báo cáo thực hành thiết bị và kỹ thuật công nghệ sinh học

Phương pháp thường được áp dụng nhất trong các phòng thí nghiệm PCR chẩn đoán là dùng kỹ thuật điện di để xác định kích thước sản phẩm khuếchđại có đúng như kích thước mong muốn hay khôn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNGNGHỆ SINH HỌC

Mã môn học: 211402GVHD: TS Huỳnh Văn Biết

Sinh viên thực hiệnLê Ngọc Kim Đồng 20126007

Phùng Thị Ngọc Hân 19126042

Huỳnh Khôi Minh Uyên 21126572Đinh Lê Ngân Xuyến 20126121

TP Thủ Đức, tháng 1 năm 2023

MỤC LỤC

BẢNG ĐÓNG GÓP LÀM THỰC HÀNH NHÓM 2

BÀI 1: CÁC VẤN ĐỀ CẦN LƯU Ý KHI THỰC HIỆN KỸ THUẬT PCR, CẤU TẠOMÁY PCR 3

1 Các vấn đề cần lưu ý thực hiện với kỹ thuật PCR 3

1.1 Các vấn đề kỹ thuật cần quan tâm khi lấy và gửi mẫu 3

1.2 Các vấn đề kỹ thuật trong chuân bị mẫu thử và tách chiếc nucleic acid 3

1.3 Các vấn đề kỹ thuật trong khuếch đại nucleic acid đích 3

1.4 Ngừa nhiễm chéo và loại trừ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại 3

1.5 Các vấn đề kỹ thuật trong thử nghiệm điện di trên thạch để đọc kết quả 4

2 Cấu tạo của máy PCR: 4

2.1 Cấu tạo của máy PCR hiện đại: 4

2.1.1 Bộ phận điều khiển: 4

2.1.2 Nguồn điện: 5

2.1.3 Bộ phận luân nhiệt: 5

3 Nguyên lý cặp nhiệt điện: 7

4 Các công nghệ được áp dụng phổ biến ở máy PCR: 8

4.1 Công nghệ gradient nhiệt độ: 8

BÀI 2: THIẾT KẾ PRIMERS VÀ XÁC ĐỊNH CÁC THÀNH PHẦN XÂY DỰNGPHẢN ỨNG PCR, CHƯƠNG TRÌNH NHIỆT 9

1 Phản ứng PCR: 9

2 Thiết kế Primer: 10

2.1 Nguyên tắc thiết kế mồi: 10

3 Vật liệu nghiên cứu và phương pháp thực hiện: 12

3.1 Vật liệu nghiên cứu: 12

3.2 Phương pháp thực hiện: 12

4 Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR: 13

BÀI 3: ĐIỆN DI VÀ PHÂN TÍCH KẾT QUẢ 14

1 Tổng quan tài liệu: 14

1.1 Kỹ thuật điện di: 14

2 Mục tiêu: 16

3 Vật liệu và phương pháp thực hiện: 16

1.1 Cấu tạo máy và nguyên lý hoạt động: 18

1.1.1 Cấu tạo máy Real Time PCR 20

1.1.2 Nguyên lý hoạt động của Real-Time PCR (sử dụng Taqman Probe) 22

2 Phân tích kết quả 23

2.1 Cường độ huỳnh quang 23

2.2 Định lượng và định tính sản phẩm RT-PCR 23

BÀI 5: HỆ THỐNG VI THAO TÁC 25

1 Cấu tạo hệ thống vi thao tác 25

2 Cấu tạo máy kéo kim: 25

3 Cấu tạo máy rèn kim: 26

BÀI 6: KỸ THUẬT ELISA 27

1 Tổng quan: 27

1.1 Khái quát về kháng thể và kháng nguyên: 27

2 Các kỹ thuật ELISA: 29

3 Vật liệu nghiên cứu và phương pháp thực hiện: 30

3.1 Vật liệu nghiên cứu 30

3.2 Phương pháp thực hiện: 33

4 Ứng dụng trong que test nhanh: 36

4.1 Cấu tạo que test nhanh: 36

4.2 Nguyên lý hoạt động của que test nhanh: 37

2.1.1 Phương pháp Axam – Gilbert: 40

2.3.1 Phương pháp Single molecule real time: 45

2.3.2 Phương pháp Oxford nanopore: 46

3 Xử lý: 47

BÀI TẬP 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO: 51

BÀI 1: CÁC VẤN ĐỀ CẦN LƯU Ý KHI THỰC HIỆN KỸ THUẬT PCR, CẤU TẠO MÁY PCR

1 Các vấn đề cần lưu ý thực hiện với kỹ thuật PCR.1.1 Các vấn đề kỹ thuật cần quan tâm khi lấy và gửi mẫu.

Mẫu thử được lấy làm xét nghiêm PCR là mẫu được lấy từ vật chủ tại nơi mà người lấy mẫu cho là có thể có sự hiện diện của nucleic acid của tác nhân đích.

Giữ và chuyên chở mẫu thử đến phòng thí nghiệm trong điều kiện sao cho nucleic acid muốn tìm không bị phân hủy cũng như mẫu thử không bị nhiễm các chất sinh học gây ức chế phản ứng khuếch đại và mẫu thử không bị nhiễm chéo.

1.2 Các vấn đề kỹ thuật trong chuân bị mẫu thử và tách chiếc nucleic acid.Tách chiếc được tối đa nuceic acid đích dù lượng lượng nucleic acid của tác nhân đích cónhỏ và bị pha lõng quá thấp trong mẫu thử.

Tách chiếc thu được phải tinh khiết, không lẫn các protein hay chất gây ức chế phản ứng khuếch đại.

Tùy loại tác nhân đích là vi khuẩn, virus, vi nấm, hay tế bào có nhân; và tùy nucleic acid phải tách chiết là DNA hay RNA mà phải lựa chọn phương pháp tách chiếc cho phù hợp, không nên lẫn lộn.

1.3 Các vấn đề kỹ thuật trong khuếch đại nucleic acid đích.

Về nguyên tắc thì phản ứng PCR đạt được độ nhạy rất cao, tuy nhiên trên thực tế thì độ nhạy còn tùy thuộc rất nhiều vào sự thiết kế hay chọn lựa mồi; và thiết bị luân nhiệt; hóa chất; và đặc biệt là enzyme Taq polymerase được sử dụng.

Kiểm tra độ nhạy của các PCR mix cho phản ứng khuếch đại Phương pháp kiểm tra là thử nghiệm trên các độ pha loãng củ DNA đích cho vào PCR mix.

Kiểm soát được độ nhạy của PCR mix được sử dụng trong mỗi lần làm xét nghiệm.1.4 Ngừa nhiễm chéo và loại trừ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại

Muốn sử dụng PCR trong chuẩn đoán, người làm xét nghiệm phải nhận diện được để có các biện pháp kỹ thật ngăn ngừa hay loại trừ nguy cơ ngoại nhiễm làm cho mẫu thử không có tác nhân đích lại bị có kết quả dương tính khi làm xét nghiệm, nghĩa là bị nguy cơ dương tính giả.

1.5 Các vấn đề kỹ thuật trong thử nghiệm điện di trên thạch để đọc kết quả.Đối với phương pháp PCR cổ đển thì muốn đọc được kết quả, người làm thí nghiệm phải làm tiếp thí nghiệm để xác định được trong ống phản ứng có sản phẩm khuếch đại đặc hiệu đặc hiệu hay không Phương pháp thường được áp dụng nhất trong các phòng thí nghiệm PCR chẩn đoán là dùng kỹ thuật điện di để xác định kích thước sản phẩm khuếchđại có đúng như kích thước mong muốn hay không.

Trong một kết quả điện di chuẩn mực cho PCR chẩn đoán còn cần phải có một giếng cho chứng [+] để so sánh kích thước của sản phẩm khuếch đại trong vạch điện di từ các giếngchứa mẫu, và một giếng cho chứng âm để chứng minh quá trình làm xét nghiệm PCR chẩn đoán không bị ngoại nhiễm.

2 Cấu tạo của máy PCR:

2.1 Cấu tạo của máy PCR hiện đại:2.1.1 Bộ phận điều khiển:

Bao gồm: màn hình, bàn phím, vi mạch điều khiển,…

Hình 1.1: Màn hình và bàn phím Hình 1.2: Vi mạch điều khiểnBộ phận điều khiển đóng vai trò là một bộ phận giao tiếp với người dùng, giúp thiết lặp chương trình và điều khiển hoạt động của thiết bị.

2.1.2 Nguồn điện:

Bao gồm: Biến áp, cầu chì, tụ điện, điện trở, diot,…

Hình 1.3: Biến áp Hình 1.4: Cầu chì Nguồn điện đóng vai trò chuyển đổi dòng điện xoay chiều 220V thành dòng điện một chiều với nhiều mức điện áp khác nhau để cung cấp cho các bộ phận khác nhau của thiết bị.

2.1.3 Bộ phận luân nhiệt:

Bao gồm: nắp nhiệt, block nhiệt, bộ phận gia nhiệt, quạt tản nhiệt, cảm biến nhiệt,…

Hình 2.7: Cấu tạo nắp nhiệt

Bao gồm: điện trở, cảm biến nhiệt,…Nắp nhiệt đóng vai trò gia nhiệt cho phần nắp của tube PCR giúp ngăn cản quá trình bay hơi và ngưng tụ gây hao hụt thể tích phản ứng

Hình 2.8: Bộ phận gia nhiệt Hình 2.9: Quạt tản nhiệtBộ phận luân nhiệt đóng vai trò thay đổi nhiệt độ phản ứng liên tục theo chu trình nhiệt được thiết lập.

3 Nguyên lý cặp nhiệt điện:

Thomas Johann Seebeck phát hiện ra rằng hai dây dẫn khác loại nối với nhau và đặt ở hainhiệt độ khác nhau (tức là có gradient nhiệt) thì tạo ra một điện áp Sự chênh nhiệt dẫn đến dòng nhiệt truyền, làm khuếch tán các hạt mang điện Dòng chảy của các hạt mang điện giữa các vùng nóng và lạnh lại tạo ra một điện áp khác nhau.

Hình 2.10: Nguyên lý cặp nhiệt điện

Jean Charles Athanase Peltier phát hiện ra hiệu ứng ngược lại, rằng một dòng điện chạy qua mối nối nhau của hai dây dẫn khác loại nhau, thì tùy thuộc vào chiều dòng điện, làm cho nó hoạt động như một phần tử làm nóng hoặc làm mát Hiệu ứng được gọi là hiệu ứng Peltier và Bơm nhiệt Peltier hoạt động theo hiệu ứng này.

Hình 2.11: Hiệu ứng Pelter4 Các công nghệ được áp dụng phổ biến ở máy PCR:

4.1 Công nghệ gradient nhiệt độ:

Block nhiệt được cấu tạo từ 2 sò nóng lạnh trở lên Nhiệt độ trên block được phân bố theodải gradient hoặc từng vùng riêng biệt Lắp sò ở hai đầu ở hai nhiệt độ khác nhau, nhiệt độ trên block được phân bố theo dải gradient nên khảo sát một lúc 12 nhiệt độ khác nhau.Một con sò thiết lặp được một nhiệt độ, thời gian PCR là 2 tiếng.

Hình 2.12: Công nghệ gradient nhiệt độ4.2 Công nghệ PCR nhiều vùng nhiệt, nhiều block nhiệt:

Nhiều vùng nhiệt: block nhiệt được cấu tạo từ nhiều Peltier Công nghệ này giúp cài đặt nhiệt độ riêng biệt cho từng vùng trên block.

Nhiều block nhiệt: máy PCR có nhiều block nhiệt riêng biệt, có thể hoạt động độc lập

như nhiều máy PCR

Hình 2.13: Máy PCR màn Hình 2.14: Vùng nhiệthình cảm ứng

Hình 2.14: Màn hình hiển thị Hình 2.15: Công nghệ nhiều nắp nhiệtBÀI 2: THIẾT KẾ PRIMERS VÀ XÁC ĐỊNH CÁC THÀNH PHẦN XÂY DỰNG PHẢN ỨNG PCR, CHƯƠNG TRÌNH NHIỆT

1 Phản ứng PCR:

PCR là một trong những phát minh quan trọng nhất của thế kỉ 20 Phản ứng này nhằm sao chép tạo ra một lượng lớn phân tử ADN đích, giúp xác định, và phát hiện các mầm bệnh lây nhiễm như HIV, viêm gan hoặc phát hiện các thay đổi về mặt di truyền như đột biến PCR được thực hiện thông qua 3 bước: biến tính (denaturing), gắn mồi (annealing), và kéo dài chuỗi (extending) ADN được sử dụng làm khuôn có cấu trúc xoắn kép, khi bị biến tính bởi nhiệt nó tách ra thành 2 mạch đơn, một mạch mang nghĩa (sense) và một

mạch đối nghĩa (antisense) Khi nhiệt độ hạ xuống đến nhiệt độ gắn mồi, một mồi sẽ gắn đặc hiệu vào mạch mang nghĩa trong khi một mồi khác sẽ gắn vào mạch đối nghĩa Trongđó, mồi là các trình tự oligonucleotide ngắn có thể bám đặc hiệu vào một vùng trình tự nhất định Mồi sẽ là điểm khởi đầu để các polymerase có thể thực hiển tổng hợp mạch bổ sung mới cũng như xác định đoạn ADN được khuếch đại Do đó, việc thiết kế mồi sẽ quyết định mức độ đặc hiệu và năng suất của phản ứng.

Hình 2.1: Phản ứng PCR2 Thiết kế Primer:

2.1 Nguyên tắc thiết kế mồi:

1 Độ dài của mồi: Nên nằm trong khoảng từ 15-30 base, độ dài tối ưu là khoảng từ 18-22base Điều này phụ thuộc vào việc mồi cần đủ dài để gắn đặc hiệu và đủ ngắn để có thể

mồi.

Hình 2.2: Hai mạch của ADN

2 Đầu 3’ và 5’ của mồi: Cần thiết kế sao cho đầu 3’ của mồi xuôi sẽ mở rộng về phía mồingược và đầu 3’ của mồi ngược sẽ mở rộng về phía mồi xuôi khi được gắn vào 2 mạch bổsung Nếu ngược lại thì sản phẩm PCR sẽ không thể được tạo ra.

3 Nhiệt độ nóng chảy của mồi Tm Điểm nhiệt độ này được định nghĩa là điểm nhiệt mà :tại đó 50% sợi đôi ADN phân tách nhau và tạo sợi đơn Điểm nhiệt này rất quan trọng ở pha gắn mồi, Tm nên nằm trong khoảng 50-65oC Nhiệt độ nóng của mồi trên 65 độ dễ dẫn đến xu hướng mồi gắn không chính xác Nhiệt độ Tm của hai mồi không chênh lệch nhau quá 2oC, nhiệt độ chênh lệch quá 5oC có thể không thể tạo ra được sản phẩm Côngthức tính Tm như sau:

Công thức đơn giản: Tm=4°C x (G + C) + 2°C x (A + T)

Công thức chứa nồng độ muối: Tm = 81.5 +16.6 x (log10[Na+]) + 0.41 (%(G+C)) – 675/n

Trong đó: [Na+] là nồng độ phân tử muối, n là số base của mồi.

4 Nhiệt độ gắn mồi (Ta): Được tính dựa vào nhiệt động nóng chảy của mồi Nhiệt độ gắnmồi thấp có thể dẫn đến lượng sản phẩm PCR được tạo ra thấp, do không đủ số lượng phức hợp lai giữa mồi và khuôn Ngược lại, sản phẩm không đặc hiệu sẽ được tạo ra nhiều nếu nhiệt độ gắn mồi quá thấp Người ta thường tính nhiệt độ gắn mồi theo công thức sau:

Ta = 0.3 x Tm(Mồi) + 0.7 Tm (sản phẩm) – 14.9

5 Mật độ GC Ảnh hưởng đến Tm, do đó mật độ GC nên nằm trong khoảng 50 – 60%.:6 Kẹp GC: Nên có ít nhất một G hoặc C ở đầu 3’ của mồi để giúp cho đầu 3’của mồi liênkết mạnh hơn Tuy nhiên nên tránh việc trong 5 base đầu 3’ có nhiều hơn 3 G hoặc C do có thể gây liên kết đầu 3’ quá mạnh khiến mồi bắt cặp không đặc hiệu.

7 Lưu ý cấu trúc bậc 2 trong thiết kế mồi.

a) Hình thành hiện tượng kết cặp (dimer): Là hiên tương mồi thay vì gắn vào khuôn sẽgắn vào mồi ngược với nó hoặc với chính nó, tạo ra các sản phẩm PCR có kích thước nhỏvà làm giảm lượng mồi bắt cặp với khuôn Do đó cần tránh tạo ra hiện tượng kết cặp

Hình thành dimer giữa hai mồi:

b) Cấu trúc kẹp tóc: có thể được hình thành bởi sự tương tác bên trong chính đoạn mồi Cần tránh điều này vì làm giảm hiệu quả của phản ứng PCR.

8 Lặp: là hiện tượng lặp lại nhiều lần trong trình tự mồi của trình tự đôi (VD:

ATATATATAT) hoặc đơn (VD: GGGGG) Điều này có thể gây bắt cặp nhầm do đó số lần lặp tối đa của một mồi là 4 lần lặp cho cả hai trường hợp.

9 Tương đồng chéo: Là hiện tượng mà cặp mồi sẽ khuếch đại một gene khác có trong hỗn hợp ban đầu Để tránh hiện tượng này, mồi sau khi thiết kế cần được đưa lên BLAST để so sánh và kiểm tra độ đặc hiệu.

3 Vật liệu nghiên cứu và phương pháp thực hiện:3.1 Vật liệu nghiên cứu:

Thành phần phản ứng PCR:

DNA mẫu (template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại.

Cặp mồi (primer) là các đoạn DNA ngắn (dưới 50bp) để xác định điểm bắt đầu và kết thúc vùng cần khuếch đại.

DNA-polymerase enzym xúc tác cho việc nhân lên của DNA.

Nucleotides (dNTP) là nguyên liệu cho DNA-polymerase tổng hợp DNA mới.Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho DNA-polymerase.

3.2 Phương pháp thực hiện:

Phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt gồm các bước:

Bước 1: Khởi đầu: Đun hỗn hợp ở 96 °C trong vòng 5 phút để đảm bảo sợi DNA cũng như mồi được làm nóng.

Bước 2: Biến tính (Melting): DNA khuôn ở dạng sợi đôi được tách thành 2 sợi đơn.Bước 3: Gắn mồi (Annealing): Mồi được gắn vào DNA khuôn ở vị trí có trình tự bổ sung, bắt đầu quá trình tổng hợp.

Bước 4: Kéo dài (Elongation): Các nucleotide được gắn vào chuỗi theo nguyên tắc bổ sung với DNA khuôn.

Bước 5: Lặp lại bước 2-4 (số lần lặp lại là số chu trình nhiệt, tùy thuộc vào từng loại phản ứng PCR).

4 Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR:

Một chu kỳ nhiệt của PCR sẽ gồm 3 giai đoạn nhiệt độ (Hình 1):

1 - Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ sẽ được đưa lên 94 oC, các liên kết hydro sẽ bị phá vỡ khiến DNA bị biến tính trở thành dạng mạch đơn.

2 - Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ được hạ xuống 55 - 65 oC, các đoạn mồi sẽ bắt cặp bổ sung vào 2 đầu trình tự mục tiêu.

3 - Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ được đưa lên 72 oC, Taq polymerase sẽ sử dụng dNTP để kéo dài đầu 3' của mồi và tạo ra mạch bổ sung.

Hình 2.3: Chu trình nhiệt của một quy trình PCR

Như vậy, cứ qua một chu kỳ nhiệt, số mạch DNA sẽ được nhân đôi Nếu chu kỳ nhiệt lặp lại liên tục 30 - 40 lần thì số bản sao sẽ là 230 ~ 240 bản sao Số lượng bản sao DNA khổng lồ này khi được gắn các phân tử phát tín hiệu (ví dụ Ethidium Bromide) có thể nhìn thấy bằng mắt thường trên gel điện di dưới ánh đèn UV

BÀI 3: ĐIỆN DI VÀ PHÂN TÍCH KẾT QUẢ1 Tổng quan tài liệu:

1.1 Kỹ thuật điện di:

Kỹ thuật điện di trên gel là kỹ thuật sử dụng để phân tích các nucleic: DNA, RNA và protein.

Các loại phân tử được phân tách với nhau dựa trên tốc độ di chuyển của chúng trên một loại môi trường bán rắn là gel.

Thông thường đối với DNA là Gel Agarose: xác định độ hiện diện cũng như kích thước của sản phẩm PCR; còn đối với RNA và protein, thường sử dụng Acrylamide do nó có độphân giải cao hơn.

Sự di chuyển của các phân tử được tạo ra bởi từ trường, các phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn và ngược lại DNA di chuyển từ cực âm (-) sang cực dương (+) Tốc độ di chuyển của DNA phụ thuộc vào: lực của điện trường, thành phần buffer, nồng độ gel, kích thước phân tử DNA.

Hai loại Buffer solution thường sử dụng trong kỹ thuật điện di: TBE và TAE.TBE: Phân tách tốt các sản phẩm PCR có kích thước dưới 2kb, phù hợp để điện di phát hiện sản phẩm PCR cho các bệnh thông thường hoặc các gen mong muốn.- Ưu điểm: Thời gian dài không bị nóng gel.

- Nhược điểm: Muối borat sẽ làm ức chế hoạt động của enzyme, ví dụ như enzyme cắtnối… làm giảm tỷ lệ thu hồi DNA từ gel

-> nếu sử dụng cho ứng dụng về sau thì không nên dùng.TAE: Điện di những sản phẩm có kích thước lớn.

- Ưu điểm: Buffer có thành phần muối acetate không ảnh hưởng, tác động đến những ứngdụng về sau

-> có thể lấy sản phẩm PCR trong gel điện di để cloning tạo dòng.

- Nhược điểm: Trong thời gian dài dễ xảy ra hiện tượng nóng gel -> ko nên kéo dài thời gian với điện thế lớn.

1.2 Các loại chất nhuộm DNA:Chất Ethidium

bromide (EtBr)

Chức năng

chất nhuộm được sử dụng nhiều nhất trong kỹ thuật điện di DNA trên gel agarose Chất nhuộm này rất rẻ, có thể phát hiện được 1 ng DNA trên 1 băng và có thể được sử dụng trước hoặc sau quá trình điện di.

chất nhuộm axit nucleic huỳnh quang siêu nhạy, cực kỳ ổn định và an toàn với môi trường được thiết kếđể thay thế ethidium bromide (EtBr) độc hại cao( gây ung thư) để nhuộm dsDNA, ssDNA hoặc RNA trong gel agarose hoặc gel

thuốc nhuộm huỳnh quang nucleic acid trên gel, bền vững và thân thiện với môi trường GelGreen nhạy hơn SYBR và bền với cả nhiệt phânvà thủy phân

chất phát huỳnh quang khi gắn vào DNA sợi đôi.Trong phản ứng PCR, DNA polymerase khuếch đại DNA đích tạo nên sản phẩm là các DNA sợi đôi Sảnphẩm PCR càng nhiều thì cường độ huỳnh quang phát ra càng cao Hình 3.1 Thiết bị điện di

polyacrylamide.Ánh

phát ra ánh sáng huỳnh quang màucam đỏ

phát ra ánh sáng huỳnh quang màu cam đỏ

nguồn sáng kích thích màu xanh dương

nguồn sáng kích thích màu xanh dương2 Mục tiêu:

Xác định mẫu DNA của con cừu có trong các tube được chuẩn bị sẵn.3 Vật liệu và phương pháp thực hiện:

Trong quá trình điện di, các phân tử DNA sẽ được phân loại theo kích thước, các phân tử sẽ bị hút về cực dương trước do các phân tử nhỏ đi qua lỗ gel dễ dàng hơn Có thể nói khoảng cách mà đoạn DNA đi qua sẽ tỉ lệ nghịch với trọng lượng phân tử của nó.Thông qua bước điện di kiểm tra kết quả ly trích có thể cho ta biết được độ nguyên vẹn cao DNA khi các băng DNA gọn, tập trung và rõ nét Qua kiểm tra độ nguyên vẹn của DNA cũng xác định được mức độ tinh sạch của sản phẩm DNA ly trích được.

4 Kết quả và kết luận: 4.1 Kết quả:

Hình 3.2: Quy trình thao tác thực hiện trộn mẫu PCR với thuốc nhuộmGelRed

Hình 3.3: Kết quả sau khi điện di

4.2 Kết luận:

So đối đối chứng dương có chứa DNA của con cừu và đối chứng âm không chứa DNAcủa con cừu đường đưa ra thì ta có thể kết luận rằng mẫu chứa trong tube nhóm đã nhậnđược không chứa DNA của con cừu

BÀI 4: REAL TIME PCR1 Tổng quan:

1.1 Cấu tạo máy và nguyên lý hoạt động:

-Khái niệm Real-Time PCR (RT-PCR) là phản ứng PCR mà quá trình nhân bản DNA: được diễn ra theo từng chu kỳ nhiệt được theo dõi trực tiếp Hay nói cách khác, RT-PCRgồm hai quá trình diễn ra đồng thời đó là nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đo độphát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạo thành.

-Bằng cách nào để có tín hiệu Real Time phản ứng PCR đang diễn ra?

Ngoài những thành phần cơ bản trong một phản ứng PCR thì kỹ thuật RT-PCR còn cóthêm chất phát tín hiệu huỳnh quang để có thể quan sát quá trình phản ứng diễn ra.Những chất phát huỳnh quang có thể là phẩm nhuộm hoặc probe phát huỳnh quang.-Phẩm nhuộm (Ethidium Bromide và SYBR Green):

Phẩm nhuộm khi chèn vào DNA sợi đôi sẽ phát huỳnh quang mạnh hơn khi ở trạng tháitự do: Ethidium Bromide sáng gấp 25 lần, SYBR Green sáng gấp 200 lần.

Hình 3.4: Kết quả mẫu của nhóm so với mẫu đối chứng âm vàmẫu đối chứng dương

Ethidium Bromide (EtBr)

Ethidium Bromide là thuốc nhuộm DNA/RNA được sử dụng khá phổ biến Nó có khảnăng tự mình chèn vào giữa base nito của sợi xoắn kéo DNA và có độ hấp thụ cực tím ởmức 300nm và 360nm EtBr phát ra ánh sáng vàng/cam xung quanh bước sóng 590nm.Nó có khả năng phát hiện DNA rất nhạy, tuy nhiên lại là chất gây đột biến tiềm tàng và cóđộc tính Do đó nếu sử dụng Ethidium Bromide cần hết sức cẩn thận trong quy trìnhnhuộm và xử lý chất thải.

SYBR Green

SYBR® Green là dye báo cáo bám mạch đôi ADN được sử dụng phổ biến nhất SYBR®Green bám vào rãnh nhỏ (minor groove) của chuỗi xoắn kép DNA Trong dung dịch, cácdye không bám sẽ phát tín hiệu rất thấp Tín hiệu huỳnh quanh được tăng cường đáng kểkhi dye bám vào mạch đôi ADN.

-Probe phát huỳnh quang (TaqMan)

Mẫu dò Taqman là một đoạn oligo-nucleotide dài khoảng 24-30bp với đầu 5’ gắn mộtchất phát huỳnh quang (reporter) và đầu 3’ còn lại gắn chất hấp thụ (quencher) Khi mẫudò Taqman còn nguyên vẹn, quencher sẽ hấp thụ tất cả ánh sáng huỳnh quang do reporterphát ra Khi phản ứng PCR diễn ra, mẫu dò sẽ bị Taq polymerase cắt mẫu dò bằng hoạttính 5’-3’ exonuclease, reporter được giải phóng tín hiệu huỳnh quang không còn bịquencher hấp thu.

Mẫu dò Taqman thường được gắn cách mồi một đoạn dài ngắn hơn 10 nucleotide Ngoàira, mồi trong phản ứng Real-Time PCR thường có nhiệt độ nóng chảy khoảng 55-60 vàthấp hơn mẫu dò Taqman khoảng 5-10 để đảm bảo mẫu dò luôn bắt cặp trước.

Hình 4.2: Cơ chế phát tín hiệu của SYBR Green và Taqman

1.1.1 Cấu tạo máy Real Time PCR

Thực chất, hệ thống Real-Time PCR gồm máy luân nhiệt (PCR) được nối với máy quangphổ huỳnh quang và máy vi tính.

Hình 4.2: Cấu tạo cơ bản của một hệ thống Real-Time PCR

Máy luân nhiệt trong hệ thống RT-PCR có cấu tạo tương tự như máy PCR thông thường,bao gồm 3 bộ phận chính: bộ phận điều khiển, nguồn điện và bộ phận luân nhiệt.Máy quang phổ huỳnh quang cấu tạo bao gồm:

Nguồn sáng để tạo ra bức xạ cần thiết, có thể là đèn xenon hoặc nguồn cảm ứnglaser.

Bộ phận đơn sắc hoá: gồm 2 phần đơn sắc hoá bức xạ kích thích (trước buồng đo) vàbức xạ huỳnh quang (sau buồng đo).

Buồng đo: được bố trí sao cho phương nguồn sáng và phương thu tín hiệu vuông gócvới nhau

Để tăng tín hiệu đến bộ thu nhận người ta bố trí thêm gương đối diện.

Máy vi tính đóng vai trò giao tiếp với người dùng, hiển thị kết quả, giao diện quan sát,phân tích kết quả phản ứng PCR.

Theo cấu tạo của từng dòng máy RT-PCR sẽ sử dụng những loại tube tương ứng Về sốlượng có thể phân loại thành tube đơn, strips 8 tube hoặc plates 96 giếng Về màu sắctube có thể chia thành: tube trong suốt (clear tube), tube mờ (frosted tube) và tube trắng(white tube).

Hình 4.3: Các loại tube sử dụng cho realtime PCR

1.1.2 Nguyên lý hoạt động của Real-Time PCR (sử dụng Taqman Probe)Quy trình thực hiện kỹ thuật RT-PCR cũng theo nguyên tắc thông thường của phản ứngtổng hợp chuỗi Tuy nhiên, đặc điểm khác biệt chính là đoạn DNA được nhân lên sẽ được

phát hiện tại mỗi thời điểm diễn ra phản ứng (real time) Cụ thể ở đây nhóm sẽ đề cập đếnnguyên lý hoạt động của RT-PCR sử dụng Taqman probe.

Trong kỹ thuật này, real-time PCR mix ngoài các thành phần cơ bản của PCR mix, cònchứa hai thành phần quan trọng để probe có thể phát huỳnh quang khi có sự hiện diện củasản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích, đó là: Taqman probe và enzyme Taqpolymerase có hoạt tính 5’-3’ exonuclease Khi chưa có sự xuất hiện của sản phẩmkhuếch đại đặc hiệu từ DNA đích thì Taqman probe vẫn còn nguyên vẹn do vậy màhuỳnh quang phát ra được từ reporter ở đầu 5’ sẽ bị quencher ở đầu 3’ của probe hấp thụ,ống thử nghiệm sẽ không phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích.Khi bắt đầu có sự xuất hiện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu thì Taqman probe sẽ bắt cặpvào sợi khuôn của sản phẩm này ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp và sẽ bị enzyme Taqpolymerase cắt bỏ để kéo dài mồi tổng hợp nên sợi bổ sung, do vậy mà reporter củaTaqman probe sẽ bị cắt rời xa quencher và phát được huỳnh quang khi nhận được nguồnsáng kích thích Càng nhiều sản phẩm khuếch đại xuất hiện thì số lượng reporter tự do sẽcàng nhiều, đến một lúc nào đó cường độ huỳnh quang phát ra từ reporter đủ mạnh thìmáy sẽ ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận đượcnguồn sáng kích thích

2 Phân tích kết quả

2.1 Cường độ huỳnh quang

Hình 4.4: Cường độ huỳnh quang của chu trình phản ứng RT-PCRBiểu đồ cường độ huỳnh quang của chu trình phản ứng Real Time PCR thường sẽ có 3giai đoạn: giai đoạn ủ, giai đoạn luỹ thừa và giai đoạn bình nguyên Giai đoạn ủ là giaiđoạn chưa có chuỗi mới được tổng hợp hoặc lượng DNA được tổng hợp còn quá ít, chưađủ tín hiệu huỳnh quang để máy thu nhận Giai đoạn luỹ thừa là giai đoạn có số lượngDNA và tín hiệu huỳnh quang tăng nhanh Cuối cùng là giai đoạn bình nguyên, tại đâymột số thành phần của phản ứng đã hết nên không có DNA nào được tạo ra.

2.2 Định lượng và định tính sản phẩm RT-PCR

Thời điểm tốt nhất để có kết quả định lượng tương đối đó chính là thời điểm xuất hiệnchu kỳ ngưỡng (Ct) Chu kỳ ngường là nơi mà tín hiệu huỳnh quang cao hơn tín hiệu nềnmột cách thấy rõ Số lượng bản DNA đích ban đầu càng nhiều thì thời điểm (Ct) pháthiện tín hiệu sản phẩm khuếch đại càng sớm Hay nói cách khác, mẫu thử chứa nhiều bảnđích ban đầu sẽ có chu kỳ ngưỡng phát hiện sớm hơn là mẫu thử có ít bản đích Còn để định lượng tuyệt đối thì cần phải xây dựng đường chuẩn: y = ax+b Trong đó, ylà giá trị chu kỳ ngưỡng, x là số coppies

Số copies =

Để xây dựng đường chuẩn thì phải có ít nhất 5 điểm được xác định dựa trên chu kỳngưỡng và số copies Ngoài ra cần phải có mẫu chuẩn đã biết chính xác số copies, mẫuchuẩn này có thể mua hoặc tự tạo ra bằng cách nuôi cấy E.coli.

Một trong những cải tiến rõ ràng nhất của RT-PCR so với PCR đó chính là ngoài địnhlượng, thì RT-PCR còn có thể định tính dựa vào phương pháp phân tích đường congnóng chảy Nhiệt độ nóng chảy (Tm) đặc trưng cho kích thước và thành phần của DNA.Trong chu trình phản ứng RT-PCR, sẽ có trường hợp DNA đích và các primer dimer cùngphát quang (do chúng đều là DNA sợi đôi), để định tính được hai thành phần này thì ta cóthể căn cứ vào nhiệt độ nóng chảy, các primer dimer thường có Tm thấp ( chỉ khoảng 60-70), trong khi DNA đích có Tm cao hơn, khác biệt rõ ràng ( khoảng 75-90) Cho nênhoàn toàn có thể dựa vào phương pháp xác định đường cong nóng chảy để định tính sảnphẩm mà không cần phải thực hiện thêm phản ứng nào khác.

Công thức tính hàm lượng DNA sợi đôi:Hàm lượng DNA sợi đôi (= OD260 Độ pha loãng 50