i MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT vi TÓM TẮT vii MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1.Một số đặc điểm sinh học cá Chép 3 1.1.1. Hệ thống phân loại 3 1.1.2. Phân bố 3 1.1.3. Đặc điểm hình thái 3 1.1.4. Đặc điểm sinh thái 4 1.1.5. Đặc điểm sinh trưởng, phát triển và sinh sản 4 1.2. Đại cƣơng về tinh trùng 4 1.2.1. Quá trình tạo tinh trùng 4 1.2.1.1. Giai đoạn tăng sinh 4 1.2.1.2. Giai đoạn sinh trưởng 5 1.2.1.3. Giai đoạn thành thục 5 1.2.2. Cấu tạo tinh trùng 5 1.2.2.1. Phần đầu 6 1.2.2.2. Phần cổ 6 1.2.2.3. Phần đuôi 6 1.2.3. Đặc điểm sinh học của tinh trùng 6 1.2.3.1. Kích thước và số lượng 6 1.2.3.2. Đặc điểm vận động 7 1.3. Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trùng 13 ii 1.3.1. Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trùng trên thế giới 13 1.3.2. Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trùng ở Việt Nam 16 Chƣơng 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1. Địa điểm, thời gian và đối tƣợng nghiên cứu 18 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 18 2.2.1. Cá đực và vuốt tinh 19 2.2.1.1. Cá đực 19 2.2.1.2. Vuốt tinh 19 2.2.2. Đánh giá sơ bộ chất lượng tinh dịch cá 19 2.2.2.1. Màu sắc tinh dịch 19 2.2.2.2. Thể tích tinh dịch 19 2.2.2.3. Kiểm tra hoạt lực tinh trùng 20 2.2.2.4. Kiểm tra mật độ tinh trùng 21 2.2.3. Bảo quản tinh trùng cá chép trong nitơ lỏng 22 2.2.4. Ảnh hưởng của chất bảo quản và chất chống đông lên kết quả bảo quản tinh 22 2.2.5. Ảnh hưởng của quy trình làm lạnh lên kết quả bảo quản tinh 24 2.2.6. Ảnh hưởng của thời gian bảo quản lên kết quả bảo quản tinh 25 2.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu 25 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 26 3.1. Ảnh hƣởng của chất bảo quản lên kết quả bảo quản tinh 26 3.2. Ảnh hƣởng của chất chống đông lên kết quả bảo quản tinh 27 3.3. Ảnh hƣởng của quy trình làm lạnh đến kết quả bảo quản tinh 29 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian bảo quản lên kết quả bảo quản tinh 30 Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 32 4.1. Kết luận 32 4.1.1. Ảnh hưởng của chất bảo quản lên kết quả bảo quản tinh 32 4.1.2. Ảnh hưởng của chất chống đông lên bảo quản tinh 32 4.1.3. Ảnh hưởng của quy trình làm lạnh lên kết quả bảo quản tinh 32 4.1.4. Ảnh hưởng của thời gian bảo quản lên chất lượng tinh bảo quản 32 iii 4.2. Đề xuất ý kiến 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 iv DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1. Chiều dài, khối lƣợng, thể tích tinh dịch, màu sắc tinh dịch của cá chép đƣa vào thí nghiệm……………………………………………… 20 Bảng 2.2. Hoạt lực ban đầu của tinh trùng……………………………….… 21 Bảng 2.3. Mật độ trung bình tinh trùng qua 3 đợt thí nghiệm (*10 9 tb/ml) 22 Bảng 2.4. Thành phần các ion trong dịch tƣơng của một số loài cá [56] …. 23 Bảng 2.5. Thành phần các chất bảo quản đƣợc sử dụng cho nghiên cứu… 24 v DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1. Hình dạng ngoài cá chép [57]…… ……………………….…… 3 Hình 1.2. Cấu tạo tinh trùng [44]…………………………………………… 5 Hình 2.1. Quy trình nội dung nghiên cứu ………………………………… 18 Hình 2.2. Các quy trình làm lạnh sử dụng cho thí nghiệm.… …………… 25 Hình 3.1. Ảnh hƣởng của chất bảo quản lên kết quả bảo quản tinh………… 26 Hình 3.2. Ảnh hƣởng của các chất chống đông lên kết quả bảo quản tinh…. 27 Hình 3.3. Ảnh hƣởng của các quy trình làm lạnh lên kết quả bảo quản tinh 29 Hình 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian bảo quản lên kết quả bảo quản tinh…… 30 vi DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT CCSE: Common carp sperm chất bảo quản. DMSO: Dimethyl sunfoxide. MET: Methanol. GLY: Glycerol. Đv: Đơn vị. GTTB: Giá trị trung bình. HL: Hoạt lực. TGHL: Thời gian hoạt lực. s: Giây. V: Thể tích. SD: Độ lệch chuẩn. tb: Tế bào. TGHL: Thời gian hoạt lực. tt: Tinh trùng. ctv: Cộng tác viên. TTTD: Thể tích tinh dịch. MSTD: Màu sắc tinh dịch. TT: Thứ tự. vii TÓM TẮT Bảo quản tinh trùng cá trong nitơ lỏng là phương pháp đã và đang được nghiên cứu rộng rãi ở nhiều quốc gia bởi vì lợi ích của chúng trong công tác chọn giống và bảo tồn nguồn gen. Mục đích của nghiên cứu này là tìm ra chất bảo quản, chất chống đông, quy trình làm lạnh thích hợp nhất cho việc bảo quản tinh trùng cá Chép Cyprinus carpio trong nitơ lỏng. Về thí nghiệm tìm ra chất bảo quản tốt nhất: tinh trùng được pha loãng trong các chất bảo quản (common carp sperm extender) CCSE-1, CCSE-2, CCSE-3 hoặc CCSE-4 và bổ sung 10% DMSO như là chất chống đông ở tỉ lệ 1:3 (tinh trùng:dung dịch pha loãng). Về thí nghiệm tìm ra chất chống đông tốt nhất: tinh trùng được pha loãng với chất bảo quản là CCSE-2 và bổ sung các chất chống đông như là DMSO (dimethyl sulfoxide), Glycerol, và Methanol ở nồng độ là 10% với tỷ lệ 1:3 (tinh trùng:dung dịch pha loãng). Thí nghiệm về chất bảo quản và chất chống đông được bảo quản theo qui trình: hơi nitơ lỏng -76 o C khoảng 6 phút và sau đó cho thẳng xuống nitơ lỏng -196 o C. Thí nghiệm về quy trình làm lạnh: tinh trùng được pha loãng với chất bảo quản là CCSE-2 và bổ sung DMSO ở nồng độ 10% như là chất chống đông, sau đó tiến hành bảo quản theo ba quy trình: (1) đưa các cọng rạ xuống nhiệt độ -20◦C trong 3 phút rồi chuyển xuống -76◦C trong 3 phút rồi đưa vào bảo quản trong nitơ lỏng -196◦C; (2) đưa các cọng rạ xuống nhiệt độ -76◦C trong 6 phút rồi đưa vào bảo quản trong nitơ lỏng -196◦C; (3) đưa thẳng các cọng rạ vào bảo quản trong nitơ lỏng -196◦C. Kết quả thí nghiệm cho thấy chất bảo quản CCSE-2, chất chống đông là DMSO ở nồng độ 10%, và quy trình làm lạnh (2) cho kết quả tốt nhất. Kết quả thí nghiệm này góp phần cung cấp thông tin về bảo quản lạnh tinh trùng cá chép trong nitơ lỏng. Từ khóa: Cá chép, Cyprinus carpio, chất bảo quản, chất chống đông 1 MỞ ĐẦU Bảo quản tinh có vai trò quan trọng trong các chƣơng trình chọn giống và các chƣơng trình bảo tồn nguồn gen của vật nuôi. Bảo quản tinh sẽ góp phần cung cấp nguồn nguyên liệu cho công nghệ di truyền phân tử áp dụng trong các chƣơng trình chọn giống. Nhờ bảo quản tinh có thể chủ động trong quá trình sản xuất giống nhân tạo, nhất là trong trƣờng hợp có hiện tƣợng lệch pha trong sự thành thục giữa giới đực và cái. Việc bảo quản tinh góp phần làm đơn giản hóa quá trình vận chuyển cá bố từ nơi này đến nơi khác. Ngoài ra, bảo quản tinh còn hạn chế tối đa việc lƣu giữ cá đực bảo tồn dòng thuần ngăn cản suy giảm chất lƣợng di truyền do lai cận huyết [6]. Hiện nay, bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng là phƣơng pháp đơn giản nhất của việc lƣu trữ tinh trùng cá trong thời gian dài. Từ các dữ liệu của Ashwood-Smith [13], Whittingham [52] và Stoss and Holtz [46] đã ƣớc tính thời gian lƣu trữ tinh trùng trong nitơ lỏng là từ 200 đến 32.000 năm. Thành công của việc bảo quản lạnh tinh trùng từ các loài cá biển đến các loài cá nƣớc ngọt, Cloud và Patton [21] chứng minh rằng bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng là một phƣơng pháp có thể đƣợc sử dụng để bảo quản tinh trùng của nhiều loài cá. Cá Chép (Cyprinus carpio) là một trong những loài có giá trị kinh tế quan trọng đƣợc nuôi ở khắp châu Á và châu Âu. Sản lƣợng cá đƣợc nuôi toàn cầu chiếm khoảng 6,14% (3.172.488 tấn) tổng sản lƣợng nuôi trồng thủy sản trên toàn thế giới [22]. Ở Việt Nam, cá Chép là đối tƣợng nuôi có giá trị thƣơng phẩm, thịt thơm ngon và đƣợc nuôi khá phổ biến [8]. Cho đến nay, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu bảo quản tinh cá Chép Cyprinus carpio đƣợc công bố rộng rãi với nhiều phƣơng pháp bảo quản khác nhau. Tuy nhiên, hiện nay do quá trình di nhập cá Chép giữa các vùng trên cả nƣớc và di nhập cá Chép từ nƣớc ngoài dẫn tới quá trình lai tạp xảy ra nhiều làm cho biến đổi nguồn gen, nên việc lƣu trữ và bảo tồn giống thuần phục vụ công tác lai tạo, chọn giống là yêu cầu đặt ra của ngành thủy sản. Bên cạnh đó, do đặc điểm sinh lý, hóa của mỗi loài cá khác nhau nên việc tìm ra quy trình bảo quản tinh thích hợp cho từng loài cá trong điều kiện cụ thể là rất cần thiết [39]. 2 Và để góp phần cung cấp thêm thông tin về kỹ thuật bảo quản tinh cho các đối tƣợng thủy sản, đề tài: “Nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá Chép Cyprinus carpio trong nitơ lỏng” đƣợc thực hiện. Đề tài thực hiện gồm những nội dung chính sau đây: - Ảnh hƣởng của chất bảo quản lên bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng. - Ảnh hƣởng của chất chống đông lên bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng. - Ảnh hƣởng của quy trình bảo quản lên bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng. - Ảnh hƣởng của thời gian bảo quản trong nitơ lỏng lên hoạt lực tinh trùng. Mục tiêu chính của đề tài là: - Tìm ra một số dung dịch bảo quản và chất chống đông phù hợp với việc bảo quản tinh trùng cá Chép (Cyprinus carpio) trong nitơ lỏng tại Việt Nam. - Góp phần bổ sung dữ liệu về quy trình kỹ thuật bảo quản tinh trùng cá chép Cyprinus carpio trong nitơ lỏng tại Việt Nam. - Lƣu trữ nguồn gen và bảo tồn giống thuần phục vụ cho công tác lai tạo. Do thời gian có hạn và kiến thức còn hạn chế, nên trong quá trình viết báo cáo không thể tránh thiếu sót. Kính mong nhận đƣợc góp ý từ thầy, cô và các bạn để đồ án đƣợc hoàn thiện hơn. Xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, ngày 20 tháng 6 năm 2012 Sinh viên thực hiện Võ Thị Thu Hiền 3 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Một số đặc điểm sinh học cá Chép 1.1.1. Hệ thống phân loại Ngành: Chordata Lớp: Actinopterygii Bộ: Cypriniformes Họ: Cyprinidae Giống: Cyprinus Loài: C. carpio Tên tiếng anh: Common carp. Hình 1.1 Hình dạng ngoài của cá chép [57]. 1.1.2. Phân bố Trên thế giới: Cá chép (Cyprinus carpio) phân bố rộng khắp các vùng trên toàn thế giới trừ Nam Mỹ, Tây Bắc Mỹ, Madagasca và châu Úc [8]. Ở Việt Nam: Cá phân bố rộng trong sông ngòi, ao hồ, ruộng ở hầu hết các tỉnh phía Bắc Việt Nam. Cá có nhiều dạng hình nhƣ: Cá chép trắng, chép cẩm, chép hồng, chép đỏ, chép lƣng gù, chép thân cao, chép Bắc Cạn v.v [8]. 1.1.3. Đặc điểm hình thái Thân cá hình thoi, mình dây, dẹp bên. Viền lƣng cong, thuôn hơn viền bụng. Đầu cá thuôn, cân đối. Mõm tù, lƣng xanh đen, hai bên thân phía dƣới đƣờng bên vàng xám, bụng trắng bạc. Gốc vây lƣng và vây đuôi hơi đen. Vây đuôi và vây hậu môn đỏ da cam [8]. [...]... lại, thông qua bảng 2.1, 2.2, 2.3 thì chất lƣợng tinh đƣợc đƣa vào sử dụng rất phù hợp cho nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá chép trong nitơ lỏng 2.2.3 Bảo quản tinh trùng cá chép trong nitơ lỏng Tinh trùng đƣợc bảo quản trong chất bảo quản có bổ sung thêm chất chống đông ở tỉ lệ 1:3 (tinh dịch:dung dịch pha loãng) Tinh trùng pha loãng đƣợc hút vào các cọng ra có thể tích 0,25ml Dùng panh hơ nóng trên... của tinh trùng, ngày nay ngƣời ta nghiên cứu ứng dụng rộng rãi biện pháp bảo quản tinh trùng ở dạng nguyên tinh dịch trong các dụng cụ khô ráo ở nhiệt độ thấp và kín đã có thể kéo dài tuổi thọ của tinh trùng một cách hiệu quả Đặc biệt là phƣơng pháp bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng đang đƣợc nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trên thế giới 1.3 Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trùng 1.3.1 Tình hình nghiên. .. chất bảo quản thích hợp là chìa khóa trong sự thành công của bảo quản tinh trùng cá dài hạn trong nitơ lỏng Thí nghiệm này đã sử dụng 4 chất CCSE-1, CCSE-2, CCSE-3 và CCSE-4 làm chất bảo quản cho tinh trùng cá chép trong nitơ lỏng CCSE-2 cho kết quả bảo quản tốt nhất Năm 2010, Irawan và ctv [30] đã sử dụng 6 chất bảo quản CCSE-1, CCSE-2, CCSE-3, CCSE-4, CCSE-5, CCSE-6 làm chất bảo quản tinh trùng cá chép, ... của tinh trùng: tinh trùng cá Hồi vận động tốt nhất khi pH=8,3 [11] - Tuổi thọ của tinh trùng còn phụ thuộc vào chất lƣợng thành thục của cá - Ảnh hƣởng của việc bảo quản lạnh tinh trùng: Quá trình bảo quản lạnh tinh trùng cũng góp phần vào làm giảm chất lƣợng tinh trùng sau khi bảo quản Một số nghiên cứu này cũng đã đƣợc nhiều tác giả công bố [19, 47] Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả bảo quản tinh trùng. .. năng thụ tinh trong thời gian 1 đến 2 tuần [11] Các nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá mới đƣợc thực hiện từ những năm 2000, nhƣng phần lớn chỉ bảo quản trong thời gian ngắn, khoảng một vài ngày Năm 2002, tác giả Hồ Kim Diệp và ctv [2] đã công bố kết quả nghiên cứu bảo quản tinh một số loài cá nƣớc ngọt nhƣ cá Chép, Trắm cỏ, Mrigan, cá Bỗng Kết quả nhƣ sau: tỉ lệ thụ tinh của tinh trùng cá Chép đạt... lí trong chƣơng trình SPSS 16.0, sử dụng phân tích ANOVA 1 nhân tố với độ tin cậy 95% Các kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày dƣới dạng GTTB±SD 26 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hƣởng của chất bảo quản lên kết quả bảo quản tinh Việc lựa chọn các chất bảo quản có ý nghĩa quan trọng trong kỹ thuật bảo quản tinh Ảnh hƣởng của chất bảo quản lên bảo quản tinh trùng cá chép trong nitơ lỏng. .. dụng Glycerol cho bảo quản tinh cá Chép là không thích hợp vì phần trăm hoạt lực và thời gian hoạt lực của tinh trùng khi sử dụng Glycerol làm chất chống đông thấp [10] Vì tinh trùng là những tế bào rất nhạy cảm và dễ bị ảnh hƣởng bởi dung dịch pha loãng nhƣ là chất bảo quản và chất chống đông nên các nghiên cứu về chất bảo quản và chất chống đông trong nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá trong thời gian... tính tinh dịch của cá chép Dựa vào đặc 23 tính này mà thí nghiệm đã đƣa ra một số chất bảo quản khác nhau lần lƣợt là: Comon carp sperm extender (CCSE): CCSE-1, CCSE-2, CCSE-3 và CCSE-4 Thành phần của các chất bảo quản đƣợc nêu ở bảng 2.5 Để thực hiện thí nghiệm tìm ra chất bảo quản tốt nhất cho bảo quản tinh trùng cá chép trong nitơ lỏng thì tinh trùng đƣợc pha loãng trong các chất bảo quản nêu ở trên... công trong việc nghiên cứu bảo quản tinh Năm 1953, ông đã nghiên cứu bảo quản thành công tinh trùng cá Trích (Lupea herenffus), thời gian bảo quản là sáu tháng ở nhiệt độ -70oC trong dung dịch nƣớc biển, nồng độ 0,34% và chất chống đông Glycerol 12,5%, tỷ lệ pha loãng tinh dịch với nƣớc biển là 1:4 Kết quả thu đƣợc là 80-85,0% trứng thụ tinh với tinh trùng đƣợc bảo quản sau khi rã đông và cho thụ tinh. .. quản tinh trùng các loài cá Hồi nƣớc ngọt theo phƣơng pháp của Nagase Sau 7 ngày bảo quản, tinh đƣợc rã đông nhanh trong 10 ml dung dịch NaHCO3 1% Hơn 70,0% tinh trùng hoạt động sau khi rã đông, thời gian hoạt động của tinh trùng 30 giây Trong khi đó, Cabrita và ctv [17] đã tiến hành nghiên 16 cứu bảo quản tinh trùng cá Hồi vân trong cọng rạ có thể tích lớn 0,5 ml, 1,8 ml và 5 ml Tỉ lệ pha loãng tinh . chất bảo quản lên bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng. - Ảnh hƣởng của chất chống đông lên bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng. - Ảnh hƣởng của quy trình bảo quản lên bảo quản tinh trùng trong. thông tin về bảo quản lạnh tinh trùng cá chép trong nitơ lỏng. Từ khóa: Cá chép, Cyprinus carpio, chất bảo quản, chất chống đông 1 MỞ ĐẦU Bảo quản tinh có vai trò quan trọng trong các chƣơng. việc bảo quản tinh trùng cá Chép (Cyprinus carpio) trong nitơ lỏng tại Việt Nam. - Góp phần bổ sung dữ liệu về quy trình kỹ thuật bảo quản tinh trùng cá chép Cyprinus carpio trong nitơ lỏng tại