báo cáo thí nghiệm hóa học và hóa sinh thực phẩm bài 6 enzyme

Nguyên tắc- Amylase là enzyme thủy phân tinh bột thành các loại dextrin, maltose, glucose.- Phương pháp Wohlgemuth xác định hoạt tính enzyme amylase dựa vào việc tìm nồng độenzyme nhỏ nh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌCBỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

1.1 Nguyên tắc

- Amylase là enzyme thủy phân tinh bột thành các loại dextrin, maltose, glucose.

- Phương pháp Wohlgemuth xác định hoạt tính enzyme amylase dựa vào việc tìm nồng độenzyme nhỏ nhất để thủy phân một lượng tinh bột xác định với những điều kiện xác địnhđến các sản phẩm không đổi màu dung dịch I2 0,3% / KI 3%.

- Đơn vị đo hoạt độ Wohlgemuth là lượng enzyme cần thiết để thủy phân 1mg tinh bộtsau 30 phút ở 370C có C l−¿ ¿

- Chén cân, muỗng cân, bình định mức 100mL- Phễu lọc, giấy lọc, erlen 100mL

1.4 Các bước tiến hành

Bước 1: Chuẩn bị dịch chiết enzyme amylase

- Cân chính xác 10g malt hạt bằng cân 2 số lẻ, nghiền nhỏ bằng cối sau đó đem chuyểnvào bình định mức 100mL, định mức đến 100mL bằng nước cất và lắc thật kỹ.

- Ngâm malt trong 60 phút, thỉnh thoảng lắc đều dịch trong bình định mức.

- Lọc dịch qua 2 lớp giấy lọc mịn thu được dung dịch trong suốt chứa enzyme amylase(nên bỏ qua khoảng 20 giọt dịch lọc ban đầu đến khi thu được dịch trong).

Hình 1: Malt hạt sau khi được ngâm 60 phút và chiết Bước 2: Tiến hành khảo sát hoạt tính enzyme amylase

- Lấy 10 ống nghiệm ϕ 18 đánh số thứ tự từ 1 đến 10.- Hút vào mỗi ống nghiệm 1mL dung dịch NaCl 0,5%.

- Cho vào ống [1] 1ml dịch chiết enzyme trong bước 1 và lắc kĩ Sau đó lấy 1ml từ ống[1] cho vào ống [2] và lắc kỹ Tiếp tục lấy 1ml từ ống [2] cho vào ống [3] và lắc kỹ lặplại tương tự cho ống [3] đến ống [9] Ở ống [10], sau khi thêm 1ml từ ống [9] thì hút ra1ml bỏ đi

Lưu ý: Pipette 1mL sau mỗi lần hút phải đảm bảo khô và sạch để tránh dẫn đến kết quả có

sai số lớn và kết quả sai.

- Cho tiếp vào mỗi ống nghiệm 1mL dung dịch tinh bột 0,5%, lắc đều, để vào tủ sấy ở 37°

C, thỉnh thoảng lại lắc đều để lôi kéo các hạt tinh bột bám ở thành ống nghiệm xuống Sau

30 phút lấy ra, thêm vào mỗi ống nghiệm 1mL H2SO4 10% (để làm bất hoạt enzyme) và 2giọt thuốc thử Liugon, rồi lắc đều và quan sát sự thay đổi màu ở các ống nghiệm.

Bước 3: Ghi nhận lại kết quả và tiến hành nhận xét, tính toán.

1.5 Kết quả thí nghiệm và giải thích hiện tượng- Kết quả

Hình 2: Kết quả thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme amylase

Nồng độ enzyme n/2 n/4 n/8 n/16 n/32 n/64 n/128 n/256 n/512 n/1024

Bảng 1: Kết quả thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme amylase

- Như vậy, ống (5) (có màu vàng sáng nhạt nhất) là ống có nồng độ enzyme bé nhất vàvừa đủ để thủy phân hoàn toàn lượng tinh bột (F=32).

+ Dựa trên kết quả thí nghiệm ta thấy: 5 ống nghiệm đầu có tinh bột được thủy phân hoàntoàn, ống (6) thủy phân 1 nửa và ống (7) thủy phân một ít nên ta thấy màu nâu đậm, 3 ốngcòn lại hầu như không được thủy phân.

+ Khi dịch chiết enzyme được pha loãng theo cấp số nhân (qua 10 ống nghiệm) thì đếnống số (6) và ống (7) có màu cam và nâu là vì nồng độ enzyme còn lại ít không đủ đểthủy phân hoàn toàn tinh bột nên hai màu khác với 5 ống đầu Còn 3 ống cuối có màuxanh đen vì lượng enzyme hầu như không còn nên không thể thủy phân tinh bột.

- Tính kết quả:

- Nhớ bổ sung giải thích cthuc ở đây (giải thích đại lượng)

+ Lượng enzyme cho vào ống (1) được tính theo công thức:

n=m V1V2

Trong đó: V1 – Thể tích dịch chiết enzyme amylase cho vào ống nghiệm (1), mL V2 – Thể tích dịch chiết enzyme amylase, mL

m −¿ Khối lượng malt dùng để trích chiết enzyme amylase, mg

+ Một đơn vị Wohlgemuth:

W =n

5 F

Trong đó: F – Độ pha loãng chọn từ bảng trên

+ Số đơn vị Wohlgemuth có trong 1 mL dịch chiết enzyme:

Số 5 nghĩa là gì?W là gì? Khái niệm?

- Thay số liệu vào các công thức trên ta được: + Lượng enzyme cho vào ống nghiệm (1):

+ Cường độ màu sắc của dải màu giữa các nhóm có phần khác nhau:

Hình 5 So sánh hai ống (4) và (5) về trường hợp màu khác nhau

+ Sự khác nhau này có thể do: 1mL enzyme cho vào ống (1) được lấy không chính xác, không lắc đều các ống sau khi cho enzyme vào, quá trình lấy 1mL và chuyền sang các ống khác có sự sai lệch, pipette đã dùng không được làm sạch kỹ sau mỗi thao tác, thời điểm cho H2SO4 vào để chấm dứt hoạt tính enzyme có sự sai lệch (khiến lượng tinh bột bịthủy phân khác nhu giữa các nhóm, dẫn đến màu khi cho liugon vào khác nhau),… Ngoài ra, việc pha loãng Liugon để dễ quan sát màu sắc cũng là một nguyên nhân khiến cho dải màu của một số nhóm có phần nhạt màu hơn (hình 3).

Bổ sung ý nghĩa của thí nghiệm (ứng dụng thực tiễn)

2 Thí nghiệm 2 – Ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ và pH đến khả năng thủy phân tinh bột của enzyme amylase

2.1 Nguyên tắc

- Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất protein, vì thế hoạt tính xúc tác của enzymebị giới hạn bởi những điều kiện phản ứng như nhiệt độ, pH nồng độ enzyme.

Ống (5) khác màu (4)

- Amylase là enzyme xúc tác phản ứng thủy phân tinh bột thành các loại dextrin, maltosevà glucose

Trong hệ tiêu hóa, enzyme alpha amylase có trong nước bọt sẽ bắt đầu thủy phân tinh bộtđã hồ hóa trong thức ăn, và các amylase còn lại sẽ kết thúc quá trình thủy phân tạo thànhglucose thấm qua thành ruột.

- Mục đích của thí nghiệm là kiểm tra ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ, nồng độ pH đếnkhả năng thủy phân của enzyme amylase.

2.2 Dụng cụ - thiết bị

- Ống nghiệm ϕ 18, kẹp ống nghiệm- Pipette 1mL, pipette 5mL

- Ống nhỏ giọt- Tủ ấm

- Đĩa thủy tinh

2.3 Hóa chất

- Dung dịch tinh bột 1,0%

- Dung dịch glucose 0,5%

- Thuốc thử Liugon: 0,3% I2 / dd KI 3%- Termamyl

- Dung dịch đệm pH 3.0 – 4.0 – 5.0 – 6.0 – 7.02.4 Cách tiến hành

1.Tạo ống màu mẫu

Đầu tiên cần tạo ống màu mẫu.Lấy 2 ống nghiệm ghi số thứ tự.

Ở ống [1] cho 2mL dung dịch tinh bột 1,0% + 3 giọt thuốc thử LugolỞ ống [2] cho 2mL dung dịch glucose 0,5% +3 giọt thuốc thử Lugol( Có thể pha loãng Liugon để dễ quan sát màu sắc hơn)

Hình 6 Ống mẫu (1) bên trái, ống mẫu (2) bên phải

TN2.4.1 Kiểm tra ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme amylase

Bước 1: Lấy 2 ống nghiệm ϕ 18 và đánh dấu.

Bước 2: Hút vào mỗi ống nghiệm theo thứ tự: 5,5 mL dung dịch đệm pH=6,0 + 4 mL

dung dịch tinh bột 0,5% + 0,5 mL termamyl (tổng cộng 10 mL).

Bước 3: Cho 2 ống nghiệm vào môi trường nhiệt độ tương ứng (1)-50℃ và (2)-70℃.

Bước 4: Kiểm tra kết quả: sau 15 phút phản ứng, lấy từ mỗi ống nghiệm 1 giọt mẫu, nhỏ

phân biệt trên đĩa thủy tinh, thêm một giọt thuốc thử Liugon và xem màu

- Xác định thời gian thủy phân: Lấy mẫu định kỳ sau mỗi 3 phút, lấy từ mỗi ống nghiệmmột giọt mẫu, nhỏ phân biệt trên đĩa thủy tinh, thêm 1 giọt thuốc thử Liugon và xem màu.Tiếp tục cho đến khi màu giọt mẫu giống ống màu mẫu số 2.

TN2.4.2 Kiểm tra ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme amylase

Bước 1: Lấy 4 ống nghiệm ϕ 18 và đánh dấu từ 3-6.

Bước 2: Hút vào mỗi ống nghiệm theo thứ tự: 5,5 mL dung dịch đệm + 4 mL dung dịch

tinh bột 0,5% + 0,5 mL termamyl (pH thí nghiệm: 3,0 – 4,0−¿5,0 – 6,0).

Hình 7 Hai ống màu mẫu

- Kết quả thí nghiệm 2.4.1:

+ Sau 15 phút, nhóm dùng liugol (có pha loãng) nhỏ vào 2 giọt mẫu thì nhận được kếtquả là cả hai giọt đều có màu vàng nhạt giống ống mẫu (2).

- Kết quả thí nghiệm 2.4.2 :

+ Ở thí nghiệm này cả 4 ống nghiệm với pH thí nghiệm lần lượt là 3,0 – 4,0 −¿5,0 – 6,0sau 15 phút (tại thời điểm 0) khi nhỏ dung dịch Liugon vào đều không xuất hiện màu tímmà chỉ có vàng nhạt hoặc gần như trong suốt không màu Trong đó, màu của ống (5) và(6) là khá giống với màu trong ống màu mẫu (2) chứng tỏ chỉ sau 15 phút, tinh bột trong 2ống có pH=5 và 6 đã bị thủy phân hết Sau hai lần thí nghiệm, màu của ống (5) và (6) cósắc độ gần như tương đồng Như vậy, pH tối ưu cho enzyme trong thí nghiệm này có khảnăng rơi vào pH=5 hoặc 6.

Hình 9 Kết quả TN2.4.2 sau hai lần thí nghiệm

Hình 10 Màu của hai giọt mẫu từ ống có pH =5 và 6

pH=6

2.6 Nhận xét và biện luậnHai ống màu mẫu:

- Khi tạo màu ống mẫu, ống mẫu (1) (chứa dung dịch tinh bột 1%) chuyển sang màu xanhtím đặc trưng và ống (2) (chứa dung dịch glucose 0,5%) có màu vàng Giải thích cho hiệntượng này:

+ Ống (1) chứa amylose là mạch không phân nhánh, cuộn xoắn theo kiểu lò xo vàamylopectin có dạng mạch phân nhánh Khi cho thuốc thử Lugol (trong thành phần thuốcthử có chứa Iodine) vào ống nghiệm (1) thì các phân tử amylose có trong thành phần tinhbột sẽ hấp thu và giữ Iodine lại trong lòng xoắn tạo phức hợp Amylose – Iodine, phức hợpnày hấp thụ ánh sáng có bước sóng khác với Iodine có trong thuốc thử Lugol ban đầu Vìthế màu dung dịch ống (1) chuyển sang màu xanh tím.

+ Ống (2) chứa dung dịch glucose 0,5% là monosaccharide, không có cấu trúc mạch vòngnên không thể tạo được phức hợp với Iodine có trong thuốc thử Lugol Chính vì thế, màuở ống nghiệm (2) có màu vàng nhạt và cũng chính là màu của thuốc thử Lugol (có phaloãng).

*) So sánh với kết quả nhóm khác:

- Bên cạnh các nhóm cho ra hai giọt mẫu đều có màu vàng nhạt (sau 15 phút), có nhómthí nghiệm thu được kết quả khả quan hơn, cụ thể như sau:

- Theo kết quả nhóm này nhận được, sau 24 phút màu mẫu thử ống nghiệm (1)- 50oC và sau 27 phút màu mẫu thử ống nghiệm (2)-70oC có màu vàng giống ống mẫu [2] Từ đó, nhóm này đưa ra kết luận rằng nhiệt độ tối ưu của enzyme amylase là 50oC.

*) So sánh với các tài liệu tham khảo khác

- Theo thông tin nhóm tìm hiểu được, nhiệt độ tối ưu cho enzyme α−amylase là 85 – 97oC1 Có thể hoạt động ngay ở 95 – 97oC và duy trì hoạt lực cao ở 100oC.2 Một nguồn tham khảo khác cho rằng: nhiệt tối ưu của α−amylase phụ thuộc vào nguồn gốc enzyme, thường nằm trong khoảng 40 – 500C.3

- Như vậy, dù so sánh với nguồn thông tin nào thì kết quả mà nhóm chúng em nhận đượcđều không chính xác vì thí nghiệm không thành công và không thể đưa ra đáp án cuốicùng được Các lí do cho kết quả thí nghiệm bất lợi có thể là :

+ Khoảng nhiệt độ tối ưu của amylase là khá rộng (10 đến 700C)4, tùy vào nguồn enzyme,có thể khoảng nhiệt độ trong thí nghiệm ( 500C và 700C) là chưa đủ để thể hiện rõ ràng sựkhác biệt.

1 “Enzyme amylase”, https://aquavet.vn/enzyme-amylase.html, truy cập ngày 28/3/2023.

2 “Amylase: Thủy phân tinh bột ngành đường”, tinh-bot-nganh-duong-p761.html, truy cập ngày 28/3/2023.

https://www.mdi.vn/chi-tiet-san-pham/enzyme/amylase:-thuy-phan-3 “Tính chất của enzyme amylase”, https://123docz.net/trich-doan/542098-tinh-chat-cua-enzyme-amylase.htm, truy cập ngày 28/3/2023.

4 “Characterization of an a-Amylase with Broad Temperature Activity from an Acid-Neutralizing Bacillus cereus Strain” (2010), http://www.ijbiotech.com/article_7096.html, truy cập ngày 28/3/2023.

+ Sự sai sót trong các thao tác trung gian như: thời gian để mẫu trong tủ sấy quá lâu (hoặcthời gian khi thực hiện quá lâu) khiến tinh bột bị thủy phân hết và khó quan sát kết quảcho các lần nhỏ định kỳ 3 phút, khi lấy các giọt mẫu bằng pipette nhựa lên đĩa thủy tinhđã không làm sạch pipette,…

*) So sánh với các nhóm thí nghiệm khác

- Khi so sánh với nhóm lấy mẫu termamyl được chuẩn bị sẵn trong phòng thí nghiệm cóthể thấy, màu của 4 giọt mẫu mà các nhóm khác nhận được ngay sau 15 phút là tươngđồng nhau – khác với kết quả mà nhóm em nhận được ( màu của ống có pH=5 và 6 cóphần nổi bật hơn).

- So sánh với nhóm khác làm thí nghiệm với dịch chiết của malt đại mạch:

Theo các thông tin có được từ nhóm thí nghiệm khác, khi sử dụng nguồn enzyme chiết từmalt đại mạch thì ngay 3 phút đầu tiên đã có sự chênh lệch rõ rệch về màu sắc: ống (1) cómàu tím than (2) màu vàng đậm, ống (3) có màu vàng nhạt hơn (tương tự như ống chuẩnsố 2) và ống (4) có màu cam đậm và sau 15 phút thí nghiệm thì màu sắc các ống dầngiống với màu ống chuẩn Từ kết quả như vậy ta có thể kết luận pH tối ưu của enzymetheo nhóm này là ống (3) (có pH=5) Kết quả này tương đồng với kết quả mà nhóm emnhận được, tuy vậy, các giọt mẫu từ 4 ống nghiệm lại không có hiện tượng đổi màu rõ rệtnhư trong hình của nhóm bạn.

*) So sánh với các tài liệu tham khảo khác

- Theo thông tin có được, pH tối ưu của α−amylase phụ thuộc vào nguồn gốc enzyme vàthường nằm trong khoảng axit yếu 4,8-6,9 Cụ thể hơn là khoảng pH: 5,8 – 6,5.5

- Như vậy, sau khi so sánh với các nhóm khác và với tài liệu tham khảo từ internet, kếtquả mà nhóm em nhận được (pH tối ưu là 5 hoặc 6) là khá trùng khớp Tuy vậy, khi pH<4.5 thì amylase có thể bị bất hoạt do môi trường axit, tức là ống (3) và (4) sẽ không thủyphân tinh bột và cho ra màu xanh tím với Lugon, trong khi đó nhóm em lại cho ra ống (3)

5 “Enzyme amylase”, https://aquavet.vn/enzyme-amylase.html, truy cập ngày 28/3/2023.4

31

và (4) là không màu Sự sai khác này có thể là do thao tác trung gian của các nhóm bị saisót: khi lấy pH (hoặc tinh bột, enzyme) cho vào ống nghiệm đã lấy lượng không chínhxác, khi lấy các giọt mẫu ra đĩa bằng pipette nhựa đã không làm sạch kỹ pipette,…

- Ý nghĩa:

+ Enzyme là chất xúc tác sinh học có khả năng thúc đẩy nhanh các phản ứng hóa học vàlà những công cụ sinh học để nâng cao chất lượng thực phẩm, hoạt động chế biến thựcphẩm và nhiều lĩnh vực khác Việc khảo sát và tìm ra khoảng nhiệt độ và pH tối ưu cũngnhư các yếu tố môi trường khác đến ezyme sẽ giúp cho việc ứng dụng enzyme được hiệuquả hơn

+ Trong đó, enzyme amylase được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực đời sống đặc biệt làtrong công nghệ thực phẩm Việc nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hoạtđộng của amylase là vô cùng quan trọng để ứng dụng chúng vào công nghệ quy trình sảnxuất chế biến các sản phẩm thực phẩm (như bánh kẹo, bia, đồ hộp, v.v ).

3 Thí nghiệm 3 – Tính đặc hiệu của enzyme3.1 Nguyên tắc

- Tính đặc hiệu của enzyme thể hiện khả năng lựaxcz chọn xúc tác chuyển hóa một haymột số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định tùy vào cấu tạo của TTHĐ, chẳnghạn ở thí nghiệm này enzyme amylase chỉ thủy phân tinh bột, enzyme invertase chỉ thủyphân saccharose.

Chỗ này bị thiếu cái điều kiện mtr acid (thủy phần saccarose, trừ 0,5d)

3.2 Dụng cụ - thiết bị

- Ống nghiệm - Pipette 10mL- Tủ ấm

- Nồi cách thủy- Bếp điện

3.3 Hóa chất

- Dung dịch enzyme amylase, enzyme invertase

- Thuốc thử Liugon, hồ tinh bột 1%, saccharose 5%- Thuốc thử Fehling

3.4 Cách tiến hành

Bước 1: Chuẩn bị 4 ống nghiệm, ống (1) và (2) cho 5 mL dung dịch saccharose 5%, ống

(3) và (4) cho 5 mL dung dịch hồ tinh bột 1%.

Bước 2: Thêm tiếp vào ống (1) và (3) mỗi ống 1 mL dung dịch enzyme invertase, ống (2)

và (4) mỗi ống 1mL dung dịch enzyme amylase, lắc đều và để vào tủ ấm ở 37℃ trong 15phút.

Bước 3: Lấy ống nghiệm ra khỏi tủ, cho vào ống (1) và ống (2) mỗi ống 5 mL dung dịch

Fehling và đặt vào bể điều nhiệt đang sôi trong 2 phút thì lấy ống nghiệm ra, làm nguộitới nhiệt độ phòng Cho vào ống (3) và (4) mỗi ống 2 giọt thuốc thử Liugon.

Hình 11 Quá trình phản ứng với thuốc thử Fehling

3.5 Kết quả thí nghiệm

Hình 12: Kết quả thí nghiệm tính đặc hiệu của enzyme

1

- Ống (1) có xuất hiện kết tủa màu nâu đỏ, ống (2) là dung dịch màu xanh làm và có mộtít kết tủa đỏ lắng ở dưới Ống (3) chỉ có màu vàng rất nhạt Ống (4) lại có màu tím nhạt.

3.6 Giải thích hiện tượng và biện luận:

- Để nhận biết xem ống nghiệm chứa mẫu nào được thủy phân, ta dùng hai thuốc thử làFehling và Liugon theo cơ chế:

+ Thuốc thử Fehling phản ứng với đường khử hình thành kết tủa Cu2O có màu đỏ gạch:RCHO + 2Cu2+ → RCOO- + Cu2O↓ + 3H2O

+ Thuốc thử Liugon khi có mặt tinh bột sẽ cho ra dung dịch có màu xanh đặc trưng vì Amilose trong tinh bột có khả năng tương tác tạo phức với tinh bột, hình thành cấu trúc xoắn giữ các phân tử iod ở giữa (trong hồ tinh bột ở nhiệt độ thường, phân tử tinh bột tồn tại dưới dạng các chuỗi xoắn, cứ 6 phân tử glucose lập thành 1 bước xoắn có thể hấp phụ 1 phân tử Lugol làm cho dung dịch có màu).

- Ở ống (1), kết tủa nâu đỏ xuất hiện chính là Cu2O Điều này chứng tỏ enzyme invertaseđã xúc tác cho phản ứng thủy phân saccharose thành glucose và fructose :

Ngoài ra, khi quan sát ống nghiệm (2) của các nhóm lại thấy có một ít kết tủa nâu đỏ hìnhthành ở đáy ống nghiệm (với lượng ít nhiều tùy nhóm) Điều này có thể là do hóa chất

Glucose + FructoseE invertase, 37° C