tác nhân gây b ệnh 12 2.3.4. Sự lây nhiễm 13 2.4. Các phương pháp chu ẩn đoán bệnh đục thân trên tôm càng xanh 14 2.4.1. Phương pháp lai Dot – blot 14 2.4.2. Phương pháp ELISA 15 2.4.3. Phương pháp RT – PCR 16 2.4.4. Phương pháp mô học truyền thống 17 2.4.5. Phương pháp lai t ại chỗ 18 2.4.5.1. Nguyên t ắc 18 2.4.5.2. Kỹ thuật lai tại chỗ 19 2.4.5.3. Mẫu dò 22 PHẦN 3: VẬT LIỆU V À PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 26 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 26 3.2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 26 3.2.1. Vật liệu và dụng cụ cho ứng dụng ph ương pháp lai tại chỗ và mô học truyền thống 26 3.2.3. Phương pháp nghiên c ứu 28 3.2.3.1. Phương pháp làm lame dương 28 3.2.3.2. Phương pháp t ổng hợp và đánh dấu mẫu dò 28 3.2.3.3. Phương pháp mô h ọc truyền thống v à lai tại chỗ 31 3.2.3.4. Bố trí thí nghiệm 36 PHẦN 4. KẾT QUẢ V À THẢO LUẬN . 37 4.1. Kết quả ứng dụng kỹ thuật ISH phát hiện tác nhân gây bệnh đục thân 37 4.2. Kết quả so sánh ph ương pháp ISH với phương pháp mô học truyền thống và kỹ thuật RT-PCR 47 4.2.1. So sánh về độ nhạy và độ chính xác của 3 ph ương pháp 47 4.2.2. So sánh về tính ổn định và hiệu quả của 3 phương pháp RT-PCR, Mô học truyền thống v à ISH 51 PHẦN 5. KẾT LUẬN V À ĐỂ XUẤT Ý KIẾN 53 5.1. KẾT LUẬN 53 5.2. ĐỀ XUẤT 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv DANH MỤC CÁC BẢNG V À ĐỒ THỊ BẢNG NỘI DUNG TRANG Bảng 2.1 Đặc điểm phát triển các giai đoạn của ấu tr ùng tôm càng xanh (aquacop, 1983) 6 Bảng 3.1 Thành phần hóa chất cho đánh dấu mẫu d ò 30 Đồ thị 4.1 Tỷ lệ nhiễm MrNV tr ên 10 mẫu thu có biểu hiện bệnh 48 Bảng 4.1 Bảng dấu hiệu lâm s àng của các mẫu 37 Bảng 4.2 Kết quả phân tích mô học tôm c àng xanh 39 Bảng 4.3 Kết quả một số phương pháp sinh h ọc phân tử 43 Bảng 4.4 Kết quả so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh MrNV của ba phương pháp ISH, Mô h ọc và RT-PCR trên tôm ấu trùng 47 Bảng 4.5 So sánh hiệu quả của cả 3 phương pháp RT-PCR, mô học truyền thống và ISH 51 v DANH MỤC CÁC HÌNH. HÌNH NỘI DUNG TRANG Hình 2.1. Hình Virus MrNV (Bonami và ctv, 2005) 13 Hình 2.2. Hình Virus XSV (Bonami và ctv, 2005) . 13 Hình 2.3 Sơ đồ tóm tắt kỹ thuật lai. 19 Hình 2.4 Digoxigenin – UTP/dUTP/ddUTP, alkali -stable 25 Hình 3.1 Sơ đồ xử lý mẫu 32 Hình 3.2 Sơ đồ nhuộm mẫu tự động . 33 Hình 4.1 Hình Post-larvae của tôm càng xanh với dấu hiệu: xuất hiện những đốm trắng ở phần đuôi, phần bụ ng và phần đầu 38 Hình 4.2 Hình thái mô học tổ chức cơ tôm càng xanh 40 Hình 4.3 Hình tổ chức tế bào khối gan tụy 41 Hình 4.4 Sự xuất hiện thể vùi trên cơ quan mang của ấu trùng tôm càng xanh 41 Hình 4.5 Hình mô tôm kh ỏe mạnh mẫu A8 42 Hình 4.6 Tế bào nhiễm MrNV trên các cơ quan khác nhau c ủa tôm sau khi nhuộm ISH 44 Hình 4.7 Tế bào nhiễm MrNV trên cơ quan gan t ụy sau khi nhuộm ISH 46 Hình 4.8 Tế bào nhiễm MrNV sau khi nhuộm ISH v à mô học truyền thống 49 vi DANH SÁCH CÁC CH Ữ VIẾT TẮT. TP.HCM : Thành phố Hồ Chí Minh. MrNV : Macrobrachium rosenbergii nodavirus. XSV : Extra Small Virus. ISH : In Situ Hybridization. RT-PCR : Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction. DNA : Deoxyribonucleic Acid . RNA : Ribonucleic Acid . cDNA : Complementary Deoxyribonucleic Acid . S - ELISA : Sandwich Enzyme Linked Immunosorbent Assay. IMN : Idiopathic Muscle Necrosis . MCD : Larval Mid Cycle Disease . OIE : Office International Epizootic . FAO : Food and Agriculture Organization . DIG : Digoxigenin. 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU Ngành thủy sản Việt Nam trong những năm gần đây đ ã đạt được những thành tựu đáng khích lệ, tốc độ tăng trưởng hàng năm trên 20% và đang tr ở thành một trong những ng ành kinh tế quan trọng của quốc gia. Đặc biệt phải kể đến sự đóng góp to lớn của nghề nuôi tôm. Kể từ khi xuất hiện, nghề nuôi tôm n ước ta ngày càng chứng tỏ khả năng đem lại lợi nhuận rất cao cho nền kinh tế quốc dân. Ở Việt Nam, trong 10 năm gần đây phong tr ào nuôi tôm nước lợ phát triển rất mạnh, đặc biệt là khu vực các tỉnh ven biển Đồng Bằng Sông Cửu Long nh ư Cà Mau, Bạc Liêu, Bến Tre, Đồng Tháp. Bên cạnh đó, trong những năm gần đây tôm c àng xanh cũng đang trên đã phát triển mạnh và cũng chiếm một vị trí quan trọng tr ên thị trường. Từ năm 2000 trở lại đây sản l ượng tôm càng xanh đều tăng rất mạnh v à đạt tới 10000 tấn trong năm 2002 (Bộ Thủy Sản, 2003). Tuy nhiên, ngh ề nuôi tôm càng xanh gặp phải không ít những khó khăn do dịch bệnh xảy ra. Đặc biệt l à gây thiệt hại rất lớn và là mối nguy cho nghề nuôi tôm chủ yếu là bệnh do virus gây ra như b ệnh đục thân do virus . Đây là một bệnh rất là nguy hiểm và là một trong những bệnh gây thiệt hại nghi êm trọng cho người sản xuất giống cũng nh ư người nuôi tôm thương phẩm, tỷ lệ chết có thể đạt tới 100% chỉ trong vòng 5 ngày (Vijayan và cộng sự, 2003). Hiện nay bệnh n ày vẫn chưa có biện pháp chữa trị m à chủ yếu trong quá tr ình nuôi tiến hành phòng bệnh là chính. Vì vậy, việc chẩn đoán chính xác đ ược tác nhân để có thể đ ưa ra biện pháp xử lý đúng và kịp thời là rất quan trọng và cần thiết trong nuôi trồng thủy sản. Để tăng cường kiểm soát bệnh, cho đến nay đ ã có rất nhiều phương pháp hiện đại đã và đang được phát triển và ứng dụng trong chẩn đoán bệnh thủy sản nh ư phương pháp Mô h ọc truyền thống, một số ph ương pháp dựa trên cơ chế miễn dịch đặc hiệu (ELISA, Dot -Blot), các kỹ thuật PCR (PCR, RT -PCR)…Tuy nhiên vi ệc tìm ra được phương pháp có tính đ ặc hiệu cao, tính nhạy cao v à là một công cụ hữu hiệu để chẩn đoán đ ược chính xác tác nhân gây bệnh th ì luôn là mối quan tâm của các nhà nghiên c ứu bệnh học thủy sản. V à với phương pháp lai t ại chỗ (In Situ 2 Hybridization) đó là kỹ thuật lai phân tử nhằm phát hiện tr ình tự nucleic nhất định trong lát cắt mô. Nên nó đáp ứng được yêu cầu trên và là công cụ hữu hiệu để chẩn đoán tác nhân mà phương pháp m ô học truyền thống không thể thực hiện đ ược. Vì vậy, xuất phát từ thực tiễn cần thiết, đ ược sự đồng ý của khoa Nuôi Trồng Thủy Sản, bộ môn Bệnh học Thủy Sản – trường Đại Học Nha Trang. D ưới sự hướng dẫn của Tiến Sĩ Lý Thị Thanh Loan – Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. Em được phân công thực hiện đề t ài: “ Ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ (In Situ Hybridization) phát hiện tác nhân gây bệnh đục thân trên ấu trùng tôm càng xanh ( Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879)”. Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ (ISH) để phát hiện sự hiện diện của tác nhân gây bệnh đục thân tr ên ấu trùng tôm càng xanh. Nội dung nghiên cứu: - Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ (ISH) phát hiện tác nhân gây bệnh đục thân trên ấu trùng tôm càng xanh. - So sánh kết quả thu được của phương pháp ISH v ới phương pháp mô h ọc truyền thống và kỹ thuật RT-PCR về độ ổn đinh, độ nhạy, độ chính xác v à tính hiệu quả. Nghiên cứu đề tài này thành công s ẽ là tiền đề để nghiên cứu phát triển ph ương pháp lai tại chỗứng dụng để phát hiệ n chính xác đư ợc tác nhân gây bệnh trên đối tượng thủy sản, cụ thể l à bệnh đục thân do virus tr ên ấu trùng tôm càng xanh. . thuật lai tại chỗ (In Situ Hybridization) phát hiện tác nhân gây bệnh đục thân trên ấu trùng tôm càng xanh ( Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879) . Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ (ISH). để phát hiện sự hiện diện của tác nhân gây bệnh đục thân tr ên ấu trùng tôm càng xanh. Nội dung nghiên cứu: - Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ (ISH) phát hiện tác nhân gây bệnh đục thân. SẢN PHẠM THỊ THANH NH ÀN ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI TẠI CHỖ (IN SITU HYBRIDIZATI ON) PHÁT HIỆN TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỤC THÂN TR ÊN ẤU TRÙNG TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879) ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Ngày đăng: 28/06/2014, 15:23

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan