quá trình cố định carbon được thúc đẩy bởi phân tử hydro dẫn đến sự phát triển tăng cường hóa vô cơ tự dưỡng của helicobacter pylori

HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Quá trình cố định carbon được thúc đẩy bởi phân tử hydro dẫn đến sự phát triển tăng cường hóa vô cơ tự dưỡng của Helicobacter pyloriBài báo t

GVHD: GS.TS Trần Linh Thước

Tổ 5:

Phạm Thị Thanh Tình 22C64014Lê Võ Bảo Trân 22C64015 Nguyễn Quốc Vủ 22C64016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Quá trình cố định carbon được thúc đẩy bởi phân tử hydro dẫn đến sự phát triển tăng cường hóa vô cơ tự

dưỡng của Helicobacter pylori

Bài báo tham khảo: Carbon fixation driven by molecular hydrogen results in

chemolithoautotrophically enhanced growth of Helicobacter pylori

1

• Tác nhân gây loét dạ dày và viêm dạ dày mãn tính • Nguồn: Acid hữu cơ nhỏ, amino acid, peptide.

Trong nghiên cứu này, chỉ ra việc bổ sung H2tăng nồng độ enzyme ACC.

Helicobacter pylori

3

Nguyên liệu – Phương pháp

Chủng và điều kiện tăng trưởng.

Nuôi cấy tế bào và phân đoạn dưới tế bào Phân cắt bằng tryptic trong gel.

Phân tích LC-MS/MS.

Phân tích hấp thu [14C] bicarbonate toàn tế bào.Phân tích hoạt tính acetyl-CoA carboxylase.

4

Chủng và điều kiện tăng trưởng

H.Pylori:

WT 26695ATCC 43504

26695 ∆ℎ𝑦𝑑ABCDE

Môi trường BHI có 0.4% β-

cyclodextrin- 1 µM NiCl2

Chọn lọc trên môi trường

Tạo huyền phù trong môi trường

BHI-βc-NiỦ 370C, lắc 200 v/p

ĐK: 10% O2, 5% CO2, N2 cân bằngTăng

sinh trên LK1

Thu tế bào+ 10ml khuẩn

vào bình 165 ml

5

Chủng và điều kiện tăng trưởng

6

Nuôi cấy tế bào và phân đoạn dưới tế bào

H.Pylori

WT 26695

Nuôi cấy BA ở 37°C/36h

ĐK: vi hiếu khí không

đổi

Rửa bằng đệm phosphate pH

7.5 có PMSF

Huyền phù trong 3 ml PBS + French pressure cell 18.000 lb/in2

Loại vụn vỡ TB

Thu dịch nổi

Ly tâm

Thu dịch nổi, phần tế bào màng được huyền phù lại PBS

WT-Ly tâm

Ly tâm

7

Alkyl hóa

55 mM iodoacetamideKhử 10 mM DTT

50 mM

NH4HCO3-50% acetonitrile

(ACN)Khử màu

Dịch phân cắt được sấy chân không + bảo quản ở -20°C chờ phân tích khối

Tạo huyền phù/2% 0,1% FA

ACN-Agilent 1100 capillary liquid chromatograph (LC)

LTQ linear ion trap mass spectrometer

Phổ khối MS/MS thô  mzXML  Mascot (MGF)

thông qua Proteomic

Phân tích hấp thu [14C] bicarbonate toàn tế bào

Nuôi trong 7h

- Sục khí N2.- Thêm vào: 5mM NaHCO3,

1,3 Ci NaH14CO3

Ủ thêm 12h

(37oC + 200 v/p)

- Lấy 1 ml dịch nuôi, cho vào mỗi:3 lọ chứa chất

nhấp nháy

(0,3 ml TCA 60%)

Lắc + tủ hút 48h

- Mẫu trắng => bỏ.

- Mẫu chứa tế bào.

Lặp lại 3 lần

- Mật độ tế bào

Phân tích hoạt tính acetyl-CoA carboxylase

Xác định bằng cách sử dụng enyme kết hợp với pyruvate kinase và lactase dehydrogenase.

0,5 ml hỗn hợp:

+ 10 U pyruvate kinase

+ 9,3 U lactate dehydrogenase+ 0,1 mM NADH

+ 1 mM acetyl-CoA + 50 µM ATP

Phản ứngỞ 340nm

bổ sung 3 µl dịch chiết tế bào/nước

Kết quả và thảo luận

2.1 lần

12

Điều kiện Vi hiếu khí (Microaerophilic)

13

14

Acetyl-CoA carboxylase

HYDROGENASE [NiFe]

17

Hấp thụ [C14]bicarbonate

18

Tăng hoạt tính ACC

19

Kết luận

- Tăng biểu hiện của hydroase và tiểu đơn vị ACC biotin carboxylase

- Tăng hoạt tính ACC.

- Chuyển hóa và tăng trưởng tổng thể tốt hơn, thể hiện qua năng suất tăng trưởng cao hơn.

- Các vai trò cụ thể của H pylori liên quan đến động lực proton

20

Thu hoạch

•Biết được cơ chế hoạt động của hydrogenase trong việc liên kết với co-factor là [Ni-Fe].

•Biết được 1 số protein nằm trên màng và protein trong tế bào chất

21

Thank you!

22

Cơ chế Beckman LS6000TA scintillation counter

23