ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM THU NHẬN ENZYM PAPAIN ĐỂ ỨNG DỤNG VÀO PHẢN ỨNG THỦY PHÂN PROTEIN TRONG BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỮU CƠ MÃ SỐ: 604427 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS. TRẦN KIM QUI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2009 LỜI CẢM ƠN  Để hoàn thành chƣơng trình cao học và luận văn này, em đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn, giúp đỡ và góp ý nhiệt tình của quý thầy cô khoa Hóa trƣờng Đại Học Khoa Học Tự Nhiên. Trƣớc hết, em xin chân thành cảm ơn đến quý thầy cô khoa Hóa trƣờng Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TpHCM, đặc biệt là những thầy cô đã tận tình dạy bảo cho em trong suốt thời gian học tập tại trƣờng. Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến GS.TS. Trần Kim Qui, TS. Lê Việt Tiến đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hƣớng dẫn nghiên cứu và giúp em hoàn thành luận văn này. Nhân đây, em cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị nghiên cứu sinh đã động viên và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình hoàn thành luận văn. Em xin chân thành cảm ơn anh Hồ Anh Vũ, anh luôn động viên và đồng hành cùng em trong suốt thời gian học tập cũng nhƣ thời gian em thực hiện luận văn này. Cuối cùng con xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình đã cho con có đƣợc thành quả nhƣ ngày hôm nay. Mặc dù đã có nhiều cố gắng để hoàn thiện luận văn bằng tất cả sự nhiệt tình và năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận đƣợc những ý kiến đóng góp quý báu của quý thầy cô và các bạn. Tp.HCM – Ngày 12 tháng 09 năm 2009 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Chương 1 TỔNG QUAN 2 1.1 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN 2 1.1.1 Cysteine protease 2 1.1.2 Papain 2 1.1.2.1 Nguồn gốc 2 1.1.2.1.1. Giới thiệu về cây đu đủ. 3 1.1.2.1.2. Phân bố sinh thái của cây đu đủ. 4 1.1.2.1.3. Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong cây đu đủ 4 1.1.2.2 Tính chất của papain 5 1.1.2.2.1 Tính chất vật lý 5 1.1.2.2.2 Tính chất hóa học 5 a) Cấu tạo hóa học 5 b) Cấu trúc không gian 6 c) Cấu trúc tâm hoạt động của papain 7 d) Phản ứng của papain 7 e. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain 9 1.1.2.3 Ứng dụng của enzyme papain 10 1.1.2.3.1 Trong y học: 10 1.1.2.3.2 Trong công nghiệp thực phẩm: 10 1.1.2.3.3 Trong các ngành công nghiệp khác: 10 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG 10 1.3 PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG 12 1.3.1 Khái niệm phản ứng thủy phân 12 1.3.2 Quy trình thực hiện phản ứng thủy phân 13 1.3.3 Các thay đổi hóa sinh trong quá trình thủy phân: 14 1.3.4 Tính chất của sản phẩm sau thủy phân 14 1.3.5 Ƣu và nhƣợc điểm của phản ứng thủy phân: 15 1.3.5.1 Ƣu điểm: 15 1.3.5.2 Nhƣợc điểm: 15 1.4 ỨNG DỤNG ENZYME PAPAIN LÀM XÚC TÁC CHO PHẢN ỨNG THỦY PHÂN PROTEIN TRONG BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG 15 Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 17 2.1. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 17 2.1.1. Hóa chất 17 2.1.2. Thiết bị 18 2.2 PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN 18 2.2.1 Phƣơng pháp trích nhựa đu đủ từ trái 18 2.2.2 Phƣơng pháp thu nhận papain tinh khiết 19 2.2.2.1 Loại bỏ các chất không tan ở pH 9. 20 2.2.2.2 Quá trình phân đoạn bằng amonium sulfate 20 2.2.2.3 Quá trình phân đoạn bằng NaCl 20 2.2.2.4 Kết tinh 20 2.2.2.5 Tái kết tinh 21 2.2.2.6 Đông khô chân không. 21 2.2.3 Xác định lƣợng protein theo phƣơng pháp Lowry 22 2.2.4 Xác định hoạt tính protein theo phƣơng pháp Anson 23 2.2.5 Xác định đạm tổng số theo phƣơng pháp Kjeldahl 24 2.2.5.1 Nguyên tắc: 24 2.2.5.2 Cách tính: 24 2.2.6 Phƣơng pháp xác định đạm formol (phƣơng pháp Sorensen) 25 2.2.6.1 Nguyên tắc 25 2.2.6.2 Tiến hành 25 2.2.6.3 Cách tính 26 2.2.7 Xác định đạm amoniac 26 2.2.7.1 Nguyên tắc 26 2.2.7.2 Tiến hành 27 2.2.7.3 Cách tính 27 2.2.8 Phƣơng pháp chung tiến hành phản ứng thủy phân bánh dầu đậu phộng với xúc tác papain thô. 27 2.2.8.1 Phƣơng pháp loại béo: 27 2.2.8.2 Phƣơng pháp thực hiện phản ứng 27 2.2.8.3 Hiệu suất thủy phân 28 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 KHẢO SÁT LƢỢNG NHỰA Ở QUẢ ĐU ĐỦ 30 3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SƠ CHẾ NHỰA TƢƠI 30 3.3 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN THU NHẬN PAPAIN TỪ NHỰA KHÔ 31 3.4 PHƢƠNG PHÁP LOWRY XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG PROTEIN 33 3.5 PHƢƠNG PHÁP ANSON XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE 34 3.6 KHẢO SÁT LƢỢNG ENZYME THU ĐƢỢC SAU CÁC GIAI ĐOẠN TINH CHẾ. 35 3.7 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CỦA ENZYME SAU CÁC GIAI ĐOẠN TINH CHẾ 37 3.8 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI LƢỢNG PROTEIN TRONG CÁC CHẾ PHẨM PROTEASE THU ĐƢỢC THEO THỜI GIAN 39 3.9 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI HOẠT TÍNH CỦA CÁC CHẾ PHẨM THEO THỜI GIAN. 41 3.10 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME PAPAIN. 44 3.10.1. Khảo sát ảnh hƣởng của pH 44 3.10.2 Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ 45 3.11 KHẢO SÁT HÀM LƢỢNG ĐẠM FORMOL VÀ AMONIAC THEO THỜI GIAN TRONG PHẢN ỨNG THỦY PHÂN. 46 3.12 KHẢO SÁT PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG VỚI XÚC TÁC PAPAIN THÔ. 49 3.12.1. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.25% so với cơ chất theo thời gian 50 3.12.2. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.50% so với cơ chất theo thời gian 57 3.12.3. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.75% so với cơ chất 65 3.12.4. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 1.00% so với cơ chất 72 KẾT LUẬN 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO 81 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tính chất vật lý của papain 5 Bảng 1.2 Thành phần hóa học của hạt đậu phộng 10 Bảng 1.3. Thành phần acid béo trong bánh dầu đậu phộng 11 Bảng 1.4 Thành phần hóa học của bã đậu phộng đã loại béo 11 Bảng 1.5. Thành phần amino acid trong đậu phộng 11 Bảng 3.1. Hàm lượng phần trăm của nhựa đu đủ trong các loại quả khác nhau. 30 Bảng 3.2. Các phương pháp làm khô nhựa đu đủ 30 Bảng 3.3. Mật độ quang của albumin ở bước sóng 750nm 33 Bảng 3.4. Mật độ quang của tyrosin ở bước sóng 720nm 34 Bảng 3.5. Lượng protein thu được ở các phân đoạn tinh chế khác nhau. 36 Bảng 3.6. Hoạt tính protease của enzyme sau các giai đoạn tinh chế 38 Bảng 3.7. Hàm lượng protein của các chế phẩm theo thời gian 40 Bảng 3.8. Hoạt tính protein của các chế phẩm theo thời gian 42 Bảng 3.9. Hoạt tính của protein P(UI) biến đổi theo pH 44 Bảng 3.10. Hoạt tính của protein P(UI) trong nhựa khô biến đổi theo nhiệt độ 45 Bảng 3.11: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.25% so với cơ chất. 47 Bảng 3.12: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.50% so với cơ chất. 47 Bảng 3.13: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 1.00% so với cơ chất. 47 Bảng 3.14: Biến thiên hàm lượng đạm amoniac ở các nồng độ enzyme khác nhau 48 Bảng 3.15. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60 O C và hàm lượng xúc tác là 0.25% 51 Bảng 3.16. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70 O C và hàm lượng xúc tác là 0.25% 51 Bảng 3.17. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80 O C và hàm lượng xúc tác là 0.25% 52 Bảng 3.18. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60 O C và hàm lượng xúc tác là 0.25% 53 Bảng 3.19. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70 O C và hàm lượng xúc tác là 0.25% 53 Bảng 3.20. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80 O C và hàm lượng xúc tác là 0.25% 54 3.11 KHẢO SÁT HÀM LƢỢNG ĐẠM FORMOL VÀ AMONIAC THEO THỜI GIAN TRONG PHẢN ỨNG THỦY PHÂN. 46 3.12 KHẢO SÁT PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG VỚI XÚC TÁC PAPAIN THÔ. 49 3.12.1. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.25% so với cơ chất theo thời gian 50 3.12.2. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.50% so với cơ chất theo thời gian 57 3.12.3. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.75% so với cơ chất 65 3.12.4. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 1.00% so với cơ chất 72 KẾT LUẬN 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO 81 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tính chất vật lý của papain 5 Bảng 1.2 Thành phần hóa học của hạt đậu phộng 10 Bảng 1.3. Thành phần acid béo trong bánh dầu đậu phộng 11 Bảng 1.4 Thành phần hóa học của bã đậu phộng đã loại béo 11 Bảng 1.5. Thành phần amino acid trong đậu phộng 11 Bảng 3.1. Hàm lượng phần trăm của nhựa đu đủ trong các loại quả khác nhau. 30 Bảng 3.2. Các phương pháp làm khô nhựa đu đủ 30 Bảng 3.3. Mật độ quang của albumin ở bước sóng 750nm 33 Bảng 3.4. Mật độ quang của tyrosin ở bước sóng 720nm 34 Bảng 3.5. Lượng protein thu được ở các phân đoạn tinh chế khác nhau. 36 Bảng 3.6. Hoạt tính protease của enzyme sau các giai đoạn tinh chế 38 Bảng 3.7. Hàm lượng protein của các chế phẩm theo thời gian 40 Bảng 3.8. Hoạt tính protein của các chế phẩm theo thời gian 42 Bảng 3.9. Hoạt tính của protein P(UI) biến đổi theo pH 44 Bảng 3.10. Hoạt tính của protein P(UI) trong nhựa khô biến đổi theo nhiệt độ 45 Bảng 3.11: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.25% so với cơ chất. 47 Bảng 3.12: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.50% so với cơ chất. 47 Bảng 3.13: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 1.00% so với cơ chất. 47 Bảng 3.14: Biến thiên hàm lượng đạm amoniac ở các nồng độ enzyme khác nhau 48 Bảng 3.15. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60 O C và hàm lượng xúc tác là 0.25% 51 Bảng 3.16. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70 O C và hàm lượng xúc tác là 0.25% 51 Bảng 3.17. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80 O C và hàm lượng xúc tác là 0.25% 52 Bảng 3.18. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60 O C và hàm lượng xúc tác là 0.25% 53 Bảng 3.19. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70 O C và hàm lượng xúc tác là 0.25% 53 Bảng 3.20. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80 O C và hàm lượng xúc tác là 0.25% 54 Bảng 3.21. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 60 O C và hàm lượng xúc tác là 0.25% 55 Bảng 3.22. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 70 O C và hàm lượng xúc tác là 0.25% 56 Bảng 3.23. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 80 O C và hàm lượng xúc tác là 0.25% 56 Bảng 3.24. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60 O C và hàm lượng xúc tác là 0.50% 58 Bảng 3.25. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70 O C và hàm lượng xúc tác là 0.50% 59 Bảng 3.26. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80 O C và hàm lượng xúc tác là 0.50% 59 Bảng 3.27. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60 O C và hàm lượng xúc tác là 0.50% 60 Bảng 3.28. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70 O C và hàm lượng xúc tác là 0.50% 61 Bảng 3.29. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80 O C và hàm lượng xúc tác là 0.50% 61 Bảng 3.30. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 60 O C và hàm lượng xúc tác là 0.50% 62 Bảng 3.31. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 70 O C và hàm lượng xúc tác là 0.50% 63 Bảng 3.32. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 80 O C và hàm lượng xúc tác là 0.50% 63 Bảng 3.33. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60 O C và hàm lượng xúc tác là 0.75% 65 Bảng 3.34. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70 O C và hàm lượng xúc tác là 0.75% 66 Bảng 3.35. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80 O C và hàm lượng xúc tác là 0.75% 66 Bảng 3.36. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60 O C và hàm lượng xúc tác là 0.75% 68 Bảng 3.37. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70 O C và hàm lượng xúc tác là 0.75% 68 Bảng 3.38. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80 O C và hàm lượng xúc tác là 0.75% 69 Bảng 3.39. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 60 O C và hàm lượng xúc tác là 0.75% 70 Bảng 3.40. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 70 O C và hàm lượng xúc tác là 0.75% 70 Bảng 3.41. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 80 O C và hàm lượng xúc tác là 0.75% 71 Bảng 3.42. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60 O C và hàm lượng xúc tác là 1.00% 72 Bảng 3.43. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70 O C và hàm lượng xúc tác là 1.00% 73 Bảng 3.44. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80 O C và hàm lượng xúc tác là 1.00% 74 Bảng 3.45. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60 O C và hàm lượng xúc tác là 1.00% 75 Bảng 3.46. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70 O C và hàm lượng xúc tác là 1.00% 75 Bảng 3.47. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80 O C và hàm lượng xúc tác là 1.00% 76 Bảng 3.48. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 60 O C và hàm lượng xúc tác là 1.00% 77 Bảng 3.49. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 70 O C và hàm lượng xúc tác là 1.00% 77 Bảng 3.50. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 80 O C và hàm lượng xúc tác là 1.00% 78 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 2.1. Các loại hoa và trái của cây đu đủ. 3 Hình 1.2 Cấu trúc bậc 3 của papain 6 Hình 1.3 Cấu trúc tâm hoạt động của papain 7 Hình 1.4. Phản ứng hóa học của papain 8 Hình 1.8. Sơ đồ phản ứng thủy phân 13 Hình 2.1 Cách lấy nhựa đu đủ 19 Hình 2.2 Sơ đồ thu nhận papain từ nhựa đu đủ đông khô 21 Hình 3.1a. Điện di đồ của nhựa khô ở trái non sơ chế bằng dung môi etanol 31 Hình 3.1 b. Điện di đồ của chế phẩm Merk và papain tinh chế từ nhựa đu đủ đông khô. 32 Hình 3.2. Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ albumin. 33 Hình 3.3. Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ tyrosin. 34 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự biến thiên lượng protein sau mỗi giai đoạn tinh chế. . 36 Hình 3.5. Sự biến thiên hoạt tính của protein sau các giai đoạn tinh chế. 39 Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lượng protein theo thời gian 40 Hình 3.7. Sự biến đổi hoạt tính của các chế phẩm theo thời gian 42 Hình 3.8 Hoạt tính của protein P(UI/ml) trong nhựa khô biến đổi theo pH 44 Hình 3.9:Hoạt tính của protein trong nhựa khô theo nhiệt độ 46 Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian phản ứng. 48 Hình 3.11. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 6.0 và hàm lượng xúc tác là 0.25%. 52 Hình 3.12. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 7.0 và hàm lượng xúc tác là 0.25%. 55 Hình 3.13. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 8.0 và hàm lượng xúc tác là 0.25%. 57 Hình 3.14. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 6.0 và hàm lượng xúc tác là 0.50%. 60 Hình 3.15. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 7.0 và hàm lượng xúc tác là 0.50%. 62 Hình 3.16. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 8.0 và hàm lượng xúc tác là 0.50%. 64 Hình 3.17. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 6.0 và hàm lượng xúc tác là 0.75%. 67 Tại pH 7.0, hiệu suất phản ứng ở mỗi nhiệt độ khác nhau được trình bày trong bảng 3.36 – 3.38. 67 Hình 3.18. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 7.0 và hàm lượng xúc tác là 0.75%. 69 Hình 3.19. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 8.0 và hàm lượng xúc tác là 0.75%. 71 Hình 3.20. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 6.0 và hàm lượng xúc tác là 1.00%. 74 Hình 3.21. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 7.0 và hàm lượng xúc tác là 1.00%. 76 Hình 3.22. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 8.0 và hàm lượng xúc tác là 1.00%. 78 Hình 3.23 Kết quả điện di của dung dịch sau phản ứng ở các hàm lượng xúc tác khác nhau 79 1 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM MỞ ĐẦU Hiện nay vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm và ô nhiễm môi trường đang là vấn đề được quan tâm hàng đầu. Trong quá trình sản xuất nước chấm có hàm lượng đạm cao, người ta thường dùng các phương pháp thủy phân protein tạo thành các dung dịch amino acid. Có 3 phương pháp tiến hành phản ứng thủy phân protein: Phương pháp hóa học: thủy phân protein với xúc tác acid, thời gian tiến hành phản ứng là 24 giờ. Nhược điểm của phương pháp này là tạo thành sản phẩm phụ 3- MCPD, một chất độc gây ung thư. Phương pháp dùng men vi sinh: sử dụng chủng nấm Aspergillus oryzae để xúc tác phản ứng thủy phân protein. Nhược điểm của phương pháp này là thời gian thực hiện phản ứng khá dài khoảng từ 6 – 8 tháng. Phương pháp hóa sinh: sử dụng xúc tác là các enzyme protease có nguồn gốc động thực vật làm xúc tác. Phương pháp này có thời gian phản ứng ngắn và không tạo sản phẩm phụ có khả năng gây ung thư. Các phản ứng sử dụng xúc tác enzyme được ứng dụng rất rộng rãi trong lĩnh vực này vì chúng không những cho hiệu suất cao mà thời gian thực hiện phản ứng cũng ngắn hơn so với phản ứng được tiến hành theo phương pháp cổ điển. Hơn nữa các enzyme thường được phân bố rất rộng rãi trong tất cả các mô, cơ quan động vật và thực vật, tế bào vi sinh vật nên tương đối dễ tìm. Trong phạm vi luận văn này chúng tôi sẽ tiến hành thu nhận enzyme papain có trong nhựa đu đủ và ứng dụng tính chất thủy phân protein của enzyme papain để làm xúc tác cho phản ứng thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng đã được ép lấy dầu. Chúng tôi chọn enzyme papain vì đây là enzyme có hoạt tính protease cao, hiện diện nhiều trong nhựa trái đu đủ, một loại cây được trồng rất phổ biến ở nước ta. 2 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN 1.1.1 Cysteine protease [8, 9, 19, 34, 43] Cysteine proteases (EC.3.4.22) là nhóm các protein có trọng lượng phân tử trong khoảng 21-30 kDa, các protein này có khả năng xúc tác để thủy phân các loại liên kết: peptide, amide, ester thiol. Đây cũng là những enzyme có nhóm –SH trong tâm hoạt động. Người ta đã tìm thấy hơn 20 họ cysteine proteases (Barrett, 1994) và nhiều enzyme trong số này (papain, bromelain, ficain, animal cathepsins) được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp. Có hai loại cysteine proteases là exopeptidase (cathepsin X, carboxypeptidase B) và endopeptidases (bromelain, ficain, cathepsin ). Exopeptidase thủy phân liên kết peptide ở đầu N hoặc đầu C tự do trong khi đó endopeptidase cắt đứt các liên kết peptide ở giữa chuỗi polypeptide. 1.1.2 Papain 1.1.2.1 Nguồn gốc [2,17, 19, 32 ] Papain (EC 3.4.22.3) là cysteine protease được biết đến nhiều nhất và được phân lập lần đầu tiên vào năm 1879 từ nhựa trái đu đủ (Carica papaya). Đây cũng là enzyme đầu tiên được xác định cấu trúc tinh thể (Drenth et al., 1968; Kamphuis et al., 1894). Trong nhựa đu đủ ngoài enzyme papain còn có các loại protease khác như chymopapain, caricain, glycyl endopeptidase và một số enzyme khác (Baines and Brock-lehurst, 1979). Nhựa đu đủ có hàm lượng và hoạt tính papain cao nhất tập trung ở vùng có nắng nóng và độ ẩm ổn định quanh năm. [...]... số phản ứng hóa học khác, phản ứng thủy phân với xúc tác enzyme xảy ra ở những điều kiện ít khắc nghiệt hơn Phản ứng thủy phân bằng enzyme có biệt tính chọn lọc lập thể cao 1.3.5.2 Nhƣợc điểm: Thời gian thủy phân với xúc tác enzyme thường kéo dài hơn so với thủy phân với xúc tác acid Dịch sau thủy phân thường khó lọc 1.4 ỨNG DỤNG ENZYME PAPAIN LÀM XÚC TÁC CHO PHẢN ỨNG THỦY PHÂN PROTEIN TRONG BÁNH DẦU... amin trong đậu phộng Tên cấu tử Hàm lượng (%) Tryptophan 0.5 Leucin 3.5 Isoleucin 1.5 Valin 1.65 Threonin 0.75 Lysin 1.5 Methionin 0.6 Phenylalanin 2.7 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 12 1.3 PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG 1.3.1 Khái niệm phản ứng thủy phân[ 13, 14, 15] Phản ứng thủy phân là phản ứng phân hủy các chất có sự tham gia của nước Phản ứng thủy phân là phản ứng. .. trình tổng qt của phản ứng thủy phân R1R2 + H2O Enzym + - R1OH + R2H (H , HO ) Các tác nhân làm xúc tác cho phản ứng thủy phân thường là các acid, base hay các enzyme hydrolase trong đó đặc biệt được ứng dụng rộng rãi là các enzyme có nguồn gốc vi sinh vật và thực vật Trong phản ứng thủy phân có sự tham gia của một lượng nước rất lớn do đó tốc độ của phản ứng thủy phân chỉ tùy thu c vào nồng độ của cơ... cơ chất Như vậy, phản ứng thủy phân xúc tác bởi enzyme là phản ứng đơn phân có thứ bậc 1 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 13 1.3.2 Quy trình thực hiện phản ứng thủy phân e e Hình 1.8 Sơ đồ phản ứng thủy phân Q trình chuyển từ protein bánh đậu phộng thành acid amin là một q trình khá phức tạp Dưới điều kiện thích hợp cho q trình thủy phân, enzyme sẽ tham gia phản ứng theo sơ đồ sau:... ĐẬU PHỘNG Trong luận văn này, chúng tơi điều chế enzyme papain để thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng với các nội dung sau: 1 Thu nhận enzyme papain từ nhựa trái đu đủ  Khảo sát các điều kiện thu nhận enzyme papain LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 16  Định lượng và hoạt tính của enzyme papain sau mỗi giai đoạn tinh chế  Khảo sát sự biến đổi lượng và hoạt tính enzyme papain. .. sản phẩm phụ Dịch thủy phân thu được có độ thu n khiết cao Sử dụng enzyme xúc tác phản ứng có thể định hướng được phản ứng xảy ra và sản phẩm tạo thành Có thể điều chỉnh được phản ứng nhằm tạo ra sản phẩm mong muốn Hiệu suất thủy phân của enzyme khá cao, chỉ cần một lượng nhỏ enzyme cũng có thể thủy phân được một lượng rất lớn cơ chất Trong phản ứng xúc tác bởi enzyme thì u cầu về độ thu n khiết của... bằng cách kiểm sốt mức độ thủy phân để cho những peptid có phân tử lượng lớn chiếm ưu thế Việc sử dụng enzyme làm xúc tác có nhược điểm là thủy phân khơng triệt để, sau thủy phân còn khoảng 20% nitơ tổng số vẫn khơng tan, do đó người ta thường phối hợp thủy phân bằng hóa chất để nâng cao hiệu suất thủy phân 1.3.5 Ƣu và nhƣợc điểm của phản ứng thủy phân: 1.3.5.1 Ƣu điểm: Do enzyme hydrolase có tính đặc... thì papain có độ bền nhiệt thấp hơn papain ở trong nhựa, do trong nhựa còn chứa các protein khác có tác dụng bảo vệ papain Papain trong dung dịch NaCl giữ ở 4oC bền trong nhiều tháng Trong dung dịch dẫn xuất thủy ngân, papain cũng khơng mất hoạt tính trong nhiều tháng Trong khi đó hầu hết các enzyme mất hoạt tính mỗi ngày 1-2% do sự phân hủy hoặc oxy hóa Khi thủy phân các protein khác nhau, thì tùy thu c... 2:1, khuấy đều, đem lọc Thực hiện sự rửa này 7 lần Sản phẩm thu được đem sấy khơ ta được bánh dầu đậu phộng đã loại béo 2.2.8.2 Phƣơng pháp thực hiện phản ứng[ 5, 30, 31, 37] Phản ứng thủy phân được thực hiện tại tỉ lệ của bánh dầu đậu phộng với dung dịch đệm phosphate là 1:10 Cân 5g bánh dầu đậu phộng đã loại béo cho vào LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 28 erlen 100ml, thêm vào 50ml dung... Trong y học: Papain được dùng làm thu c chống giun sán, ăn khơng tiêu, chống biếng ăn,… papain còn dùng làm thu c rửa ráy tai, dùng trong phẫu thu t Papain có tác dụng lên hệ mạch dùng trị bệnh bạch cầu, viêm họng… 1.1.2.3.2 Trong cơng nghiệp thực phẩm: Papain được dùng để làm mềm thịt, dùng để thủy phân gan cá ngừ làm thu c bổ Papain còn được dùng trong sản xuất bia vì nó giúp tiêu hóa các protein còn . PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG 1.3.1 Khái niệm phản ứng thủy phân [13, 14, 15] Phản ứng thủy phân là phản ứng phân hủy các chất có sự tham gia của nước. Phản ứng thủy phân là phản ứng. nhận enzyme papain có trong nhựa đu đủ và ứng dụng tính chất thủy phân protein của enzyme papain để làm xúc tác cho phản ứng thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng đã được ép lấy dầu. . KHOA HỌC TỰ NHIÊN CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM THU NHẬN ENZYM PAPAIN ĐỂ ỨNG DỤNG VÀO PHẢN ỨNG THỦY PHÂN PROTEIN TRONG BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỮU CƠ MÃ SỐ: 604427