TIẾP CẬN VẤN ĐỀ PHÁT HIỆN TỒN DƯ KHÁNG SINH TRONG CÁC THỰC PHẨM CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT (Phần 1) PHẠM KIM ĐĂNG Khoa Chăn nuôi Nuôi trồng thuỷ sản Đại học Nông nghiệp Hà Nội THỰC PHẨM CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT Kháng sinh chăn nuôi thâm canh Chăn nuôi thâm canh Mật độ cao Tổn thương, nhiễm tiểu khí hậu chuồng ni, vệ sinh Tăng tỷ lệ chết, non thường yếu ớt, đề kháng kém, Chậm sinh trưởng Sản lượng giảm hay giảm suất chăn nuôi Tổn thất kinh tế quan trọng Các nhóm kháng sinh sử dụng trog chăn ni § § § § § § § § § § § § β-lactam(penicilline, cephalosporine) Tetracyclines (oxy- chlortetracycline, …) Aminoglycosides (streptomycine, …) Macrolides (Erythromycine, …) Phenicol (chloramphenicol, …) chất ~100 hợp Khác Peptid (avoparcine, …) Ionophores (monensine, …) Sulfonamides (25 loại, sulfaméthazine, …) Trimétroprim Nitrofurannes (furazolidone,…) (Fluo)quinolones Carbadox Công thức khác phức tạp H NH NH H H CH CO HO CH NH N NH OH HO N CH O Benzylpenicilline (penicilline) O O NH H3 C S NH   O OH O CH H N(CH )2 O OH H H3 CHN HO O Tétracycline O CH C OH H O H CH OH H NHCH CHLORAMPHENICOL OH O H3 CO (aminocyclitol) CARBADOX S (C H5 )2 N CH3 H O OH OH H3C O H2 N S O H C2 H N N CH O O CH CH CH CH OH O Erythromycine(macrolide) H 3C HO CH CH H3 C OCH3 O CH3 N(CH )2 O HO O HO TIAMULIN CH N Sulphadimidine ou sulfamethazine (sulphonamide) H3 C CH HO NH Trimethoprim O H3C H2C H3C CH3 O O O O N O N N NH N H N N OCH3 H3 CO O O Spectinomycine COOH NHCOCHCl C Streptomycine (aminoglycoside) NH OH N O OXOLINIC ACID OH O OH OH CH OH OH OH CH2 OH C2 H O2 N H CH O COOH Cephalexine (cephalosporine) HO CH H FURAZOLIDONE NHCH N O O NH O OH N NH2 NH H H CH CO C C CHO COOH O O O2 N CH O H3 C O H CH3 CH COOH O H H3 C CH2 H3 C H O CH3 O H H O CH 2OH OH MONENSIN Công thức khác phức tạp OH H H3CO2S CH2F H NHCOCHCl2 Florfenicol (FF) OH H OH H O2N CH2OH H3CO2S CH2OH H NHCOCHCl2 H NHCOCHCl2 Chloramphenicol (CAP) Thiamphenicol (TAP) OH H H3CO2S CH2F H NH2 Florfenicol amine (FFA) Công thức khác phức tạp FQ lưỡng tính : - Norfloxacine - Ofloxacine - Enoxacine - Marbofloxacine - Enrofloxacine - Ciprofloxacine - Danofloxacine FQ acides: - Cinoxacine - Flumequine - acide Oxolinic - acide Nalidixic Tại lại phải kiểm tra tồn dư kháng sinh thực phẩm có nguồn gốc động vật? p Ảnh hưởng kỹ thuật chế biến, bảo quản sản phẩm: ức chế lên men sản xuất acid p Độc hại n n p Bảo vệ người tiêu dùng Bảo vệ môi trường: kháng thuốc thú y, nhân y Người tiêu dùng: Vấn đề đạo đức Kháng sinh tiềm tàng nguy hiểm độc cấp tính p Kháng sinh cấm (ung thư, quái thai, bất thường … ) p Gây dị ứng p Mất cần hệ vsv đường ruột Rối loạn p Gây kháng thuốc vi khuẩn p Ít - xuất chủng vi khuẩn gây bệnh kháng nhiều loại kháng sinh (multi-resistante) Vơ hiệu hố loại kháng sinh Nguy ô nhiễm môi trường Nguồn gốc tồn dư tồn dư kháng sinh Kháng sinh + lợi nhuận chăn nuôi Sử dụng kháng sinh (lạm dụng, bất hợp pháp) - Điều trị bệnh cá thể Phịng bệnh cho đàn lơ Kích thích sinh trưởng (Feed additives ????) Bảo quản ???? Tồn dư sản phẩm chăn nuôi Ảnh hưởng xấu đến môi trường người tiêu dùng c) Cho kháng thể đặc hiệu thỏ vào ủ 2h 4°C Specific Ab E E E E E E E E E E E E Rửa loại bỏ chất không gắn (ba lần) Cho dung dịch phản ứng màu vào TMB/H2O2 ủ 30’ bóng tối Substate /chromophore E E E E E E E E Dừng phản ứng H2SO4 Đọc 450 nm Chuẩn bị hoá chất PBS pH 7.4 : 9g NaCl + 7,78g Na2HPO4.2H2O+ 0,75 g KH2PO4 lít H2O Methanol/PBS (50/50 V/V) Pha lỗng dung dịch đệm 10x Pha lỗng KN gắn enzyme 100x Khơi phục KT đơng khơ (+ ml dung dịch pha lỗng) ! Lượng hố chất chuẩn bị số mẫu phân tích + đường chuẩn QUI TRÌNH TÁCH CHIẾT MẪU 30’’ 10’, 4000rpm lắc đảo đầu 30’ gam mẫu ml methanol/PBS (50/50 v/v) Ly tâm 10 phút với vận tốc 3000 vịng/phút 0,5 ml 50 µl/giếng 30 giây 4,5 ml d2 đệm pha loãng (pha loãng 10x) (*) PBS pH 7.4 :9 gam NaCl, 7,78 gam Na2HPO4.2H2O 0,75 gam KH2PO4 lít nước cất QUI TRÌNH TEST QUI TRÌNH TEST A NS NS S1 S1 S9 B Chuẩn bị Plate 0 S2 S2 S9 C 05 05 S3 S3 S10 D 0.1 0.1 S4 S4 S10 E 0.2 0.2 S5 S5 S11 F 0.3 0.3 S6 S6 S11 G 0.5 0.5 S7 S7 S12 H 1 S8 S8 S12 Dung dịch chuẩn Mẫu 10 11 12 QUI TRÌNH TEST Bước 50 µl dd ng/ml 50 µl dd 0.5 ng/ml E2 50 µl dd 0.3 ng/ml F1 F2 50 µl dd 0.2 ng/ml G1 G2 50 µl dd 0.1 ng/ml H1 H2 50 µl dd 0.05 ng/ml A3 A4 50 µl mẫu tách chiết B3 B4 50 µl mẫu tách chiết C3 C4 50 µl mẫu tách chiết D3 D4 50 µl mẫu tách chiết E3 E4 50 µl mẫu tách chiết F3 F4 50 µl mẫu tách chiết G3 G4 50 µl mẫu tách chiết H3 H4 50 µl mẫu tách chiết B10 o Lắc nhẹ, đ b ớc sóng 450 vịng 30 phút E1 B9 50 µl dd dừng phản ứng màu/giếng D2 Lắc nhẹ, ủ 30phút bóng tối t° phịng D1 B8 - 150 µl peroxide/TMB/giếng C2 B7 50 µl dd ng/ml C1 B6 dốc bỏ hết, rửa lần = dd đệm, vỗ úp hết B2 B5 ủ 1h 4°C B1 B4 100 µl dd E Conjugate/giếng 150 µl dd đệm p.lỗng B3 Lắc nhẹ phút ủ 1h 4°C A2 100 µl dd KT/giếng A1 B2 Tính kết 2,000 y = -1,0115x - 1,2697 R2 = 0,9915 logit ((B-NS)/(B0-NS)) 1,500 1,000 0,500 0,000 -3,500 T -3,000 -2,500 -2,000 -1,500 -1,000 -0,500 0,000 0,500 -0,500 -1,000 -1,500 ln (concentration) Đồ thị Đường chuẩn - B, B0 tương ứng mật độ quang dung dịch chuẩn nồng độ khác nồng độ - NS mật độ quang dung dịch khơng đặc hiệu QUI TRÌNH TEST Mật độ quang (OD) Dung dịch chuẩn NSB* 0,07 C0 1,226 C1 0,307 C2 0,5 0,485 C3 0,3 0,642 C4 0,2 0,801 C5 0,1 0,923 C6 0,05 1,043 Mẫu 1: OD = 0,121 Mẫu 2: OD = 0,095 Mẫu 3: OD = 0,45 Hãy tính Nồng độ thực ?? Và đưa kết luận?? NGUYÊN LÝ CỦA KÍT Tetra sensor RECEPTOR ASSAY Assay for tetracycline residues: The Milk Protocol CÁC DẠNG KÍT VÀ KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN CÁC DẠNG KÍT VÀ KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN SỮA MƠ ĐÔNG VẬT Kidney, Liver, Muscle Pig, Chicken, Beef, Seafood, Fish, Eggs MẬT ONG QUI TRÌNH TEST QUI TRÌNH TEST ĐỌC VÀ GIẢI THÍCH KẾT QUẢ ... bệnh kháng nhiều loại kháng sinh (multi-resistante) Vơ hiệu hố loại kháng sinh Nguy ô nhiễm môi trường Nguồn gốc tồn dư tồn dư kháng sinh Kháng sinh + lợi nhuận chăn nuôi Sử dụng kháng sinh (lạm... tra tồn dư kháng sinh thực phẩm có nguồn gốc động vật? p Ảnh hưởng kỹ thuật chế biến, bảo quản sản phẩm: ức chế lên men sản xuất acid p Độc hại n n p Bảo vệ người tiêu dùng Bảo vệ môi trường: kháng. .. sản Hệ thống Lab ??????? Kiểm sốt kháng sinh Khó khăn: chất cần tìm khơng biết trước Liệu có Kháng sinh thực phẩm khơng? Cách tiếp cận theo phân tích Cách tiếp cận theo lý thuyết th ể ! g ôn kh