i LỜI CẢM ƠN Với tấm lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn tới:  Ban chủ nhiệm cùng các thầy cô trong khoa Nuôi trồng thủy sản – Trường Đại học Nha Trang đã giúp đỡ tôi hoàn thành chương trình học và thực hiện công tác tốt nghiệp.  TS. Phạm Quốc Hùng đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực tập.  ThS. Nguyễn Văn Đảm cùng các cô chú, anh chị trong Trại cá Gành Son– Tuy Phong– Bình Thuận đã tạo điều kiện và tận tình hướng dẫn tôi trong thời gian thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến tất cả những người thân trong gia đình, bạn bè đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian qua. Xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, ngày 20 tháng 6 năm 2012 Sinh viên Trần Thị Thúy Phương ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. HỆ THỐNG PHÂN LOẠI VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC Chlorella sp 3 1.1.1. Hệ thống phân loại 3 1.1.2. Một số đặc điểm sinh học chủ yếu của tảo lục Chlorella sp ( theo Đặng Đình Kim, 1998) 3 1.1.2.1. Phân bố 3 1.1.2.2. Đặc điểm hình thái cấu tạo của Chlorella sp 4 1.1.2.3. Sinh trưởng 4 1.1.2.4. Sinh sản 5 1.1.3. Thành phần hóa sinh của vi tảo 6 1.1.3.1. Lipid 6 1.1.3.2. Protein 7 1.1.3.3. Carbohydrat 7 1.1.3.4. Sắc tố 8 1.1.4. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự sinh trưởng của tảo 8 1.1.4.1. Ánh sáng 8 1.1.4.2. Nhiệt độ 9 1.1.4.3. Độ mặn 10 1.1.4.4. pH 10 1.1.4.5. Chế độ sục khí 10 1.1.4.6. Ảnh hưởng của một số yếu tố dinh dưỡng 11 iii 1.2. Vài nét về tình hình phân lập và lưu giữ giống tảo 13 1.2.1. Tình hình phân lập và lưu giữ giống tảo trên thế giới 13 1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam. 14 1.3. Vai trò của vi tảo trong nuôi trồng thủy sản. 15 1.3.1. Vai trò của thực vật phù du trong ao nuôi trồng thủy sản 15 1.3.2. Vai trò của vi tảo trong sản xuất giống nhân tạo các đối tượng thủy sản 16 1.3.3. Tác hại do vi tảo gây ra 20 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 22 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 22 2.1.2. Thời gian nghiên cứu 22 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu 22 2.2. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 23 2.3. Chuẩn bị dụng cụ, thiết bị, môi trường dinh dưỡng 23 2.3.1. Chuẩn bị dụng cụ 24 2.3.2. Thiết bị phục vụ 24 2.3.3. Nguồn nước 24 2.3.4. Vô trùng các dụng cụ thí nghiệm 25 2.3.5. Nguồn tảo 25 2.3.6. Môi trường dinh dưỡng trong các thí nghiệm 25 2.3.7. Bố trí thí nghiệm 26 2.3.7.1. Phân lập bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch 26 2.3.7.2. Thí nghiệm xác định điều kiện lưu giữ tảo giống thích hợp 27 2.3.8. Phương pháp nhân tảo giống 28 2.3.9. Phương pháp xác định mật độ tế bào, tốc độ sinh trưởng hằng ngày và các yếu tố môi trường nuôi. 29 2.3.9.1. Đếm tế bào 29 2.3.9.2. Công thức xác định tốc độ sinh trưởng hằng ngày 30 2.3.9.3. Kiểm tra các yếu tố môi trường 31 iv 2.3.9.4. Xử lý số liệu 31 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31 3.1. Phân lập tảo Chlorella sp trên môi trường thạch 32 3.2. Lưu giữ tảo trong các điều kiện khác nhau 34 3.2.1. Lưu giữ tảo Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ và nhiệt độ khác nhau34 3.2.1.1. Lưu giữ tảo Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ lỏngvà nhiệt độ khác nhau 34 3.2.1.2. Lưu giữ tảo Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ bán lỏngvà nhiệt độ khác nhau 35 3.2.2. Lưu giữ tảo Chlorella sp trong khoảng thời gian khác nhau 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 42 KẾT LUẬN 42 Thí nghiệm về phân lập Chlorella sp 42 Thí nghiệm lưu giữ Chlorella sp 42 ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 42 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Chlorella sp………………………………………………………………3 Hình 1.2: Đường cong sinh trưởng của quần thể vi tảo 5 Hình 2.1: Cách đếm tế bào tảo bằng buồng đếm hồng cầu 29 Hình 2.2: Cấu tạo buồng đếm hồng cầu 30 Hình 3.1: Quần lạc tảo Chlorella sp mọc trên môi trường thạch 33 Hình 3.2: Sự tăng trưởng của tảo Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ lỏng và nhi ệt độ khác nhau Hình 3.3: Sự tăng trưởng của tảo Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ bán lỏng và nhi ệt độ khác nhau Hình 3.4: Ảnh hưởng của thời gian lưu giữ tới tốc độ tăng trưởng của Chlorella sp 40 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Thành phần của vi tảo (tính theo khối lượng khô tế bào) 6 Bảng 1.2: Thành phần sinh hóa của Chlorella sp (theo Đặng Đình Kim, 1998): 6 Bảng 1.3: Môi trường tối ưu để nuôi một số loài tảo 9 Bảng 1.4: Các loại vitamin có trong vi tảo biển 17 Bảng 1.5: Các lớp và chi tảo được nuôi trồng để làm thức ăn cho động vật thủy sinh18 Bảng 1.6: Ước tính sản lượng sinh khối tảo theo khối lượng khô cho nhu cầu nuôi ấu trùng và hậu ấu trùng của NTTS thế giới năm 1999………………… 25 Bảng 2.1: Thí nghiệm lưu giữ Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ dạng lỏng với nhiệt độ khác nhau 27 Bảng 2.2: Thí nghiệm lưu giữ Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ dạng bán lỏng với nhiệt độ khác nhau 27 Bảng 2.3: Thí nghiệm xác định thời gian lưu giữ thích hợp 28 Bảng 3.1: Độ thuần chủng của Chlorella sp (%) bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch 32 Bảng 3.2: Sinh trưởng của Chlorella sp khi đưa ra nuôi sinh khối sau khi lưu giữ trong điều kiện dịch lưu giữ lỏng và nhiệt độ khác nhau 34 Bảng 3.3: Sự tăng trưởng của tảo Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ bán lỏng và nhiệt độ khác nhau 36 Bảng 3.4: Sinh trưởng của Chlorella sp được đưa ra nuôi sinh khối sau khi lưu giữ ở khoảng thời gian khác nhau 39 vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT µ: Tốc độ tăng trưởng theo ngày của tảo Chlorella sp AT: Ấu trùng CTV: Cộng tác viên HUFA: Highly Unstaturated Fatty Acid NTTS: Nuôi trồng thủy sản PUFA: Polyunsaturated Fatty Acid TB/ mL: Tế bào/mL TB: Trung bình 1 MỞ ĐẦU Vai trò của vi tảo đã được giáo sư Winberg (1965) đúc kết trong câu nói: “không có tảo sẽ không có nghề cá”. Thật vậy, vi tảo là thức ăn trực tiếp của rotifer, copepoda, những loài này là thức ăn của ấu trùng các loài tôm, cá biển. Đối với các loài cá, giáp xác thì nhu cầu về thức ăn là vi tảo chỉ giới hạn trong thời gian đầu của vòng đời nhưng đối với các loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ thì vi tảo là thức ăn trong suốt vòng đời của chúng [15]. Vi tảo có hàm lượng dinh dưỡng cao, đặc biệt là vi tảo biển với hàm lượng Protein 29-57%, lipid 7-25%, cacbonhydrat 2-32%, khoáng và các vitamin 6-39% [20]. Ngoài ra vi tảo còn chứa các acid béo không no cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của các đối tượng nuôi. Vì vậy chúng được sử dụng làm thức ăn trong sản xuất giống các đối tượng nuôi trồng thủy sản từ những năm 40. Nuôi trồng thủy sản ở nước ta những năm gần đây có những bước chuyển mình đáng kể, nhất là sự chuyển đổi đối tượng nuôi. Các đối tượng nuôi mới như nhuyễn thể hai mảnh vỏ, cá biển đang ngày càng được chú trọng. Do đó nhu cầu con giống của các đối tượng này đang rất được quan tâm. Và trong sản xuất giống thân mềm, cá biển thì nhu cầu về vi tảo là không thể thiếu [10]. Vi tảo có rất nhiều loài nhưng được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản thì hiện nay là khoảng 32 loài bao gồm tảo Lục, tảo Khuê, trong đó có vi tảo Chlorella. Các loài này phải có hàm lượng dinh dưỡng cao, kích thước phù hợp, không có độc tố, tốc độ tăng trưởng nhanh để có thể nuôi sinh khối với số lượng lớn [5]. Tuy nhiên đa số các loài tảo đang được nuôi ở nước ta hiện nay là các loài nhập nội. Điều này gây nên một số khó khăn như sự khác nhau về điều kiện khí hậu, không chủ động về nguồn giống cung cấp, các loài tảo bản địa thì không thuần khiết, nhiễm tạp và nhiễm khuẩn nhiều [16]. Bên cạnh đó các công trình nghiên cứu về vi tảo ở nước ta hiện nay chủ yếu thiên về nuôi sinh khối, các công trình nghiên cứu về phân lập, lưu giữ các giống tảo thuần còn chưa được chú trọng. 2 Với mong muốn được góp phần tạo ra các giống tảo thuần chủng có giá trị trong nuôi trồng thủy sản và xác định được một số điều kiện lưu giữ tảo thuần, được sự cho phép của Trường Đại học Nha Trang, khoa Nuôi trồng thủy sản, bộ môn Sinh học nghề cá tôi đã tiến hành đề tài: “Phân lập và lưu giữ giống tảo Lục Chlorella sp”.  Mục tiêu: - Phân lập được tảo Lục nước mặn Chlorella sp. - Xác định một số điều kiện lưu giữ thích hợp.  Nội dung nghiên cứu: - Phân lập Chlorella sp nước mặn trên môi trường thạch sử dụng môi trường dinh dưỡng F2. - Lưu giữ Chlorella sp trong các điều kiện khác nhau.  Ý nghĩa của đề tài: - Góp phần tạo ra giống tảo thuần chủng Chlorrella sp. - Lưu giữ giống tảo Chlorella sp hiệu quả hơn. 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. HỆ THỐNG PHÂN LOẠI VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC Chlorella sp 1.1.1. Hệ thống phân loại Theo Komapoenko và Vasilieva, năm 1978 [15]thì vị trí phân loại của Chlorella sp được xác định như sau: Ngành: Chlorophyta Lớp: Protococcophyceae Bộ: Chloroccocales Họ: Oocystacea Chi: Chlorella Loài: Chlorella sp Hình 1.1: Chlorella sp 1.1.2. Một số đặc điểm sinh học chủ yếu của tảo lục Chlorella sp [17] 1.1.2.1. Phân bố Tảo lục chủ yếu phân bố ở các thủy vực nước ngọt, chỉ có khoảng 10% phân bố ở các thủy vực nước lợ, mặn. Chlorella sp sinh sản bằng bào tử và không đòi hỏi điều kiện sống nên Chlorella sp phân bố rộng khắp mọi thủy vực nước ngọt. Theo [...]... nuôi lớn thì thời gian đạt cực đại sẽ nhanh và thời gian tàn lụi cũng rất nhanh 1.2 Vài nét về tình hình phân lập và lưu giữ giống tảo 1.2.1 Tình hình phân lập và lưu giữ giống tảo trên thế giới Theo Hans R và Robert A (2005), môi trường và phương pháp nuôi cấy tảo được ngiên cứu từ những năm 1800-1900 Vào thế kỉ 19-20 có khá nhiều công trình nghiên cứu vi tảo được công bố trên thế giới, song các công... trùng điệp quạt Năm 1995, Hoàng Thị Bích Mai đã thiết lập môi trường dinh dưỡng THO4 dùng để phân lập, lưu giữ và nuôi sinh khối một số tảo lục đơn bào như Chlorella sp, Scensemus sp, Chlamydomonas sp Riêng Chlorella sp vài năm gần đây đã có nhiều công trình nghiên cứu có đề cập đến việc phân lập và lưu giữ giống tảo như của Trần Thị Thanh Nga (2005), Vũ Thị Thùy Minh (2006) Đặc biệt là công trình nghiên... lưu giữ tảo giống thích hợp Bảng 2.1: Thí nghiệm lưu giữ Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ dạng lỏng với nhiệt độ khác nhau Lô thí nghiệm Điều kiện lưu giữ Lô 1 Nhiệt độ (ºC) 5-6 Thí nghiệm được lặp lại 3 lần Lô 2 Lô 3 15 24 Điều kiện lưu giữ: - Mật độ lưu giữ: 2.0 x 106 (tb/mL) - Thời gian: 2 tuần - Độ mặn: 25‰ - Môi trường dinh dưỡng: F2 - Dịch lưu giữ: bán lỏng Bảng 2.2: Thí nghiệm lưu giữ. .. nuôi cấy vi tảo mà chưa đề cập đến phương pháp phân lập và lưu giữ giống tảo như thế nào, đặc biệt là các loài tảo sống ở đáy Mặc dù vậy, có thể đề cập đến một số công trình nghiên cứu sau: Người đầu tiên tiến hành phân lập tảo thành công phải kể đến Beijerinck (1890) với công trình phân lập tảo Chlorella, Scenedesmus và một số loài tảo vùng Trebauxia Ngoài ra Beijerinck còn nuôi thuần chủng tảo lam Anabana... Năm 1890 Miquel đã pha loãng tảo tạp trong các môi trường khác nhau để phân lập tảo silic 14 Ferdinnard Cohn tuy không thành công trong việc phân lập tảo lục đơn bào Hamatococcus nhưng cũng đã lưu giữ thành công loài tảo này Năm 1894, Krijger đã phân lập thành công quần lạc tảo lục gồm Prototheca, Chlorella trên bề mặt thạch Zumstein (1900) cũng đã phân lập được loài tảo mắt Euglena gracillis bằng... nghiên cứu Tảo lục nước mặn Chlorella sp 2.1.2 Thời gian nghiên cứu Từ 16/2/2012 – 16/4/2012 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu Trại sản xuất giống cá biển Gành Son- Tuy Phong- Bình Thuận 2.2 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 23 Tảo giống Nhân sinh khối Phân lập bằng phương pháp trên môi trường đặc (thạch) Điều kiện lưu giữ khác nhau Tảo giống thuần chủng Lưu giữ trong điều kiện dịch nuôi dạng lỏng Lưu giữ trong... chiều dọc thì tảo lục phân bố từ vùng núi cao đến vùng biển sâu Theo chiều ngang thì nó phân bố từ vùng xích đạo đến vùng ôn đới và hàn đới Tảo lục phát triển mạnh ở những nơi có ánh sáng mạnh Chlorella sp phân bố ở khắp nơi trên thế giới, ở những thủy vực giàu dinh dưỡng Pauw và ctv (1983 trích theo Vũ Thị Thùy Minh, 2005) cho rằng tảo lục Chlorella sp là loài rộng nhiệt Ở Việt Nam Chlorella sp sống tốt... giữ Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ dạng bán lỏng với nhiệt độ khác nhau Điều kiện lưu giữ Nhiệt độ (ºC) Lô thí nghiệm Lô 4 Lô 5 Lô 6 5-6 15 24 28 Thí nghiệm được lặp lại 3 lần Điều kiện lưu giữ: - Mật độ lưu giữ: 2.0 x 106 (tb/mL) - Thời gian: 2 tuần - Độ mặn: 25‰ - Môi trường dinh dưỡng: F2 - Dịch lưu giữ: lỏng Bảng 2.3: Thí nghiệm xác định thời gian lưu giữ thích hợp Điều kiện lưu giữ. .. nuôi sinh khối, về phân lập và lưu giữ còn ít Đầu những năm Chlorella sp được nhập nội nghiên cứu và bắt đầu được ứng dụng Cố GS Nguyễn Hữu Thước cùng các cộng 15 sự đã tiến hành nhiều thí nghiệm nuôi tảo và sử dụng sinh khối Chlorella sp bổ sung vào thức ăn cho một số loài gia cầm và kính thích sinh trưởng của con tằm Năm 1974, khoa Nuôi trồng thủy sản– Đại học Nha Trang đã nghiên cứu và nuôi sinh khối... hợp cho sự phát triển của chúng và nuôi ở các thể tích khác nhau (1-5L) Tại Trung Quốc, nghiên cứu tảo nuôi được bắt đầu từ năm 1940 Guo và ctv đã phân lập và nuôi 2 loài tảo đơn bào Tetraselmis sp và Dunaliella sp [16] Năm 2007, trường đại học Murdoch (Úc) đã sử dụng 4 phương pháp phân lập tảo (phương pháp pha loãng, nuôi cấy trên môi trường thạch, dùng micropipet và phương pháp làm giàu) Hiện nay, . Phân lập và lưu giữ giống tảo Lục Chlorella sp .  Mục tiêu: - Phân lập được tảo Lục nước mặn Chlorella sp. - Xác định một số điều kiện lưu giữ thích hợp.  Nội dung nghiên cứu: - Phân lập. 1.2. Vài nét về tình hình phân lập và lưu giữ giống tảo 1.2.1. Tình hình phân lập và lưu giữ giống tảo trên thế giới Theo Hans R. và Robert A. (2005), môi trường và phương pháp nuôi cấy tảo. CỨU VÀ THẢO LUẬN 31 3.1. Phân lập tảo Chlorella sp trên môi trường thạch 32 3.2. Lưu giữ tảo trong các điều kiện khác nhau 34 3.2.1. Lưu giữ tảo Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ và