i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Đồ án tốt nghiệp Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nha Trang, Ban Giám đốc Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, Phòng Đào tạo Đại học và sau Đại học niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại trường trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Minh Trí đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Đặc biệt xin ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ sinh học – Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường – Trường Đại học Nha Trang, Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học đã nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đồ án. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã tạo điều kiện, động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua. Chân thành cảm ơn! Sinh viên Nguyễn Thị Bảo Hiếu ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC BẢNG vi MỞ ĐẦU 1 PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ CELLULOSE 3 1.1.1. Giới thiệu về cellulose 3 1.1.2. Tìm hiểu về cây sắn và bã sắn 4 1.1.3. Tình hình tận dụng bã sắn nguyên liệu 4 1.2. TỔNG QUAN VỀ ENZYME 5 1.2.1. Lịch sử phát triển enzyme học 5 1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme 9 1.2.3. Giới thiệu về cellulase 9 1.2.3.1. Cấu trúc của enzyme cellulase 10 1.2.3.2. Tính chất của enzyme cellulase 11 1.2.3.3. Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase 11 1.2.4. Vi sinh vật sinh tổng hợp cellulose 12 1.2.5. Ứng dụng của enzyme cellulase 12 1.2.6. Tình hình nghiên cứu về enzyme cellulase 14 1.2.6.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 14 1.2.6.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 15 1.3. TỔNG QUAN VỀ BACILLUS 15 1.3.1. Đại cương về Bacillus 15 1.3.2. Một số vi khuẩn Bacillus thường gặp trong tự nhiên: 16 1.4. TỔNG QUAN VỀ VẬT LIỆU NGHIỂN CỨU 20 PHẦN II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU 23 iii 2.1.1. Đối tượng 23 2.1.2. Vật liệu 23 2.1.2.1. Thiết bị 23 2.1.2.2. Hoá chất 23 2.1.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật (g/ml) 24 2.1.3.1. Môi trường NA (dùng để phân lập, giữ giống) 24 2.1.3.2. Môi trường thử hoạt tính enzyme cellulose 24 2.1.3.3. Môi trường nuôi thu enzyme cellulase 24 2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.2.1. Phương pháp phân lập 25 2.2.2. Phương pháp giữ giống 26 2.2.3. Một số phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn 26 2.2.3.1. Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc 26 2.2.3.2. Phương pháp làm tiêu bản cố định 27 2.2.3.3. Phương pháp nhuộm Gram 27 2.2.4. Phương pháp định tính khả năng sinh enzyme cellulase 28 2.2.5. Phương pháp thu nhận dịch chiết enzyme thô 28 2.2.6. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme cellulase 28 2.2.6.1. Phương pháp đục lỗ thạch 28 2.2.6.2.Phương pháp xác định hàm lượng đường khử 28 2.2.6.3. Phương pháp tính hoạt độ hệ enzyme cellulase 29 2.2.7. Bố trí thí nghiệm 31 2.2.7.1. Thí nghiệm xác định các điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase 31 2.2.7.2. Thí nghiệm xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh enzyme cellulase tốt nhất 33 2.2.7.3. Ứng dụng enzyme cellulase của chủng Bacillus tuyển chọn vào việc thủy phân cellulose có trong bã sắn 35 PHẦN 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37 iv 3.1. XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN THEO PHƯƠNG PHÁP MILLER 37 3.2. TUYỂN LỰA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP SINH ENZYME CELLULASE TỐT NHẤT 38 3.2.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus từ thực phẩm lên men Natto 38 3.2.2. Dựa vào vòng thủy phân CMC 1% tuyển lựa chủng Bacillus sinh enzyme cellulase 38 3.2.3. Đặc điểm hình thái của 3 chủng B1, B3, B7 39 3.2.3.1. Hình thái khuẩn lạc 39 3.2.3.2. Hình thái vi khuẩn 39 3.2.4. Dựa vào hoạt tính enzyme cellulase của 3 chủng B1, B3, B7 để chọn chủng sinh enzyme mạnh nhất 41 3.2.4.1. Xác định định tính hoạt tính cellulase 41 3.2.4.2. Dựa vào định lượng Glucose bằng phương pháp đo quang Miller để xác định hoạt độ enzyme cellulase 43 3.3. ĐIỀU KIỆN ĐỂ ENZYME CELLULASE CÓ HOẠT TÍNH CAO NHẤT 47 3.3.1. Nghiên cứu nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cellulase 44 3.3.2. Nghiên cứu pH ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cellulase 44 3.4. NUÔI CẤY THU ENZYME CELLULASE 44 3.4.1. Nghiên cứu sự ảnh hưởng của pH đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase 47 3.4.2. Nghiên cứu thời gian ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase 48 3.5. BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN CELLULOSE TRÊN MÔI TRƯỜNG BÃ SẮN 50 KẾT LUẬN 53 ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC 57 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc phân tử cellulose 3 Hình 1.2: Cấu trúc không gian của enzyme cellulase 10 Hình 1.3: Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase lên cellulose 11 Hình 2.1: Sơ đồ phân lập Bacillus từ thực phẩm lên men Natto 25 Hình 2.2: Ống nghiệm giữ giống Bacillus 26 Hình 2.3: Sơ đồ xác định các điền kiện ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase 32 Hình 2.4: Sơ đồ các điều kiện nuôi cấy Bacillus thích hợp để sinh tổng hợp enzyme cellulase 34 Hình 2.5: Ứng dụng enzyme cellulase vào việc thủy phân cellulose trong bã sắn 36 Hình 3.1: Đồ thị đường chuẩn glucose theo phương pháp Miller 38 Hình 3.2: Cấy ria chủng Bacillus trên đĩa petri 38 Hình 3.3: Vòng thủy phân CMC 1% của các chủng Bacillus 38 Hình 3.4: Tiêu bản nhuộm Gram của chủng B1 40 Hình 3.5: Tiêu bản nhuộm Gram của chủng B3 40 Hình 3.6: Tiêu bản nhuộm Gram của chủng B7 41 Hình 3.7: Vòng thủy phân cellulose của 3 chủng B1, B3, B7 42 Hình 3.8: Biểu diễn hoạt độ enzyme cellulase của 3 chủng B1, B3, B7 43 Hình 3.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase 44 Hình 3.10: pH ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase 46 Hình 3.11: pH ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase. 47 Hình 3.12: Thời gian ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase 49 Hình 3.13: Ủ bã sắn với enzyme cellulase 50 Hình 3.14: Lượng Glucose sinh ra trong quá trình thủy phân cellulose của enzyme cellulase trên 1g môi trường bã sắn khô 51 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Thành phần trong bã sắn 4 Bảng 1.2: Một số vi sinh vật sản xuất cellulase 12 Bảng 2.1: Xây dựng đường chuẩn glucose 29 Bảng 2.2: Xác định hoạt độ cellulase 30 Bảng 3.1: Đường kính vòng thủy phân của các chủng Bacillus 39 Bảng 3.2: Đường kính vòng thủy phân của 3 chủng B1, B3, B7 42 Bảng 3.3: Lượng Glucose (%) sinh ra khi thủy phân cellulose trong 100g bã sắn 52 1 MỞ ĐẦU Vi sinh vật trong tự nhiên rất phong phú và đa dạng. Chúng ở xung quanh ta: trong đất, nước, không khí, thậm chí trong cơ thể con người. Chúng có thể gây ra các bệnh khôn lường như bệnh lao, dịch hạch, dịch tả, đại dịch cúm ở người và gia cầm, lở mồm, long móng ở bò lợn nhưng chúng cũng đem lại cho ta nguồn lợi vô cùng to lớn nếu ta biết hiểu chúng và biết sử dụng chúng có mục đích sẽ giúp cuộc sống của con người tốt đẹp hơn. Từ xa xưa, con người đã biết ứng dụng những hoạt tính có lợi của vi sinh vật phục vụ cho đời sống của mình như tạo ra các loại rượu quý nhờ quá trình lên men của vi sinh vật, những bài thuốc chữa bệnh từ vi sinh vật Ngày nay chúng ta đang sống trong thế kỷ 21, thế kỷ của khoa học công nghệ và đặc biệt là công nghệ vi sinh càng chứng tỏ ưu thế của mình. Hiện nay đã có nhiều chất có hoạt tính sinh học khác nhau đã được tổng hợp từ vi sinh vật đã được đưa vào sản xuất ở mức độ công nghiệp để phục vụ cho nghiên cứu, công – nông nghiệp, y học và đời sống của con người. Các chủng vi khuẩn như: Bacillus, LactoBacillus đã và đang được sử dụng trong các chế phẩm sinh học để phục vụ cho các nghành sản xuất như: rượu, bia, công nghệ dệt, y học, bổ sung vào thức ăn gia súc, thức ăn trong nuôi trồng thủy sản, phế thải hữu cơ làm sạch môi trường nuôi trồng thủy sản là nhờ khả năng sinh ezyme thủy phân amylase, protease, cellulase của chúng. Các nhà máy chế biến thực phẩm được hình thành và phát triển ngày càng nhiều. Bên cạnh đó, các chất thải được thải ra môi trường ngoài với một lượng lớn. Điển hình như nhà máy chế biến tinh bột từ củ sắn, vào vụ thu hoạch có khoảng 100 – 150 tấn bã sắn được thải ra hằng ngày. Lượng bã sắn tồn đọng là nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường. Với mong muốn tận dụng lại nguồn bã sắn để làm thức ăn chăn nuôi cho gia súc: bằng cách sử dụng enzyme cellulase phân lập từ vi sinh vật để phân giải cellulose thành các sản phẩm dễ tiêu hóa như đường kết hợp bổ sung các chất phụ gia khác như cám gạo, rỉ đường tăng thành phần dinh dưỡng. Nhờ 2 đó, ta chuyển phế liệu thành một sản phẩm có ích trong chăn nuôi sẽ giảm thiểu nạn ô nhiễm môi trường. Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: ‘‘Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sinh enzyme Cellulase” Nội dung - Tuyển lựa chủng Bacillus sinh enzyme cellulase. - Xác định một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng thủy phân của enzyme thu được. - Sơ bộ đánh giá khả năng sinh enzyme của chủng vi khuẩn Bacillus phân lập được. Đề tài được thực hiện trong thời gian ngắn là 3 tháng không tránh khỏi hạn chế và thiếu sót. Tôi rất mong nhận được các ý kiến bổ ích của những ai quan tâm đến đề tài để hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! 3 PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ CELLULOSE 1.1.1. Giới thiệu về cellulose Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật. Ngoài ra người ta thường thấy chúng có nhiều ở tế bào của một số loài vi sinh vật. Ở tế bào thực vật và một số tế bào vi sinh vật, chúng tồn tại ở dạng sợi. Cellulose không có trong tế bào động vật. Chúng là một homopolimer mạch thẳng, được cấu tạo bởi các β-Dglucose-pyranose. Các thành phần này liên kết với nhau bởi liên kết glucose, liên kết các glucose này với nhau bằng liên kết α-1,4- glucoside. Các gốc glucose trong glucose thường lệch nhau một góc 180 0 C và có dạng như một chiếc ghế bành. Cellulase thường chứa 10.000 – 14.000 gốc đường và được cấu tạo như Hình 1.1. Hình 1.1: Cấu trúc phân tử cellulose Cellulose là chất hữu cơ khó phân hủy. Người và hầu hết động vật không có khả năng phân hủy cellulose. Do đó, khi thực vật chết hoặc con người thải các sản phẩm hữu cơ có nguồn gốc thực vật đã để lại trong môi trường lượng lớn rác thải hữu cơ. Tuy nhiên nhiều chủng VSV bao gồm nấm, xạ khuẩn có khả năng phân hủy cellulose thành các sản phẩm dễ phân hủy nhờ enzyme cellulase [5]. 4 1.1.2. Tìm hiểu về cây sắn và bã sắn Cây sắn Cây sắn trồng rất nhiều ở nước ta chủ yếu để lấy củ, cây có chiều cao 1 – 3m, thân có 3 lõi đơn hoặc phân nhánh, các lá có thùy sâu, dạng chân vịt. Củ sắn có kích thước trung bình dài 25 – 38cm. Tùy theo giống, điều kiện đất đai và thời gian thu hoạch mà củ sắn có kích thước lớn hơn hoặc nhỏ hơn trị số trung bình. Cấu tạo củ sắn gồm 4 phần chính: vỏ gỗ, vỏ thịt, thịt sắn và lõi sắn. Bã sẵn Hiện nay ở nước ta có trên 60 nhà máy tinh bột sắn với tổng công suất khoảng 38 triệu tấn củ sắn tươi/năm. Theo ước tính một nhà máy chế biến tinh bột sắn có công suất 30 – 100 tấn/ngày sẽ sản xuất được 7,5 – 25 tấn tinh bột, kèm theo đó là 12 – 48 tấn bã bao gồm 2 loại:  Loại 1: Bã thải do quá trình rửa và bóc vỏ gỗ chiếm tỉ trọng ít và thành phần chủ yếu là cellulose, hemixenlulose và cát, sạn.  Loại 2: Phần bã còn lại sau khi tách tinh bột gọi là bã sắn. Bảng 1.1: Thành phần trong bã sắn Thành phần Hàm lượng (%) Protein 1,82 – 2,03 Chất béo 0,09 – 0,2 Tro 1,61 – 2,38 DNF (%DM) 31,2 Tinh bột 60,84 – 65,9 Cacbohydrat 72,19 – 79,51 Độ ẩm 80,16 – 85,5 1.1.3. Tình hình tận dụng bã sắn nguyên liệu Bã sắn nguyên liệu chứa độ ẩm cao và một số chất như tinh bột, chất béo rất dễ bị vi khuẩn phân hủy gây ra mùi hôi thối gây ô nhiễm môi trường. Từ Bảng 1.1 trong thành phần bã sắn tươi còn chứa một số chất dinh dưỡng do đó ta có thể tận dụng để biến phế liệu thành một sản phẩm khác có ích hơn phục vụ cho những mục đích nhất định. [...]... lập vi khuẩn Đem ủ trong tủ ấm hoặc để ở nhiệt độ phòng trong 24 – 48 giờ Sau khi ủ nhiều khuẩn lạc xuất hiện Làm tiêu bản một phần khuẩn lạc và soi kính để xác định hình dạng của vi khuẩn Giữ lại tất cả vi khuẩn Gram (+) có hình que, sinh bào tử Đây là Bacillus spp Natto Cấy ria Môi trường NA Ủ 24h Tủ ấm Khuẩn lạc Nhuộm Gram Vi khuẩn sinh bào tử Gram (+) Bacillus spp Hình 2.1: Sơ đồ phân lập vi khuẩn. .. tính cellulase của chủng xạ khuẩn ưu nhiệt… 1.3 TỔNG QUAN VỀ BACILLUS 1.3.1 Đại cương về Bacillus Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dương Thuộc chi Bacillaceae, có nội bào tử hình ovan có khuynh hướng phình ra ở một đầu Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh nội bào tử khác bằng hình dạng tế bào hình que, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc Tế bào Bacillus. .. ít vi khuẩn trên khuẩn lạc rời ở đĩa petri Đặt vòng cấy chứa vi khuẩn lên chính giữa lam kính và dàn đều vi khuẩn Hơ que cấy nóng đỏ trước khi làm tiêu bản mới 2.2.3.3 Phương pháp nhuộm Gram [3] Là kỹ thuật nhuộm để tách vi khuẩn ra là 2 nhóm: một nhóm là Gram (+) và một nhóm là Gram (-) Thủ tục dựa trên khả năng vi sinh vật giữ màu tím của crystal violet trong quá trình làm mất màu bằng alcohol Vi khuẩn. .. dinh dưỡng của Natto về phương diện vi sinh Vào năm 1905 TS Shin Sawamura (đại học Tokyo) đã thành công trong vi c tách 2 loại vi khuẩn Natto từ đậu nành nấu chín, trong đó vi khuẩn gây ra mùi hương đặc biệt làm hạt đậu lên men (Bacillus Natto) cũng như vi khuẩn tạo chất nhờn rất dẻo dai (Bacillus mesentericus vulgarus) tạo vị ngọt Bacillus Natto đồng nghĩa với Bacillus Subtilis trong thuật ngữ ngày... gần đây ở Vi t Nam đã có một số nghiên cứu về vi sinh vật phân hủy cellulose [4] Những nghiên cứu này chủ yếu đề cập vấn đề phân lập các chủng vi sinh vật và đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp cellulase như: tuyển chọn, nghiên cứu ảnh hưởng các yếu tố môi trường lên khả năng sinh tổng hợp cellulase và tinh sạch, đánh giá tính chất hóa lý của cellulase từ chủng Penicillium... cellobihydrolase và –glucosidase thủy phân hoàn toàn glucose 15 Trong số những nghiên cứu về khả năng sinh cellulase của vi khuẩn thì Bacillus là chủng có khả năng sản sinh cellulase ngoại bào với số lượng lớn, được quan tâm nghiên cứu nhiều hơn cả đặc biệt là: B sublitis, B polymxa, B cereus, Bacillus sp KMS-330 [14] Do cellulase có nhiều ứng dụng nên có rất nhiều nghiên cứu về nó: nghiên cứu về các tính chất hóa... như Bacillus mensentericus niger (đen), Bacillus mensentericus ruber (hồng) Bacillus mensentericus sinh trưởng và phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 36 – 450C, tối đa 50 – 550C, pH = 4,5 – 5 thì ngừng phát triển Bacillus mensentericus có hoạt tính amylase, protease lớn hơn hẳn Bacillus sublitis nhưng lên men đường thì kém hơn Bacillus cereus Đây là loại có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, Bacillus. .. bào chất của nó chưa các hạt và không bào Khuẩn lạc của Bacillus sereus phẳng, hơi lõm, trắng đục, mép lồi lõm [1] Bacillus pumilus Bào tử phát tán rộng khắp mọi nơi, thường B pumilus có mặt trong đất nhiều hơn B Subtilis Khuẩn lạc nhỏ, xung quanh vi n mở lan không ranh giới Tế bào của nó gần giống như tế bào B Sublitis Bacillus polymyxa Bacillus polymixa có khuẩn lạc vô màu, phẳng hoặc lồi, trơn, nhầy,... nghiệp dược Bacillus brevis Người ta tìm thấy và phân lập chúng từ đất và thực phẩm Khuẩn lạc có màu trắng, đôi khi có sắc vàng, lồi hoặc phẳng lấp lánh, mép răng cưa giống dạng mỡ đặc Bacillus brevis là trực khuẩn kích thước (0,7 – 1) × (3 – 5) µm Chúng thường đứng riêng rẽ Bào tử có hình bầu dục, kích cỡ (0,8 – 1) µm, nằm cuối tế bào làm cho đầu tế bào hơi phồng to lên [1] Về nhu cầu dinh dưỡng, Bacillus. .. cho đầu tế bào hơi phồng to lên [1] Về nhu cầu dinh dưỡng, Bacillus brevis yêu cầu một hỗn hợp acid amin cho sinh trưởng và phát triển, không cần bổ sung vitamin [20] Bacillus simplex Khuẩn lạc giống khuẩn lạc B cereus, phẳng, khá khuyếch tán, bề mặt hơi xù xì (dạng bột hoặc dạng nhỏ), hơi lõm, màu đục, mép lồi lõm Đặc biệt khuẩn lạc Bacillus simplex có khả năng sinh sắc tố lục nhạt, vàng và tiết vào . 3.2. TUYỂN LỰA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP SINH ENZYME CELLULASE TỐT NHẤT 38 3.2.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus từ thực phẩm lên men Natto 38 3.2.2. Dựa vào vòng thủy phân CMC 1% tuyển lựa chủng. chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: ‘ Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sinh enzyme Cellulase Nội dung - Tuyển lựa chủng Bacillus sinh enzyme cellulase. - Xác định một số điều kiện ảnh. chủng Bacillus sinh enzyme cellulase 38 3.2.3. Đặc điểm hình thái của 3 chủng B1, B3, B7 39 3.2.3.1. Hình thái khuẩn lạc 39 3.2.3.2. Hình thái vi khuẩn 39 3.2.4. Dựa vào hoạt tính enzyme cellulase