VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 21-Tháng 12-2009 48 ẢNH HƯỞNG CỦA TUỔI BÒ ĐẾN SỐ LƯỢNG VÀ CHẤT LƯ ỢNG TẾ BÀO TRỨNG CHỌC HÚT BẰNG SIÊU ÂM Phan Lê Sơn 1 , Nguyễn Thị Thoa 2 , Lưu Công Khánh 1 , Chu Thị Yến 1 , Nguyễn Thị Hương 1 , Phạm Khánh Vân 2 và Lưu Thị Ngọc Anh 2 1 Bộ môn Sinh lý Sinh hóa và Tập tính vật nuôi 2 Phòng thí nghiệm trong điểm Tế bào động vật *Tác giả liên hệ: Phan Lê Sơn - Bộ môn Sinh lý Sinh hóa và Tập tính vật nuôi Viện Chăn nuôi - Thụy Phương - Từ Liêm - Hà Nội Tel: (04) 38.385.940 /0914551149 ; Email: sonphanle@yahoo.com ABSTRACT Effect of cow ages on oocyte quantity and quality Phan Le Son*, Nguyen Thi Thoa, Luu Cong Khanh, Chu Thi Yen, Nguyen Thi Huong, Pham Khanh Van and Lưu Thi Ngoc Anh The aim of this study was examin the possible effect of age of doner cows on oocytes quantity and quality. Two groups of Holstein Friese cows of 3 and six years were used . For this study ovum pick up was conducted twice a weeks .It was found that number of follicles with diameter of 2 to ≥ 9mm obtained from 3 year old cows was higher than that from 6 year old cows (10.35 vs 9.63) p<0.05. Similarly, number of oocyte/ovary otained from 3 year old cows was higher than that from 6 year old cows (7.2 vs 6.78) (p< 0.05). The number of oocytes qualified as A,B Grade, Which can be use for maturation , fertiliration and culturewas higher in cows of 3 year old (5.39 vs 5.12) than that in cows of 6 year old. It was conluded that the younger the cows were, the greater the quantity and quality of oocytes were. Key word: occyte, ovum pick up, follicle ĐĂT VẤN ĐỀ Số lượng, chất lượng, nguồn gốc tế bào trứng đóng một vai trò hết sức quan trọng trong việc phát triển các công nghệ sinh sản như sản xuất phôi in-vitro, vi tiêm, cloning, chuyển gen, thành lập ngân hàng tế bào trứng,…Trước đây tế bào trứng để phục vụ nghiên cứu và sản suất phôi bò ở nước ta được lấy từ lò mổ nên chất lượng di truyền của phôi rất thấp, khả năng triển khai vào sản xuất rất hạn chế do ở Việt Nam bò được giết thịt ở các lò mỏ chủ yếu là bò vàng, bò lai sind có khả năng di truyền và chất lượng tế bào trứng rất kém. Hiện nay kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng từ bò sống đã thành công, cho phép chúng ta có được số lượng và chất lượng tế bào trứng tốt của bò cho. Tế bào trứng có giá trị di truyền cao, chủ động được thời gian, do vậy chất lượng phôi tốt, dễ triển khai sản suất, thu được sản phẩm có chất lượng cao, khai thác tối đa tiềm năng sinh sản. Theo Hansel (2003) siêu âm hút tế bào trứng và thu được 10,4 tế bào trứng/bò cho tế bào trứng, với 40% phôi dâu và phôi nang thu được sau khi nuôi chín và thụ tinh ống nghiệm thu được 4 phôi/tuần hay có ít nhất 200 phôi/bò/năm. Kết quả này cao hơn nhiều khi thu phôi in vivo bằng phương pháp gây rụng trứng nhiều 5,9 phôi/lần hay 35 phôi/bò/năm (Thibier, 2001). Siêu âm hút tế bào trứng chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố trong đó tuổi bò cho tế bào trứng đóng vai trò hết sức quan trọng, liên quan mật thiết đến sinh lý sinh sản cũng như khả năng cho tế bào trứng. Nhằm xác định được mức độ ảnh hưởng của tuổi bò đến số lượng và chất lượng tế bào trứng thu được. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu 4 bò sữa HF thuần, có độ tuổi từ 3 (n=2) tuổi và từ 6 tuổi (n=2), có năng suất sữa ≥ 5000 lít sữa/chu kỳ. Được nuôi dưỡng và chăm sóc trong cùng một điều kiện chăn nuôi, cho ăn 50 kg cỏ tươi và 4 kg thức ăn tinh mỗi ngày. PHAN LÊ SƠN – Ảnh hưởng của tuổi bò 49 Nội dung nghiên cứu Xác định ảnh hưởng của tuổi bò lên số lượng nang trứng. Xác định ảnh hưởng của tuổi bò lên số lượng tế bào trứng thu được. Xác định ảnh hưởng của tuổi bò lên chất lượng tế bào trứng thu được Phương pháp nghiên cứu Chuẩn bị bò: Sau khi lắp đặt xong hệ thống máy siêu âm và nhiệt độ của môi trường hút tế bào trứng (trong bình ổn nhiệt) được làm ấm lên 37 o C. Bò cho tế bào trứng được cố định, gây tê cục bộ bằng cách tiêm 4 - 6 ml lidocain 2% vào khấu đuôi, lấy hết phân, rửa sạch và sát khuẩn khu âm đạo và khu vực xung quanh bằng cồn 70 o . Xác định số lượng và kích thước nang trứng Cho đầu giò siêu âm vào trực tràng, cố định buồng trứng, đưa buồng trứng về phía mặt quét của đầu giò siêu âm. Nhẹ nhàng xoay, đếm và đo kích thước nang trứng có mặt trên buồng trứng qua màn hình của máy siêu âm. Quá trình đo, đếm cần thực hiện tỉ mỉ, chính xác và ghi chép cẩn thận. Hút tế bào trứng Siêu âm hút tế bào trứng được thực hiện sử dụng kim 18 G dài 55 cm, áp suất 120 mmHg và tần suất 2 lần/tuần. Môi trường hút tế bào trứng (mDPBS của Sigma) có bổ sung 2% heparin và 5% huyết thanh bê và kháng sinh (100.000iu penicilin/ml + 100l streptomycin/ml) duy trì ở nhiệt độ 37 o C bằng máy ổn nhiệt. Nhẹ nhàng cho đầu dò siêu âm có gắn hệ thống dẫn kim vào âm đạo, cho tay qua trực tràng cố định buồng trứng, đưa các nang trứng về vị trí mũi kim, quan sát các nang trứng trên màn hình máy siêu âm và chọc hút dịch nang trứng. Trong quá trình hút hệ thống kim và ống dẫn luôn luôn chứa đầy môi trường hút tế bào trứng. Sau khi chọc hút 2 - 4 nang trứng, rút kim ra, hút dung dịch thu tế bào trứng để tế bào trứng chảy vào ống falcon (giữ ấm trong bình ổn nhiêt 37 o C), tiến hành hút lặp lại đến khi không còn nhìn thấy nang trứng nào trên buồng trứng thì chuyển qua buồng trứng đối diện. Lọc, soi tìm tế bào trứng Sau khi hút xong một buồng trứng, đưa ngay về phòng thí nghiệm, lọc bằng cốc lọc Emcon có đường kính lỗ lọc 20m, khoảng 10ml dung dịch còn lại được chuyển vào đĩa petri vô trùng có đường kính 90mm để soi tìm, đánh giá, phân loại tế bào trứng dưới kính hiển vi soi nổi. Đánh giá chất lượng tế bào trứng Tế bào trứng thu được được đánh giá phân loại theo phương pháp của Goodhand và cs. (1999). Dựa vào hình dạng, sự đồng nhất của tế bào chất và đặc biệt là màng cumulus. Loại A có ≥ 4 lớp màng cumulus, phân bố rõ ràng, liên kết chặt chẽ và tế bào chất đồng nhất. Loại B có ≥ 1 lớp màng tế bào cumulus, liên kết chặt chẽ và tế bào chất đồng nhất. Loại C một số phần vỏ ngoài tế bào trứng bị lột trần, tế bào chất co lại không đều. Loại D tế bào trứng hoàn toàn bị lột trần và tế bào chất co lại không đều. Xử lý số liệu Số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học có sử dụng phần mềm Excel . VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 21-Tháng 12-2009 50 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng của tuổi bò lên số lượng nang trứng Nang trứng có mặt trên buồng trứng 114 lượt buồng trứng được siêu âm ở 2 nhóm bò thí nghiệm với 1137 nang trứng có mặt trên buồng trứng. Trong đó nang trứng có kích thước 2 – 8 mm và ≥ 9mm của bò 3 tuổi tương ứng 482 và 77 nang trứng, bình quân nang trứng/buồng trứng tương ứng 8,93 và 1,43 nang. Ở nhóm bò 6 tuổi nang trứng có kích thước 2 – 8 mm và ≥ 9m tương ứng 466 và 112 nang, nang trứng/buồng trứng tương ứng 7,77 và 1,87 nang. Bảng 1. Số lượng nang trứng/buồng trứng và số lượng nang trứng có kích thước 2 – 8 mm, ≥ 9 mm/buồng trứng của 2 nhóm bò. Nang trứng 2 – 8mm Nang trứng ≥ 9 mm Tuổi bò cho tế bào trứng Nang trứng/buồng trứng n. Nangtrứng /buồng trứng n Nang trứng /buồng trứng Mean ± SE Mean ± SE Mean ± SE 3 tuổi 10,35 ± 0,22 a 482 8,93 ± 0,16 a 77 1,43 ± 0,11 a 6 tuổi 9,63 ± 0,29 b 466 7,77 ± 0,22 b 112 1,87 ± 0,17 b Chung 9,99 ± 0,36 948 8,31 ± 0,15 189 1,66 ± 0,10 Các chữ cái a, b trong cùng cột có giá trị sai khác (p<0,05) Bảng 1 cho thấy, bò 3 tuổi có số lượng nang trứng/buồng trứng ở kích thước 2 – 8 mm cao hơn nhóm bò 6 tuổi. Song ở nang trứng có kích thước ≥ 9mm nhóm bò 6 tuổi có phần cao hơn. Số nang trứng bình quân thu được của chúng tôi không sai khác nhiều so với số nang trứng trung bình/buồng trứng của Rizos và cs. (2005) ở bò hậu bị và bò cái sinh sản tương ứng 10,4 và 7,8 nang trứng/buồng trứng. Song lại cao hơn Ramos và cs. (2009) khi tiến hành siêu âm hút tế bào trứng 2 lần/tuần và 1 lần/tuần sử dụng hormon để kích thích thu được tương ứng 7,05, 7,95 và 8,75 nang trứng/buồng trứng. Nang trứng được hút Bảng 2. Tổng số nang trứng được chọc hút, nang trứng đư ợc chọc hút/buồng trứng ở 2 nhóm bò. Tuổi bò cho tế bào trứng Tổng số nang (2 - > 9 mm) Nang trứng được hút Nang trứng được hút/buồng trứng Tỉ lệ hút (Mean ± SE) 3 559 454 8,41 ± 0,22 a 81,21 6 578 472 8,00 ± 0,24 b 81,66 Chung 1137 926 8,20 ± 1,64 81,43 Các chữ cái a, b trong cùng cột có giá trị sai khác (p <0,05) Bảng 2 cho thấy, tổng số nang trứng được chọc hút là 926 nang/ tổng số 1137 nang quan sát được chiếm tỉ lệ 81,43 %. Số lượng nang trứng được chọc hút/buồng trứng ở cả 2 nhóm bò là 8,20 nang. Không có sự khác nhau của 2 nhóm bò về tỉ lệ nang trứng được chọc hút/nang trứng quan sát được ở nhóm bò 3 tuổi và 6 tuổi, tương ứng 81,2 và 81,66 %. Số lượng nang trứng được chọc hút/buồng trứng của chúng tôi cao hơn so với kết quả của Manik và cs. (2003) đã nghiên cứu siêu âm hút tế bào trứng ở bò Ấn có số lượng nang trứng được chọc hút/buồng trứng 4,25 nang trứng. Goodhand và cs, (2000) chọc hút được 6,65 nang trứng/buồng trứng. PHAN LÊ SƠN – Ảnh hưởng của tuổi bò 51 Ảnh hưởng của tuổi bò lên số lượng tế bào trứng thu được Sau 114 lượt buồng trứng được siêu âm hút tế bào trứng có 796 tế bào trứng được thu, bình quân tế bào trứng/buồng trứng 6,98 tế bào trứng. Tỉ lệ thu được chiếm 85,95 %/ tổng số nang trứng được chọc hút. Có sự khác nhau về tế bào trứng/ buồng trứng thu được giữa 2 nhóm bò, ở nhóm bò 3 tuổi thu được 7,20 tế bào cao hơn nhóm bò 6 tuổi 6,78 tế bào. Không có sự khác nhau về tỉ lệ tế bào trứng thu được/nang trứng được chọc hút giữa hai nhóm bò. Bảng 3. Tổng số tế bào trứng thu được, tế bào trứng/buồng trứng Tuổi bò cho tế bào trứng Buồng trứng được hút Tế bào trứng thu được Tế bào trứng/buồng trứng Tế bào trứng thu được/nang trứng được hút (%) (Mean ± SE) 3 54 389 7,20 ± 0,23 a 85,68 6 60 407 6,78 ± 0,13 b 86,22 Chung 114 796 6,98 ± 0,13 85,95 Các chữ cái a, b trong cùng cột có giá trị sai khác (p <0,05) Nghiên cứu để nâng cao số lượng tế bào trứng được rất nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu để thu được tối đa tế bào trứng có chất lượng. Manik và cs, (2003) thu được 4,5 tế bào/buồng trứng. De Roover và cs, (2005) thu đuợc bình quân 5,6 tế bào trứng/buồng trứng khi tiến hành siêu âm hút tế bào trứng từ bò sống. Kết quả của chúng tôi cũng phù hợp với Viana và cs, (2004) đã thu được bình quân số tế bào trứng 7,0 tế bào trứng, Ramos và cs, (2009) thu được 7,05 tế bào trứng/buồng trứng. Ảnh hưởng của tuổi bò lên chất lượng tế bào trứng thu được Chất lượng tế bào ảnh hưởng rất lớn đến khả năng phát triển sau khi nuôi chín, thụ tinh, phân chia và phát triển đến giai đoạn phôi dâu và phôi nang. Sau khi chọc hút xong, dịch hút nang trứng tế bào trứng được đưa ngay về phòng thí nghiệm để lọc, soi tìm và đánh giá chất lượng theo 4 mức độ khác nhau (A, B, C và D). Chỉ có tế bào trứng loại A và B mới đủ tiêu chuẩn nuôi cấy, thụ tinh và tạo phôi. Bảng 4. Tế bào trứng loại A, B, C và D của 2 nhóm bò Tế bào trứng loại A, B Tế bào trứng loại C, D Tuổi bò cho tế bào trứng N Tế bào/buồng trứng n Tế bào/buồng trứng 3 291 5,39 98 1,81 6 307 5,12 100 1,67 Chung 598 5,25 198 1,74 Bảng 4 cho thấy, tổng số tế bào trứng loại A, B là 598 tế bào. Tế bào trứng bình quân thu được/buồng trứng của nhóm bò 3 tuổi 5,39 tế bào, cao hơn nhóm bò 6 tuổi 5,12 tế bào. Tế bào trứng loại C, D không có sự khác nhau nhiều, tương ứng 1,81 và 1,67 tế bào. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Tuổi bò có ảnh hưởng đến số lượng và chất lượng tế bào trứng thu được. Nhóm bò cho tế bào trứng có độ tuổi 3 tuổi cho số lượng và chất lượng tế bào trứng tốt hơn nhóm bò 6 tuổi. VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 21-Tháng 12-2009 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO De Roover, R., Genicot, G., Leonard, S., Bols, P and Dessy, F (2005). Ovum pick up and in vitro embryo production in cows superstimulated with an individually adapted superstimulation protocol. Animal .Reproduction Science. 2005; 86: p.13-25. Dimitrios Rizos, Lisa Burke, Patrick Duffy, Mary Wade, John F. Mee, Kevin J.O’Farrell, Mairtin MacSiurtain, Maurice P. Boland and Patrick Lonergan, (2005). Comparisons between nulliparous heifers and cows as oocyte doners for embryo production in vitro. Theriogenology 2005; 63: p.939-949. Hasler J.F., Hasler W.B. Henderson, P.J. Hurtgen, Z.Q. Jin, A.D. McCauley, S.A Mower, B. Neely, L.S. Shuey, J.E. Stockes and S.A. Trimmer, (1995) Production, freezing and transfer of bovine IVF embryos and Halsel, B.M. Magunath, J.P. Ravinada, P.S.P. Gupta, M. Devaraj and S.Nandi(2003). Effect of breeding season on in vivo oocyte recovery and embryo production in non – descriptive indian river buffaloes. Animal Reproduction Science 2: 376-383. K.L. Goodhand, M.E. Staines, J.S.M. Hutchinson and P.J. Broadbent, (2000). In vivo oocyte recovery and in vitro embryo production from bovine oocyte doner treated with progestagen, oestradiol. Animal reproduction 2000; 63; p.145-185 K.L. Goodhand, M.E. Staines, J.S.M. Hutchinson and P.J. Broadbent (1999). In vivo oocyte recovery and in vitro embryo production from doner aspirated at different frequencies or following FSH treatment. Theriogenology 1999; 51, p. 951-961 Manik, F.li, X.chen, W. pi, C. Lin and Z. Shi (2003). Collection oocytes through transvaginal Ovum pick-up for invitro embryo production in Nanyang yellow cattle. Reproduction in Domestic Animal 42: 666-670 Ramos, R. Rupt, J.U. Camara, M. R. Mollo, I . Pivato, A. P. Marques and Satori. Effect of follicular wave sunchronzation on invitro embryo production in heifers. Animal Reproduction Science 3: 201-207. Rizos, D., Burke, L., Duffy, P., Wade, M., Mee, J.F., O'Farrell, K.J., MarSiurtain, M., Boland, M.P and Lonergan, P, (2005). Comparisons between nulliparous heifers and cows as oocyte donors for embryo production in vitrro. Theriogenology 2005; 63: p.939-949. Thibier.M, (2001). A constrated year for the world activity of the animal embryo transfer industry. Newslett. 20, p.13-19. Viana, JHM. Camargo, LSA and Ferreira, A.M, (2004). Short intervals between ultrasonographically guided follicle aspiration improve oocyte quality but do not prevent establishment of dominant follicle in the Gir breed of cattle. Animal Reproduction Science 84: p.1-12 *Người phản biện: TS. Phan Văn Kiểm; TS. Đào Đức Thà . và 1,67 tế bào. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Tuổi bò có ảnh hưởng đến số lượng và chất lượng tế bào trứng thu được. Nhóm bò cho tế bào trứng có độ tuổi 3 tuổi cho số lượng và chất lượng tế bào trứng. trứng/ buồng trứng. PHAN LÊ SƠN – Ảnh hưởng của tuổi bò 51 Ảnh hưởng của tuổi bò lên số lượng tế bào trứng thu được Sau 114 lượt buồng trứng được siêu âm hút tế bào trứng có 796 tế bào trứng. – Ảnh hưởng của tuổi bò 49 Nội dung nghiên cứu Xác định ảnh hưởng của tuổi bò lên số lượng nang trứng. Xác định ảnh hưởng của tuổi bò lên số lượng tế bào trứng thu được. Xác định ảnh