Đang tải... (xem toàn văn)
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌCBỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Trang 21.1 Nguyên tắc
- Amylase la enzyme thủy phân tinh bột thành các loại dextrin, maltose, glucose.
- Phương pháp Wohlgemuth xác định hoạt tính enzyme amylase dựa vào việc tìm nồng độenzyme nhỏ nhất để thủy phân một lượng tinh bột xác định với những điều kiện xác địnhđến các sản phẩm không đổi màu dung dịch I2 0,3% / KI 3%
- Đơn vị đo hoạt độ Wohlgemuth là lượng enzyme cần thiết để thủy phân 1mg tinh bộtsau 30 phút ở 370C có C l−¿ ¿
α dextrin + Maltose + GlucoseE α amylase (Termamyl)
Tinh bột
(ⅇndondo; lk 1,4; bất kì)
3-5 glucose
Trang 31.4 Các bước tiến hành
Bước 1: Chuẩn bị dịch chiết enzyme amylase
1 Cân chính xác 10g malt hạt bằng cân 2 số lẻ, nghiền nhỏ bằng cối sau đó đem chuyểnvào bình định mức 100ml, định mức đến 100ml lắc hật kỹ.
2 Ngâm malt trong 60 phút, thỉnh thoảng lắc đều dịch trong bình định mức
3 Lọc dịch qua 2 lớp giấy lọc mịn thu được dung dịch trong suốt chứa enzyme amylase(nên hồi lưu khoản 5-10ml dịch lọc ban đầu, đến khi thu được dịch trong
Hình 1: Malt hạt sau khi được ngâm 60 phút và chiết
Bước 2: Khảo sát hoạt tính enzyme amylase
1 Lấy 10 ống nghiệm ϕ 18 đánh số thứ tự từ 1 đến 102 Hút vào mỗi ống nghiệm 1ml dung NaCl 0,5%
Trang 43 Cho vào ống nghiệm (1) 1ml dịch chiết enzyme amylase từ malt và lắc kĩ Sau đó lấy1ml từ ống nghiệm (1) cho vào ống nghiệm (2) và lắc kỹ Lập lại tương tự cho các ốngtiếp theo cho đến ống thứ (10) thì hút 1ml và bỏ đi.
Lưu ý: Pipep 1ml sau mỗi lần hút phải đảm bảo khô và sạch để tránh dẫn đến kết quả có
sai số lớn và kết quả sai
4 Cho tiếp vào mỗi ống nghiệm 1ml dung dịc tinh bột 0,5%, lắc đều, để vào tủ điều nhiệtở 37°C, thỉnh thoảng lại lắc đều để lôi kéo các hạt tinh bột bám ở thành ống nghiệmxuống Sau 30 phút lấy ra, thêm vào mỗi ống nghiệm 1ml H2SO4 10% (chấm dứt hoạt tínhenzyme) và 2 giọt thuốc thử Liugol, rồi lắc đều và quan sát sự thay đổi màu ở các ốngnghiệm.
1.5 Kết quả thí nghiệm
Hình 2: Kết quả thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme amylase
- Dựa trên kết quả thí nghiệm ta thấy: 5 ống nghiệm đầu thủy phân hoàn toàn, ống (6)thủy phân 1 nửa và ống (7) thủy phân một ít nên ta thấy màu nâu đậm, 3 ống còn lại tathấy hầu như không thủy phân
- Khi dịch chiết enzyme được pha loãng theo cấp số nhân (qua 10 ống nghiệm) thì ta thấyđến ống số (6) và ống (7) có màu cam và nâu là vì nồng độ enzyme còn lại ít không đủ đểthủy phân hoàn toàn tinh bột nên hai màu khác với 5 ống đầu Còn 3 ống cuối có màuxanh vì lượng enzyme không còn nên không thể thủy phân tinh bột
Trang 5STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Nồng độ enzyme n/2 n/4 n/8 n/16
n/64 n/128
Bảng 1: Kết quả thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme amylase
- Tính kết quả:
Lượng enzyme cho vào ống nghiệm (1): n = mV 1V 2 = 101004×1 = 100
Trong đó: V1 – thế tích dịch chiết enzyme amylase cho vào ống nghiệm (1), ml V2 – thể tích dịch chiết enzyme amylase, ml
m - Khối lượng malt dùng để trích chiết enzyme amylase, mgMột đơn vị Wohlgemuth: W = 5 Fn = 5× 32100 = 0,625
Trong đó F – độ pha loãng chọn được từ bàng trên
Số đơn vị Wohlgemuth có trong 1 ml dịch chiết enzyme: Nw = V 1 Wn = 1× 0,625100 = 160
Trang 6phân tinh bột đã hồ hóa trong thức ăn, và các amylase còn lại sẽ kết thúc quá trình thủyphân tạo glucose thấm qua thành ruột.
- Mục đích của thí nghiệm là kiểm tra ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ, nồng độ pH đếnkhả năng thủy phân của enzyme amylase
2.2 Dụng cụ - thiết bị
- Ống nghiệm ϕ 18, kẹp ống nghiệm- Pipep 1ml, pipep 5ml
- Ống nhỏ giọt- Tủ ấm
- Đĩa thủy tinh
2.3 Hóa chất
- dung dịch tinh bột 1,0%
- dung dịch glucose 0,5%
- thuốc thử Liugol: 0,3% I2 / dd KI 3%- dịch chiết enzyme amylase
- dung dịch đệm pH=3,0 – 4,0 – 5,0 – 6,02.4 Cách tiến hành
1.Tạo ống màu mẫu
Bước 1: Ở ống nghiệm (1) cho 2ml dung dịch tinh bột 1,0% + 3 giọt thuốc thử LiugolBước 2: Ở ống nghiệm (2) cho 2ml dung dịch glucose 0,5% +3 giọt thuốc thử Liugol
Trang 7Hình 3: Ống mẫu
TN2.1 Kiểm tra ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme amylase
Bước 1: Lấy 2 ống nghiệm ϕ 18 và đánh dấu
Bước 2: Hút vào mỗi ống nghiệm theo thứ tự: 5,5 ml dung dịch đệm pH=6,0 + 4 ml dung
dịch tinh bột 0,5% + 0,5 ml dịch chiết enzyme amylase (tổng cộng 10 ml)
Bước 3: Cho 2 ống nghiệm vào môi trường nhiệt độ tương ứng (1)-50℃ và (2)-70℃
Bước 4: Kiểm tra kết quả: sau 15 phút phản ứng, lấy từ mỗi ống nghiệm 1 giọt mẫu, nhỏ
phân biệt trên đia thủy tinh, thêm một giọt thuốc thử Liugol và xem màu
- Xác định thời gian thủy phân: Lấy mẫu định kỳ sau mỗi 3 phút, lấy từ mỗi ống nghiệmmột giọt mẫu, nhỏ phân biệt trên đĩa thủy tinh, thêm 1 giọt thuốc thử Liugol và xem màu.Tiếp tục cho đến khi màu giọt mẫu giống ống màu mẫu số 2
TN2.2 Kiểm tra ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme amylase
Bước 1: Lấy 4 ống nghiệm ϕ 18 và đánh dấu từ 1 - 4
Trang 8Bước 2: Hút vào mỗi ống nghiệm theo thứ tự: 5,5 ml dung dịch đệm + 4 ml dung dịch
tinh bột 0,5% + 0,5 ml dịch chiết enzyme amylase (pH thí nghiệm: 3,0 – 4,0 -5,0 – 6,0)
Bước 3: Kiểm tra kết quả: sau 15 phút phản ứng, lấy từ mỗi ống nghiệm 1 giọt mẫu, nhỏ
phân biệt trên đia thủy tinh, thêm một giọt thuốc thử Liugol và xem màu
- Xác định thời gian thủy phân: Lấy mẫu định kỳ sau mỗi 3 phút, lấy từ mỗi ống nghiệmmột giọt mẫu, nhỏ phân biệt trên đĩa thủy tinh, thêm 1 giọt thuốc thử Liugol và xem màu.Tiếp tục cho đến khi màu giọt mẫu giống ống màu mẫu số 2
2.5 Kết quả thí nghiệm
Hình 4: Kết quả TN2.1
Trang 9Hình 5: Kết quả TN2.2
Ở thí nghiệm này cả 4 ống nghiệm với pH thí nghiệm lần lượt là 3,0 – 4,0 -5,0 – 6,0 sau 3phút khi nhỏ dung dịch Liugol vào đều không xuất hiện màu tím mà chỉ có vàng nhạt củaLiugol, điều này chứng minh enzyme amylase đã thủy phân hoàn toàn tinh bột
Tuy nhiên về mặt lý thuyết thì enzyme amylse hoạt động tối ưu trong vùng pH 5,8 – 6,5nhưng kết quả mà nhóm có được với thời gian nhanh nhất mà 4 ống nghiệm đều cho rakết quả như nhau có thể là do các thao tác trong phòng thí nghiệm như:
3 Thí nghiệm 3 – Tính đặc hiệu của enzyme3.1 Nguyên tắc
- Tính đặc hiệu của enzyme thể hiện khả năng lựa chọn xúc tác chuyển hóa một hay mộtsố chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định tùy vào cấu tạo của TTHĐ, chẳng hạnở thí nghiệm này enzyme amylase chỉ thủy phân tinh bột, enzyme invertase chỉ thủy phânsaccharose.
- Saccharose không phản ứng với dung dịch thuốc thử Fehling vì trong phân tử không cóchức aldehyde hoặc keton, nhưng phản ứng này có thể xảy ra khi saccharose bị thủy phân
Trang 10- Khi đun đường khử với dung dịch thuốc thử Fehling thì sẽ xuất hiên kết tử đỏ gạchCu2O (vì đưởng khử đã khử Cu (OH )2 có trong dung dịch thuốc thử Fehling tạo thànhCu2O).
3.2 Dụng cụ - thiết bị
- Ống nghiệm - Pipep 10ml- Tủ ấm
- Nồi cách thủy- Bếp điện
3.3 Hóa chất
- Dung dịch enzyme amylase, enzyme invertase
α dextrin + Maltose + GlucoseE α amylase (Termamyl)
Tinh bột
(ⅇndondo; lk 1,4; bất kì)
3-5 glucoseE invertase, t°
Glucose + FructoseSaccharose
Trang 11- Thuốc thử Liugon, hồ tinh bột 1%, saccharose 5%- Thuốc thử Fehling
3.4 Cách tiến hành
Bước 1: Chuẩn bị 4 ống nghiệm, ống (1) và (2) cho 5 ml dung dịch saccharose 5%, ống
(3) và (4) cho 5 ml dung dịch hồ tinh bột 1%
Bước 2: Thêm tiếp vào ống (1) và (3) mỗi ống 1 ml dung dịch enzyme invertase, ống (2)
và (4) mỗi ống 1ml dung dịch enzyme amylase, lắc đều và để vào tủ ấm ở 37℃ trong 15phút.
Bước 3: Lấy ống nghiệm ra khỏi tủ, cho vào ống (1) và ống (2) mỗi ống 5 ml dung dịch
Fehling và đặt vào bể điều nhiệt đang sôi trong 2 phút thì lấy ống nghiệm ra, làm nguộitới nhiệt độ phòng Cho vào ống (3) và (4) mỗi ống 2 giọt tuốc thử Liugon.
Hình 5: Qúa trình phản ứng với thuốc thử Fehling
3.5 Kết quả thí nghiệm
Trang 12Hình 6: Kết quả thí nghiệm tính đặc hiệu của enzyme
-Theo kết quả thí nghiệm: ống (1) xuất hiện kết tủa nâu đỏ Cu2O, ống (2) dưới đáy ốngnghiệm có xuất hiện 1 ít kết tủa nâu đỏ, ống (3) có màu tím và ống (4) dung dịch trongsuốt ánh vàng (vì dung dịchh thuốc thử lugol đã pha loãng 10 lần để tránh màu quá đậm).
Biện luận:
- Ở ống nghiệm (1) xuất hiện kết tủa nâu đỏ vì enzyme invertase đã xúc tác cho phản ứngthủy phân saccharose tạo thành glucose và fructose (chứa nhóm aldehyde và keton) Khiđun đường khử với dung dịch thuốc thử Fehling thì sẽ xuất hiên kết tử đỏ gạch Cu2O - Riêng ở ống nghiệm (2), về mặt lý thuyết amylase không xúc tác cho phản ứng thủyphân saccharose cho nên không có sự xuất hiện của nhóm OH glucoside tự do nên khôngcó tính khử dẫn đến không tạo kết tủa Tuy nhiên, ta lại thấy có 1 ít kết tủa ở đáy ốngnghiệm điều này có thể là do hóa chất không tinh khiết hoặc nhiệt độ quá cao dẫn đếnviệc thủy phân một phần saccharose tạo thành glucose và fructose
- Ở ống nghiệm (3) có màu tím là vì enzyme invertase không có khả năng xúc tác chophản ứng thủy phân tinh bột, khi này nhỏ dung dịch liugol vào thì xuất hiện màu tím Ởống nghiệm (4) thì ta lại thấy dung dịch trong suốt ánh vàng là vì enzyme amylase xúc tác
Trang 13cho phản ứng thủy phân tinh bột, khi này tinh bột đã được thủy phân hoàn toàn vì vậy khinhỏ dung dịch Liugol vào không thấy màu xanh xuất hiện