Sử dụng PCR để chuẩn đoán bệnh sán lá gan ở cừu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINHSử dụng PCR để chuẩn đoán bệnh sán lá gan ở cừu.Môn học: Thiết bị và kỹ thuật CNSH.1... Mẫu và phương pháp thực hiện.1.. Fasciola hepatica có một vò

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH

Sử dụng PCR để chuẩn đoán bệnh sán lá gan ở cừu.

Môn học: Thiết bị và kỹ thuật CNSH.

1

Nội dung

2 Đối tượng nghiên.

3 Mẫu và phương pháp thực hiện.

1 Tổng quan đề tài

3

1 Tổng quan đề tài

Fasciola hepatica có một vòng đời phức tạp, qua đó nó yêu cầu sự tồn tại của vật chủ trung gian và vật chủ cuối cùng để phát triển và trưởng thành qua nhiều giai đoạn ấu trùng.

Nhiễm trùng bởi sán lá gan Fasciola spp trong gia súc gặp thiệt hại kinh tế ước tính lên tới 3 tỷ USD hàng năm gây ảnh hưởng đáng kể đến phúc lợi của động vật và chất lượng thực phẩm xuất phát từ động vật, nó

cũng có tác động quan trọng đến sức khỏe của cộng đồng.

=> Mục tiêu: từ sự ảnh hưởng trên của sán lá gan chúng tôi muốn áp dụng kỹ thuật PCR để nhận biết sớm việc nhiễm sán lá gan ở động vật để có biện pháp phòng nhanh chóng.

4

2.Đối tượng nghiên cứu

Sán lá gan gây bệnh ở nhiều phần của cơ thể (ví dụ như mạch máu, đường tiêu hóa, phổi, gan) tùy thuộc vào loài

F hepatica là sán lá gan ở

cừu và gia súc.

Vật chủ trung giang là các loại ốc nước ngọt

ốc Limnaea

viridis và Limnaea swinhoei.

5

3 Mẫu và phương pháp thực hiện

• Lấy mẫu và bảo quản mẫu:

Các mẫu phân được thu thập tại các trang trại có cừu bị nhiễm hoặc nghi

nhiễm, các mẫu được bảo quản trong ống nghiệm ở nhiệt độ 4°C, còn trong quá trình chuyển mẫu thì lưu giữ mẫu ở -80°C.

6

• Xét nghiệm mẫu trực tiếp:

Cho khoảng 30 ml nước muối thông thường (dung dịch đẳng trương NaCl 0,9%) và ống

nghiệm chứa mẫu đặt ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, sàn lọc loại bỏ phần hạt lớn Đem hỗn hợp cho vào ống Eppendorf ly tâm ở tốc độ 2.000 vòng trong 4 phút Lấy phần lắng đi soi dưới kính hiển vi.

7

• Sử dụng formalin etyl axetat

Lấy vài gam mẫu đi gây cho vào ống nghiệm chứa 9 ml formalin 10% ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, thêm 2-3ml etyl axetat vào mỗi ống đậy nấp lắc trong 30 giây, loại bỏ khí sinh ra trong ống và ly tâm trong 4 phút ở tốc độ 2500 vòng Từ kết tủa thu được, lấy một giọt đi soi dưới kinh hiển vi 4, 10 và 40×.

8

Trứng của F hepatica được phân lập từ mẫu gan của những động vật bị nhiễm,

sau mỗi bước 5 giây lấy 1 giọt mẫu đem soi dưới kính để xác định xem trứng đã vỡ hay chưa, ngoài ra còn sử dụng máy Nanodrop để xác định nồng độ DNA sau khi trích xuất

9

Trình tự primer R và primer F

Thông sốTrình tự Chiều dài

Tỉ lệGC

Kích thướcsản phẩm

Intergenic spacer (AF179871) primer F

GCTTGCA 20 bp 60.0 50.0%

220 bpIntergenic spacer

(AF179871) primer R

TTAGGT 20 bp 60.0 50.0%

11

Quá trình phản ứng PCR gồm 3 giai đoạn:-Biến tính.

-Gắn mồi.-Kéo dài.

12

Chu trình nhiệt

13Giai đoạn Nhiệt độ(⁰C) Thời gian(phút,

giây) Số chu kì Tiền biến tính 94 5 phút 1

Biến tính 94 1 phút 35Bắt cập 55 45 giây 35Kéo dài 72 1 phút 35Hậu kéo dài 72 5 phút 1

Điện di và kiểm tra

Mẫu đối chứng âm là nước vô trùng và đối chứng dương là đoạn DNA dài

220bp Mẫu được điện di trong gel agarose 1% TBE và thuốc nhuộm an toàn DNA(1 μg/ml) g/ml)

14

Tài liệu tham khảo

15

Cảm ơn thầy và các bạn đã chú ý lắng nghe

16