ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN QUỐC CƯỜNG TỐI ƯU HOÁ PHẢN ỨNG DANSYL-AMINO ACID DÙNG ĐỂ PHÂN TÍCH AMINO ACID CỦA TRÙN QUẾ (Perionyx excavatus) BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2010 ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN QUỐC CƯỜNG TỐI ƯU HOÁ PHẢN ỨNG DANSYL-AMINO ACID DÙNG ĐỂ PHÂN TÍCH AMINO ACID CỦA TRÙN QUẾ (Perionyx excavatus) BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỮU CƠ MÃ SỐ: 604427 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS. TRẦN KIM QUI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2010 LỜI CẢM ƠN XW Để hoàn thành chương trình cao học và luận văn này, em đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ và góp ý nhiệt tình của quý thầy cô khoa Hóa trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên. Trước hết, em xin chân thành cảm ơn đến quý thầy cô khoa Hóa trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TpHCM, đặc biệt là những thầy cô đã tận tình dạy bảo cho em trong suốt thời gian học tập tại trường. Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến GS.TS. Trần Kim Qui đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và giúp em hoàn thành luận văn này. Nhân đây, em cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị nghiên cứu sinh đã động viên và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình hoàn thành luận văn. Cuối cùng con xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình đã cho con có được thành quả như ngày hôm nay. Tp.HCM – Ngày 22 tháng 05 năm 2010 -1- MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG 4 DANH MỤC CÁC HÌNH 5 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 6 MỞ ĐẦU 7 Chương 1 .TỔNG QUAN 8 1.1.GIỚI THIỆU TRÙN QUẾ 8 1.1.1 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, CẤU TẠO VÀ SINH LÝ CỦA TRÙN QUẾ 9 1.1.1.1.Hình thái bên ngoài 9 1.1.1.2.Cấu tạo cơ thể trùn 9 1.1.1.3.Đặc tính sinh lý trùn Quế 11 1.1.2.SỰ SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN VÀ SINH SẢN 12 1.1.2.1.Sự sinh trưởng, phát triển của trùn Quế 12 1.1.2.2.Sự sinh sản 13 1.1.2.3.Tập tính ăn 14 1.1.3 KỸ THUẬT NUÔI TRÙN QUẾ 14 1.1.3.1 Chuẩn bị môi trường nuôi 14 a/Chất nền và cách ủ chất nền 15 b/ Phương pháp cho trùn Quế ăn 17 c/ Các yếu tố môi trường sống 18 1.1.3.2 Bệnh của trùn 19 1.1.4.ỨNG DỤNG CỦA TRÙN QUẾ TRONG THỰC PHẨM VÀ TRỊ LIỆU 19 1.2.VAI TRÒ CỦA CÁC AMINO ACID CÓ TRONG TRÙN QUẾ 20 1.3.PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN AMINO ACID CÓ TRONG TRÙN QUẾ24 1.3.1.PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ BẢN MỎNG 24 1.3.2.PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ 26 1.3.3.PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 26 LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -2- 1.4 PHẢN ỨNG DANSYL HÓA AMINO ACID 28 Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29 2.1.THIẾT BỊ, HÓA CHẤT VÀ VẬT LIỆU 29 2.1.1.THIẾT BỊ 29 2.1.2.HÓA CHẤT 29 2.1.3.VẬT LIỆU 30 2.2 PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 30 2.2.1.Cách tiến hành phản ứng Dansyl hóa tạo dẫn xuất Dansyl của amino acid 30 2.2.2.Khảo sát điều kiện tối ưu để tiến hành phản ứng tạo dẫn xuất Dansyl 30 2.2.3.Khảo sát pH của phản ứng Dansyl hóa 30 2.2.4.Khảo sát nồng độ thuốc thử Dansyl clorur 30 2.2.5.Khảo sát theo thời gian của phản ứng Dansyl hóa 31 2.2.6.Khảo sát sự thay đổi tỉ lệ đệm Na 2 B 4 O 7 và dung môi Aceton 31 2.2.7.Qui trình thủy phân trùn Quế bằng acid và phản ứng Dansyl hóa 31 2.2.8.Qui trình thủy phân trùn Quế bằng baz và phản ứng Dansyl hóa 31 Chương 3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3 2 3.1.NGHIÊN CỨU PHẢN ỨNG TẠO DẪN XUẤT DANSYL CỦA AMINO ACID CHUẨN 3 2 3.1.1.Cách tiến hành phản ứng Dansyl hóa 32 3.1.2.Khảo sát điều kiện tối ưu để tiến hành phản ứng tạo dẫn xuất Dansyl hóa 3 2 Khảo sát pH của phản ứng Dansyl hóa 33 3.1.3. 3.1.4. Khảo sát nồng độ thuốc thử Dansyl clorur 36 3.1.5.Khảo sát thời gian tiến hành phản ứng 38 3.1.6.Khảo sát sự thay đổi t ỉ lệ dung môi Aceton và đệm Borat 39 3.2.KHẢO SÁT KHOẢNG TUYẾN TÍNH VÀ ĐƯỜNG CHUẨN CỦA 20 DẪN XUẤT DANSYL-AMINO ACID CHUẨN 4 4 LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -3- 3.3.QUI TRÌNH PHÂN TÍCH AMINO ACID CỦA TRÙN QUẾ 47 3.3.1.Qui trình thủy phân trùn Quế bằng acid và phản ứng Dansyl hóa 47 3.3.2.Qui trình thủy phân trùn Quế bằng baz và phản ứng Dansyl hóa 4 7 3.3.3 Qui trình phân tích amino acid trên thiết bị HPLC-UV 47 3.4 KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT 5 1 Chương 4 KẾT LUẬN 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 5 5 PHỤ LỤC 5 7 LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -4- DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Tỉ lệ sinh sản của trùn Quế trên chất hữu cơ động vật và thực vật 13 Bảng 1.2. Thời gian kén nở, thời gian trùn trưởng thành và tổng thời gian từ giai đoạn trứng đến giai đoạn trưởng thành của trùn Quế 13 Bảng 1.3. Tương quan giữa giá trị R f và hệ dung môi 25 3 Bảng 3.1. Chương trình gradient pha động A và B 3 Bảng 3.2. Diện tích peak của 11 dẫn xuất Dansyl ở các pH khác nhau 3 4 Bảng 3.3. Diện tích peak của 11 dẫn xuất Dansyl ở các nồng độ thuốc thử khảo sát 3 6 Bảng 3.4. Diện tích peak của 11dẫn xuất Dansyl ở các thời gian khác nhau 38 Bảng 3.5. Diện tích peak của 11dẫn xuất Dansyl ở các tỷ lệ dung môi Aceton và đệm Na 2 B 4 O 7 khác nhau 40 Bảng 3.6. Định danh 20 Dns-amino acid cho sắc ký đồ ở hình 3.5 4 3 Bảng 3.7. Kết quả dựng đường chuẩn của 20 dẫn xuất Dns-amino acid 45 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của 20 Dns-amino acid 4 6 49 Bảng 3.9. Định danh Dns-amino acid cho sắc ký đồ ở hình 3.6 Bảng 3.10. Định danh Dansyl-amino acid cho sắc ký đồ ở hình 3.7 5 0 LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -5- DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2. 1. Sắc ký đồ phân tách dẫn xuất pentafluorobenzyl-AA tiêu biểu 26 Hình 3.1. Diện tích các mũi dẫn xuất Dansyl theo pH tiến hành phản ứng Dansyl hóa 3 5 Hình 3.2. Diện tích các mũi dẫn xuất Dansyl theo nồng độ thuốc thử phản ứng Dansyl hóa 3 7 Hình 3.3. Diện tích các mũi dẫn xuất Dansyl theo thời gian phản ứng 39 Hình 3.4 Biểu diễn sự thay đổi diện tích của 11 mũi dẫn xuất theo tỉ lệ dung môi và đệm thực hiện phản ứng 4 1 2 Hình 3.5. Sắc ký đồ đo độ hấp thu của 20 Dns-amino acid chuẩn 4 Hình 3.6. Sắc ký đồ đo độ hấp thu các Dns-amino acid của trùn Quế thuỷ phân bằng acid 4 8 Hình 3.7. Sắc ký đồ đo độ hấp thu các Dns-amino acid của trùn Quế thuỷ phân bằng baz 5 0 LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -7- MỞ ĐẦU Trùn Quế (Perionyx excavatus) là loại thực phẩm có hàm lượng Protein cao, giàu nguyên tố khóang vi lượng, ít chất béo. Trong trùn Quế có nhiều loại amino acid cần thiết cho con người và có hàm lượng vitamin B 1 , B 2 , A, C, E cao. Vì vậy ở nhiều nước trên thế giới đã sử dụng trùn Quế để chế biến thành thực phẩm cho con người. Ở Nhật có tới 200 loại thực phẩm chế biến từ trùn Quế như ở Ý trùn Quế còn được chế biến thành patê, ở Úc người ta ăn trùn Quế với món ốp-lết. Hiện nay trên thị trường đã có bán bánh bích qui có hàm lượng trùn Quế. Nhiều nhà dinh dưỡng học trên thế giới dự đoán trùn Quế là loại động vật dinh dưỡng cao và rất dễ nuôi. Vì thế trong tương lai có thể trùn Quế sẽ là nguồn thực phẩm quan trọng, phổ biến và quý giá của loài người. Y học cổ truyền của nhiều nước trong đó có Việt Nam đã dùng trùn Quế để chữa các bệnh về tim mạch, huyết áp, thần kinh, kháng ung thư, hen suyễn và thấp khớp, thương hàn Loại amino acid Tyrosin có trong trùn Quế có khả năng tăng tuần hoàn máu ngoại vi của bề mặt cơ thể, có tác dụng giải nhiệt, hạ sốt. Dịch ngâm nước của trùn quế có tác dụng giảm đau. Một số amino acid của trùn Quế có tác dụng làm thuốc trị bệnh xơ vữa động mạch và hàm lượng mỡ trong máu cao. Các amino acid quan trọng được chiết xuất từ trùn Quế được sử dụng trong thực phẩm cho trẻ em giúp tăng sức đề kháng, chống suy dinh dưỡng, phát triển hệ cơ, giảm hội chứng thiểu năng trí tuệ. Việc bổ sung các amino acid quan trọng này vào trong thực phẩm cho các vận động viên thể thao giúp tăng cường sức khoẻ, bồi bổ sinh lực, tăng khả năng chịu đựng của cơ bắp. Giúp người bệnh mau phục hồi sức khoẻ. Trong đề tài nghiên cứu này chúng tôi nghiên cứu về thành phần amino acid có trong trùn Quế bằng phương pháp HPLC. LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -8- CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU TRÙN QUẾ (Perionyx excavatus) Trùn Quế (một số tài liệu nước ngoài thường gọi là Blue Worm, Indian Blu, Malaysian Blue) là động vật không xương sống, cơ thể phân đốt, phần đầu thoái hóa, có mang đai sinh dục (clitellum), các hệ bên trong cơ thể như hệ tuần hoàn, hệ thần kinh, hệ bài tiết, . . . cũng sắp xếp theo đốt. Mỗi đốt mang một đôi hạch thần kinh giúp cho trùn ghi nhận cảm giác và phản ứng đáp trả của cơ thể đối với môi trường ngoài rất nhạy bén. Trùn Quế thuộc nhóm trùn ăn phân, thường sống trong môi trường có nhiều chất hữu cơ đang phân hủy, trong tự nhiên ít tồn tại với quần thể lớn và không có khả năng cải tạo đất trực tiếp như một số loài trùn địa phương như trùn hổ sống trong đất. Trùn Quế là một trong những giống trùn đã được thuần hóa, nhập nội và đưa vào nuôi công nghiệp. Là loài trùn mắn đẻ, xuất hiện rải rác ở vùng nhiệt đới, dễ bắt bằng tay, dễ thu hoạch. Được sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm ở các nước: Philippin , Australia, Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản…. Chúng phân bố ở nhiều quốc gia như: Việt Nam, Ấn Độ, Indonesia, Australia, Phillippin, Đài Loan, Hawaii, Madagasca, Samoa . . . Phân loại: • Ngành: Annelides (ngành giun đốt) • Phân ngành: Clitellata (phân ngành có đai) • Lớp: Olygochaeta (lớp giun ít tơ) • Họ: Megascocidae (họ cự dẫn) • Chi: Pheretima • Loài: Perionyx excavatus (trùn Quế) LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG [...]... (Dns-Cl) 0,25%(mg/ml), 0,5%(mg/ml), 1,0%(mg/ml), được chuẩn bị bằng cách hòa tan Dansyl clorur (Merck) trong dung môi aceton (Merck) 2.1.3 Vật liệu LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -30- Trùn Quế (Perionyx excavatus ) được lấy từ trang trại nuôi trùn Quế ở trường đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh 2.2 PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 2.2.1 Cách tiến hành phản ứng Dansyl hóa tạo dẫn xuất Dansyl của amino acid. .. quả của việc tách các chất Trong đề tài nghiên cứu này chúng tôi nghiên cứu về thành phần amino acid có trong Trùn Quế bằng phương pháp HPLC để góp phần vào sự hiểu biết thêm về loài động vật thân mềm này 1.4 PHẢN ỨNG DANSYL HÓA AMINO ACID H3C N H3C O O C O Cl pH 9 H3C N H3C + H2N CH R O O O O C NH CH R + + H + Cl- O Phản ứng Dansyl hóa amino acid Phản ứng Dansyl hóa là phản ứng thế thân hạch để chuyển... -24- 1.3 PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN AMINO ACID TRONG TRÙN QUẾ Để phân tích thành phần amino acid trong trùn Quế, người ta thường dùng các phương pháp sắc ký như sắc ký bản mỏng, sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao 1.3.1 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ BẢN MỎNG Phương pháp sắc ký bản mỏng nhuộm màu với thuốc thử Ninhydrin có thể định tính, bán định lượng đồng thời nhiều amino acid từ dịch thủy phân protein Phương pháp này... CƯỜNG -26- 1.3.2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ Phương pháp sắc ký khí thường phải dùng các phản ứng pentafluorobenzyl, N-heptafluorobutyryl hóa, để tạo ra các dẫn xuất dễ bay hơi cho các amino acid Tuy nhiên, khả năng phân tách của phương pháp này cũng không cao (xem hình 2. 1) Hình 2 1 Sắc ký đồ phân tách dẫn xuất pentafluorobenzyl-AA tiêu biểu 1.3.3 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) Sắc ký lỏng hiệu... hiệu năng cao là phương pháp phân tích amino acid phổ biến nhất hiện nay Nhiều công trình phân tích amino acid dựa trên phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đã được công bố và nó đã trở thành phương pháp tiêu chuẩn để phân tích amino acid LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGUYỄN QUỐC CƯỜNG -27- Hệ thống thiết bị HPLC: Sơ đồ hệ thống thiết bị: Dung môi Bơm Bộ tiêm mẫu Cột bảo vệ Đầu dò Cột phân tích Máy ghi tín... đệm borat 2.2.3 Khảo sát pH của phản ứng Dansyl hóa Để khảo sát pH của phản ứng Dansyl hóa, chúng tôi thực hiện phản ứng trong môi trường đệm Borat 0,2M với các pH khác nhau(pH=8;9;1 0) và các thông số khác như nồng độ Dansyl là 0,5 %, nhiệt độ phản ứng 600C, thời gian phản ứng 30 phút 2.2.4 Khảo sát nồng độ thuốc thử Dansyl clorur Thực hiện phản ứng Dansyl hóa 11 amino acid tại pH = 9 với nồng độ thuốc... 3.5 còn các thông số khác như thời gian phản ứng là 30phút, pH=9 (của đệm borat 0,2M), nồng độ Dansyl clorur 0,5%(w/v) 2.2.7 Qui trình thủy phân trùn Quế bằng acid và phản ứng Dansyl hóa Cân 0,1g trùn Quế đã sấy khô ( ở nhiệt độ 1100C trong 5h) cho vào ống Hach, thêm 3ml nước cất 2 lần và 3ml HCl đậm đặc Lắc đều và dùng khí nitrogen thổi vào miệng ống trong 30giây để đuổi khí oxygen rồi đóng nắp lại Đưa... dịch amino acid (chuẩn/mẫu) được pha trong đệm borat 0, 2M ở pH 9 vào ống nghiệm, tiếp tục thêm 0,5 ml dung dịch thuốc thử Dansyl clorur 0 , 25%(w/v) pha trong aceton, phản ứng được thực hiện ở 600C trong 30 phút 2.2.2 Khảo sát điều kiện tối ưu để tiến hành phản ứng tạo dẫn xuất Dansyl Khảo sát pH của phản ứng Dansyl hóa Khảo sát nồng độ thuốc thử Dansyl clorur Khảo sát thời gian của phản ứng Dansyl hóa. .. Glutamine (Gln) O H2N CHC OH CH2 CH2 CH2 CH2 NH2 O H2N CHC OH CH2 O H2N CHC OH CH2 CH2 S CH3 Methionine (Met) Isoleusine (Ile) O H2N CHC OH CH2 O C OH HN Proline (Pro) Phenylalanine (Phe) Lysine (Lys) O H2N CHC OH CH2 OH Serine (Ser) O H2N CHC OH CHOH CH3 Threonine (Thr) O H2N CHC OH CH2 O H2N CHC OH CHCH3 CH3 Valine (Val) HN Tryptophan (Trp) LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC O H2N CHC OH CH2 OH Tyrosine (Tyr) NGUYỄN... (Ala) O H2N CHC OH CH2 CH2 CH2 NH C NH NH2 Arginine (Arg) O H2N CHC OH CH2 C O NH2 O H2N CHC OH CH2 CH2 C O OH O H2N CHC OH CH2 CH2 C O NH2 O H2N CHC OH H O H2N CHC OH CH3 Glutamic acid (Glu) O H2N CHC OH CH2 CHCH3 CH3 Leucine (Leu) O O H2N CHC OH H2N CHC OH CH2 CH2 C O SH OH Cystein (Cys) Asparagine (Asn) Aspartic acid (Asp) Glycine (Gly) N NH O H2N CHC OH CHCH3 CH2 CH3 Histidine (His) Glutamine (Gln) . NGUYỄN QUỐC CƯỜNG TỐI ƯU HOÁ PHẢN ỨNG DANSYL -AMINO ACID DÙNG ĐỂ PHÂN TÍCH AMINO ACID CỦA TRÙN QUẾ (Perionyx excavatus) BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC . NGUYỄN QUỐC CƯỜNG TỐI ƯU HOÁ PHẢN ỨNG DANSYL -AMINO ACID DÙNG ĐỂ PHÂN TÍCH AMINO ACID CỦA TRÙN QUẾ (Perionyx excavatus) BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỮU CƠ MÃ SỐ: 604427. 3.3.QUI TRÌNH PHÂN TÍCH AMINO ACID CỦA TRÙN QUẾ 47 3.3.1.Qui trình thủy phân trùn Quế bằng acid và phản ứng Dansyl hóa 47 3.3.2.Qui trình thủy phân trùn Quế bằng baz và phản ứng Dansyl hóa 4 7 3.3.3