khảo sát hợp chất có hoạt tính sinh học kháng e coli sinh β lactamase phổ rộng esbl từ chủng bacillus sp rd26 nội sinh

COLI SINH ESBL --- 43 KHẢO SÁT CÁC PHÂN ĐOẠN CẮN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỚP MỎNG TLC --- 44 PHÂN LẬP HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG E.. Năm 2006, Nalisha và cộng sự ti

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

CHUYÊN NGÀNH: Y DƯỢC

GVHD1: ThS DƯƠNG NHẬT LINH GVHD2: TS NGUYỄN TẤN PHÁT SVTH: ĐINH THỊ THÚY KIỀU MSSV: 1553010080

NIÊN KHÓA: 2015 – 2019

Bình Dương, tháng 05 năm 2019

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Bình Dương, tháng 05 năm 2019

TP Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2019 LỜI CẢM ƠN

Sau khoảng thời gian dài học tập và làm đề tài thực tập tại trường Đại học Mở - Cơ sở 3 Bình Dương nói chung và phòng thí nghiệm vi sinh nói riêng đã để lại trong em rất nhiều bài học quý báu cũng như những kỷ niệm đáng nhớ Để hoàn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp này em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ bạn bè, thầy cô và gia đình

Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến cô Dương Nhật Linh và thầy Nguyễn Tấn Phát – Người cô, người thầy lái đò vĩ đại Thầy cô đã tận tình

chỉ dạy em, giúp đỡ và luôn tạo điều kiện tốt nhất để em lĩnh hội kiến thức Đặc biệt luôn động viên em trong những lúc khó khăn và bên cạnh em xuyên suốt đề tài khóa luận tốt nghiệp của em

Em xin cảm ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh Quý thầy cô đã hết lòng giảng dạy cũng như truyền đạt những kiến thức quý báu

Em xin chân thành cảm ơn chị Trần Thị Á Ni và chị Nguyễn Thị Thảo Nguyên

đã sẵn sàng thức thâu đêm để sửa bài cho em, luôn giúp đỡ em giải quyết những vấn đề vướng mắc em gặp phải trong quá trình thực hiện đề tài

Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn bạn Nguyễn Thị Lành, đã đồng hành cùng tôi suốt đề tài, cảm ơn bạn Lương Thị Cẩm Vân đã giúp đỡ tôi rất nhiều cũng như các bạn,

các em tại phòng thí nghiệm vi sinh đã luôn sát cánh hỗ trợ, quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt đề tài

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến ba, mẹ những người đã sinh thành, nuôi

nấng và dạy dỗ con nên người cũng như luôn bên cạnh động viên con trong những lúc khó khăn nhất

Em xin kính chúc quý thầy cô, gia đình, các anh chị, các bạn và các em dồi dào sức khỏe, gặt hái nhiều thành công trong cuộc sống

TP Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2019

Đinh Thị Thúy Kiều

TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN E coli - 6

Phân loại theo khóa phân loại quốc tế - 7

Hình thái và đặc điểm nuôi cấy - 7

Hợp chất từ Bacillus có hoạt tính sinh học - 13

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ HỢP CHẤT TỪ BACILLUS - 14

Tình hình nghiên cứu về hợp chất từ Bacillus trên thế giới - 14

Tình hình nghiên cứu về hợp chất từ Bacillus ở Việt Nam - 15

VẬT LIỆU - 22

Chủng vi sinh vật nghiên cứu - 22

Môi trường – hóa chất - 22

1.3.2.1.1 Chuẩn bị môi trường - 25

1.3.2.1.2 Chuẩn bị dịch vi khuẩn E coli sinh ESBL - 25

1.3.2.1.3 Chuẩn bị dịch vi khuẩn thử nghiệm - 25

Nuôi cấy và thu nhận cao chiết Bacillus sp RD26 từ các hệ dung môi khác nhau - 27

Nuôi cấy vi khuẩn Bacillus sp RD26 bằng phương pháp lên men trên môi trường tối ưu - 27

Thu nhận cao chiết Bacillus sp RD26 từ các hệ dung môi khác nhau - - 28

Thử khả năng kháng E coli sinh ESBL từ cao chiết Bacillus sp RD26 bằng phương pháp khuếch tán đĩa kirby-bauer - 29

Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC (Minimum Inhibatory Concentration) của cao chiết với vi khuẩn E coli sinh ESBL - 29

Khảo sát các phân đoạn cắn bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) - 30

Sắc ký cột cao chiết - 31

Khảo sát khả năng kháng E coli sinh ESBL từ các phân đoạn thu được của cao chiết chủng Bacillus sp RD26 nội sinh bằng phương pháp khuếch

tán giếng thạch Kirby – Bauer - 33

Phân lập hợp chất có hoạt tính sinh học có khả năng kháng E coli

sinh ESBL - 33

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG E COLI SINH ESBL CỦA DỊCH NUÔI CẤY VÀ TỪ SINH KHỐI CHỦNG BACILLUS SP RD26 - 38

KẾT QUẢ THU NHẬN CAO CHIẾT BACILLUS SP RD26 TỪ CÁC HỆ DUNG MÔI KHÁC NHAU - 39

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG E COLI SINH ESBL TỪ CÁC CAO

CHIẾT THÔ THU ĐƯỢC - 40 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC) CỦA

CAO CHIẾT VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH E COLI SINH ESBL - 43

KHẢO SÁT CÁC PHÂN ĐOẠN CẮN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỚP MỎNG (TLC) - 44

PHÂN LẬP HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÓ KHẢ NĂNG

KHÁNG E COLI SINH ESBL - 52

KẾT LUẬN - 56 ĐỀ NGHỊ - 56

PHỤ LỤC 3: HÌNH ẢNH SẮC KÝ CỘT CAO CHIẾT 71

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Hình ảnh nhuộm Gram vi khuẩn E coli 7

Hình 1.2 Hình vi thể của Bacillus 11

Hình 2.1 Kết quả kháng khuẩn của vi khuẩn thử nghiệm 26

Hình 3.1 kết quả kháng khuẩn E coli sinh ESBL chiết từ dịch nuôi cấy (ngoại bào). 38

Hình 3.2 kết quả kháng khuẩn E coli sinh ESBL chiết từ sinh khối 38

Hình 3.11 Khả năng kháng E coli sinh ESBL của các phân đoạn A 50

Hình 3.12 Khả năng kháng E coli sinh ESBL của các phân đoạn B 50

Hình 3.13 Khả năng kháng E coli sinh ESBL của các phân đoạn C 51

Hình 3.14 Khả năng kháng E coli sinh ESBL của các phân đoạn D 51

Hình 3.15 Khả năng kháng E coli sinh ESBL của các phân đoạn E 51

Hình 3.16 Khả năng kháng E coli sinh ESBL của các phân đoạn F 51

Hình 3.17 Sắc ký lớp mỏng (TLC) các phân đoạn thu nhận từ hệ dung môi (Cl: Me) tỉ lệ (85: 15) và (70: 30) 52Hình 3.18: Cấu trúc hoá học của BR01 54

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của dung môi đến khối lượng cao chiết 34 Biểu đồ 3.2 Khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết 36

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Tác động kháng khuẩn chiết từ dịch nuôi cấy và từ sinh khối 38

Bảng 3.2 Kết quả điều chế cao chiết thô từ dịch lọc vi khuẩn 39

Bảng 3.3 Khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết 41

Bảng 3.4 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết 43

Bảng 3.5 Hệ số di chuyển (Rf) của cao chiết 45

Bảng 3.6: Dữ liệu phổ 1H (500 Hz) và 13C (125 Hz) của BR01 và chất 2,4-dion đo trong DMSO-d6 53

pyrimidine-DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Bố trí thí nghiệm 23

Sơ đồ 2.2 Quy trình điều chế cao phân đoạn dịch vi khuẩn 27

Sơ đồ 2.3 Quy trình sắc ký cột cao Me……… 32

Sơ đồ 2.4 Quy trình phân lập phân đoạn C………35

Sơ đồ 2.5 Quy trình phân lập cao phân đoạn D……….36

MRSA Methicillin resistant Staphylococcus aureus

“Staphylococcus aureus kháng Methicillin”

ICU Intensive care unit “Đơn vị hồi sức cấp cứu, điều trị tích cực, chăm sóc đặc biệt”

CDDEP Center for disease dynamics, economics & policy “Trung tâm động dịch bệnh, kinh tế và chính sách”

CLSI Tiêu chuẩn Phòng thí nghiệm và Lâm sang

TLC Thin Layer Chromatography (Sắc ký bản mỏng)

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vi khuẩn kháng thuốc ngày nay đã trở thành vấn đề toàn cầu, đặc biệt ở các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam Mỗi năm trên thế giới có hàng trăm nghìn người tử vong do vi khuẩn kháng thuốc, nhiều chủng vi khuẩn đã kháng lại hầu hết các kháng sinh, kể cả kháng sinh thế hệ mới Trong khi tiến trình nghiên cứu ra các kháng sinh mới đã chậm lại từ rất lâu và chỉ có vài kháng sinh mới ra đời Bên cạnh đó việc gia tăng tình trạng vi khuẩn kháng thuốc là nguyên nhân khiến lượng kháng sinh hiện tại không đủ đáp ứng cho điều trị nhiễm khuẩn kháng đa thuốc (Jeyanthi và cs., 2016)

Trong những thập kỉ gần đây, vi khuẩn đa kháng thuốc (multidrug resistant – MDR) xuất hiện ngày càng tăng, gây ra những thách thức lớn trong điều trị nhiễm trùng Sự xuất hiện của vi khuẩn kháng đa thuốc là vấn đề đáng lo ngại của thế giới đối với sức khỏe con người Từ những năm 2000, nhiều nghiên cứu cho thấy các chủng vi khuẩn

thuộc họ Enterobacteriaceae có khả năng sinh ra các enzym β – lactamase phổ rộng

(Extended – Spectrum Beta – Lactamase; ESBLs) ly giải hầu hết các kháng sinh phổ rộng thuộc nhóm cephalosporin (Tabbene và cs., 2009) Tại Việt Nam nói chung cũng như Thành phố Hồ Chí Minh nói riêng, nghiên cứu nhiễm khuẩn trên bệnh nhân cho

thấy có trên 50 % E coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp tiết ESBL (Nguyễn Thanh

Bảo và cs, 2011) Ở nước ta, nhiều báo cáo cho thấy tình trạng kháng kháng sinh ở mức báo động tại tất cả các bệnh viện, các vi khuẩn Gram âm gây bệnh đang chiếm ưu thế

với tỷ lệ khoảng 70 % và thường gặp là họ Enterobacteriaceae (E coli, K pneumoniae, A baumanii, P aeruginosa (Bộ Y tế, 2015) Tại Bệnh viện Trung ương Huế tỷ lệ E coli sinh ESBL năm 2006 là 41,5%, tỷ lệ sinh ESBL II của E coli ở Bệnh viện Bạch Mai năm 2005 là 18,5% và ở Bệnh viện Chợ Rẫy thì tỷ lệ E coli sinh ESBL năm 2005 là

51,6% (Nguyễn Thị Hương, 2016) Do đó, các hợp chất mới được điều chế để điều trị và kiểm soát nhiễm trùng bởi các vi sinh vật này đã được phát triển và nghiên cứu rộng rãi

Để đối phó với tình trạng đề kháng kháng sinh, nhiều nhà nghiên cứu đã nghiên cứu các sản phẩm tự nhiên có nguồn gốc từ thực vật cho các loại thuốc kháng sinh và

phương pháp điều trị thay thế (Guo và cs., 2018) Kháng sinh được sản xuất chủ yếu từ

các vi khuẩn Gram dương trong đất, đặc biệt là vi khuẩn Bacillus Giống như vi khuẩn lactic, chi Bacillus bao gồm nhiều loài công nghiệp đã được Cục Quản lý thực phẩm và

Dược phẩm công nhận là an toàn (GRAS) (Aunpad và cs., 2011) Có nhiều dự án nghiên

cứu về các hợp chất kháng khuẩn được sản xuất bởi Bacillus subtilis đã được thực hiện Các hợp chất kháng khuẩn được sản xuất bởi B subtilis và B pumilus đối với Staphylococcus aureus và Micrococcus luteus đã được quan sát ở pH 8,5 và 5% glucose

sau 24 giờ ủ ở 30oC (Awais và cs., 2007) Bacillus subtilis MTCC-8114 tạo ra peptide kháng nấm và làm kháng sinh ức chế các loài vi khuẩn Microsporum fulvumand Trichophyton (Kumar và cs., 2009) Một số hợp chất chống MRSA được phân lập từ vi khuẩn Bacillus sp bao gồm: Bogorol A, một kháng sinh peptide cationic từ Bacillus laterosporus PNG276 và Loloatins A, B, C và D từ Bacillus sp MK-PNG-276A

(Jeyanthi và cs., 2016)

Xuất phát từ những lý do trên đề tài “KHẢO SÁT HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH

SINH HỌC KHÁNG E COLI SINH β – LACTAMASE PHỔ RỘNG (ESBL) TỪ CHỦNG BACILLUS SP RD26 NỘI SINH” đặt ra là rất cần thiết có ý nghĩa cả về lý

luận và thực tiễn, đối với nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chủng Bacillus sp RD26

được phân lập từ cây Diệp Hạ Châu Đắng được thừa kế từ công trình nghiên cứu trước

(Dương Nhật Linh và cs., 2018), đã được nghiên cứu đánh giá khả năng kháng E coli

sinh ESBL cũng như tối ưu hóa môi trường để sinh ra hợp chất có nhiều kháng khuẩn cao

Mục tiêu đề tài:

Khảo sát hợp chất có hoạt tính sinh học kháng E coli sinh 𝛽 – lactamase phổ rộng (ESBL) từ chủng Bacillus sp RD26 nội sinh

Nội dung đề tài:

- Xác định khả năng kháng E coli sinh 𝛽 – lactamase phổ rộng (ESBL) từ dịch

ngoại bào và nội bào của chủng Bacillus sp RD26

- Nuôi cấy và thu nhận cao chiết Bacillus sp RD26 từ các hệ dung môi khác

nhau

- Xác định hoạt tính kháng khuẩn từ các cao chiết thô

- Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết đối với vi khuẩn gây

bệnh E coli sinh ESBL

- Khảo sát các phân đoạn cắn bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC - Sắt ký cột cao chiết

- Khảo sát khả năng kháng E coli sinh ESBL của các cao chiết thu được và các

phân đoạn nhỏ

- Tinh sạch hợp chất có hoạt tính sinh học có khả năng kháng E coli sinh ESBL

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN E coli

E coli phân lập lần đầu tiên bởi Escherich vào năm 1885 Vi khuẩn này có mặt rất

sớm ở đại tràng sau 3 giờ trẻ sinh ra Bình thường chúng góp phần tiêu hóa thức ăn, phân

giải muối mật, giữ thăng bằng hệ vi khuẩn đường ruột E coli chiếm 80% các vi khuẩn hiếu khí ở đại tràng Trong đường tiêu hóa, E coli chiếm khoảng 80% các vi khuẩn hiếu

khí

Năm 1885, tại München (Đức), một bác sĩ nhi khoa tên là Theodor Escherich rất quan tâm đến những phát hiện quan trọng của Louis Pasteur và Robert Kock về vi khuẩn Cùng với việc nghiên cứu bệnh tiêu chảy, Escherich tỏ rõ mối lưu ý tới một vi sinh vật đường ruột trẻ em qua nhiều thí nghiệm lâm sàng Vi khuẩn do Escherich phát hiện từ

trong tã lót của trẻ em được công bố với tên gọi đầu tiên là Bacterium coli commune

Chỉ 4 năm sau vi khuẩn này được giới chuyên môn đổi tên thành Escherich nhằm tri ân

người có công khám phá Tuy nhiên, nó vẫn được gọi bằng tên Bacillus coli vào năm 1895 và Bacterium coli vào một năm sau đó, Sau nhiều kiểu gọi, đến năm 1991, vi khuẩn mới được định danh thống nhất toàn cầu là E coli

Vi khuẩn E coli sống ở khắp nơi trong môi trường và đặc biệt phổ biến ở động vật Ở người, E coli sống trong các bộ phận của cơ thể, chẳng hạn như ruột và đường hô hấp

Trong ruột, vi khuẩn thường sống hòa bình và giúp tổng hợp các loại vitamin K và B

Hiện nay đã có hàng trăm chủng vi khuẩn E coli Chúng được phân loại và đánh số bởi các kháng nguyên Một số trong các vi khuẩn E coli có gen, hoặc thông qua các đột biến

hoặc từ các sinh vật khác, cho phép sản xuất chất độc có hại cho con người Nếu chúng ta ăn phải những dòng vi khuẩn có hại, giống như 0157: H7, chúng có thể gây bệnh bằng cách sản sinh ra những chất độc hóa học mạnh mẽ, hay độc tố Tuy nhiên, hầu hết các

chủng E coli là vô hại và sống trong ruột của con người và động vật khỏe mạnh

E coli thường được các nhà khoa học sử dụng như một công cụ nghiên cứu cơ bản

vì nó phát triển nhanh chóng Các nhà nghiên cứu sử dụng chúng như một sinh vật mô

hình tương tự như vi khuẩn gây bệnh khác Khi ăn thực phẩm nhiễm E coli hoặc trực

tiếp tiếp xúc với phân có chứa E coli, vi khuẩn vào cơ thể như dạ dày và ruột non, và

thường gắn với bề mặt bên trong của ruột già Độc tố, hoặc các chất độc tiết ra của vi khuẩn gây sưng thành ruột, gây bệnh đường tiêu hóa nghiêm trọng như viêm ruột kết xuất huyết (Hemorrhagic colitis) (Nguyễn Thanh Bảo)

Phân loại theo khóa phân loại quốc tế

Escherichia coli được phân loại như sau: (Dowrkin,2006)

Giới: Bacteria

Ngành: Proteobacteria Lớp: Gammaproteobacteria Bộ: Enterobacteriaceae

Chi: Escherichia Loài: Escherichia coli

Hình thái và đặc điểm nuôi cấy Hình thái

Trực khuẩn Gram âm, dài hay ngắn tùy thuộc môi trường nuôi cấy Một số di động,

một số lại bất động Một số có nang Vi khuẩn không sinh bào tử E coli có kích thước

trung bình 2 – 3 µm x 0,5 µm

Hình 1.1 Hình ảnh nhuộm Gram vi khuẩn E coli

Đặc điểm nuôi cấy

E coli là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, phát triển dễ dàng trên các môi

trường nuôi cấy thông thường Nhiệt độ thích hợp là 350C – 370C, tuy nhiên có thể tăng

trưởng từ 100C – 460C (Nguyễn Thanh Bảo)

Trong môi trường thạch thường, sau 18 – 24 giờ khuẩn lạc có đường kính khoảng 1,5 mm, dạng S: tròn, bờ đều lồi bóng, không màu hoặc màu xám nhạt Có thể gặp

khuẩn lạc dạng M hoặc R E coli mọc dễ dàng trên môi trường Maconkey, EMB, … Một số chất ức chế sự phát triển của E coli như chlorine và dẫn xuất, muối mật, brilliant

green, sodium deoxycholate, sodium tetrathionate, selenite, … (Đoàn Thị Nguyện, 2010)

Nhiễm khuẩn đường tiểu: 90% trường hợp nhiễm khuẩn đường tiểu lần đầu tiên ở

phụ nữ là do E coli với các triệu chứng tiểu lắc nhắc, tiểu đau, tiểu ra máu, tiểu ra mủ

Có thể đưa tới nhiễm khuẩn bọng đái, thận, cơ quan sinh dục và nhiễm khuẩn huyết Nhiễm khuẩn huyết: khi sức đề kháng của cơ thể giảm, vi khuẩn vào máu gây nhiễm khuẩn máu

Viêm màng não: E coli chiếm khoảng 40 % trường hợp gây viêm màng não ở trẻ

sơ sinh, 75 % trong số đó có kháng nguyên K1

Tiêu chảy: những chủng E.coli liên quan đến tiêu chảy thuộc các nhóm EPEC,

ETEC, EIEC, VTEC

Tình hình đề kháng kháng sinh

Trong những năm gần đây, tốc độ gia tăng tính kháng kháng sinh của vi khuẩn

E coli đã được báo cáo nhiều ở các nước phát triển và cả những nước đang phát triển

(Thi Thu Hao Van và cs., 2007) Tại Việt Nam, theo số liệu giám sát trong năm 2012 tại

bệnh viện Nhiệt đới Trung ương tỉ lệ kháng ampicillin của E coli lên tới 81,4 %; kháng

amoxicillin/clavulanic và ampicillin / sulbactam khoảng 40 % Các kháng sinh nhóm cephalosporin thế hệ 3 cũng bị kháng đến gần một nửa và nhóm fluoro – quinolon cũng bị kháng khoảng 45 % (Trần Thị Thùy Giang và cs, 2014)

Tỉ lệ bệnh nhân tử vong liên quan đến nhiễm trùng do E coli trên thế giới mỗi năm

rất cao và gia tăng Trong những năm gần đây, các chủng vi khuẩn kháng thuốc ngày càng nhiều và đề kháng kháng sinh do vi khuẩn Gram âm sinh beta-lactamase phổ rộng

là vấn đề được quan tâm nghiên cứu trên thế giới, đặc biệt là E coli sinh beta-lactamase phổ rộng (E coli sinh ESBL) (Bùi Thị Lê Minh và cs., 2018)

Ở Việt Nam, một số kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy E coli sinh ESBL hiện

diện trên bệnh nhân khá cao Kết quả khảo sát trực khuẩn Gram âm sinh beta-lactamase phổ rộng phân lập tại Bệnh viện Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh cho thấy tỉ lệ

nhiễm vi khuẩn sinh ESBL chiếm 32,4%, trong đó E coli chiếm tỉ lệ cao 71,2% và các

chủng vi khuẩn sinh ESBL đề kháng cao với các nhóm kháng sinh aminoglycosides (trừ amikacin) và fluoroquinolones Một nghiên cứu khác tại bệnh viện Chợ Rẫy cho thấy 174 mẫu phân của bệnh nhân không nhiễm khuẩn tiêu hóa đến khám bệnh có 133 mẫu

(76,4%) có vi khuẩn sinh ESBL và chủ yếu là E coli 65,8% (Võ Thị Chi Mai và ctv.,

2010) (Bùi Thị Lê Minh và cs., 2018)

Theo báo cáo sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh tại 15 bệnh viện Việt Nam

năm 2008 – 2009, đã cho thấy tỷ lệ sinh ESBL của các chủng E coli và Klebsiella dao

động giữa các bệnh viện, cao nhất ở bệnh viện Nhiệt đới Trung ương với 54,7 % trên

E coli và 72,7 % Klebsiella (bệnh viện đầu ngành về bệnh truyền nhiễm), sau đó là bệnh

viện Chợ Rẫy với 49 % và 58,2 % (bệnh viện đa khoa lơn nhất khu vực phía Nam), bệnh viện Việt Đức với 57,3 % và 48,5 % (bệnh viện chuyên khoa về phẫu thuật), bệnh viện Bình Định và 2 bệnh viện Nhi (Nhi Trung ương và Nhi Đồng I) với tỷ lệ gần 40 % trên

E coli và 50 % trên Klebsiella Đây cũng là các bệnh viện có tỷ lệ E coli và Klebsiella

kháng cephalosporins thế hệ 3 cao hơn các bệnh viện khác (GARP – Vietnam, 2010)

VI KHUẨN Bacillus

Lịch sử vi khuẩn Bacillus

Vi khuẩn Bacillus có một lịch sử lâu dài và phong phú trong các tiểu sử vi sinh vật

Trong những năm 1870, Ferdinand Cohn, làm việc tại Đại học Breslau, đã cô lập thành

công một bacterium nhỏ gọn, linh hoạt, hiếu khí Ông đặt tên nó là Bacillus subtilis, có nghĩa là “que mỏng” Cohn đã mô tả chính xác về chu kỳ sống của Bacillus, chứng minh sự hình thành, khả năng chịu nhiệt, nảy mầm và sự phát triển của endospores (Cohn và cs., 1872) Khi Robert Koch thành lập một sinh vật tương tự về mặt hình thái, B anthracis là tác nhân gây bệnh than (Koch và cs., 1876), tầm quan trọng của khoa học

về nhóm sinh vật mới này đã trở nên rõ ràng Trong 50 năm tới, nhiều vi khuẩn hình

thành endospore mới đã được xác định Tuy nhiên, do công cụ còn hạn chế, việc đặt tên

và phân loại các loài vi khuẩn này còn rất khó khăn Thách thức lớn nhất của việc đưa ra

thứ tự phân loại Bacillus đã được đặt ra với sự suy luận đáng ngưỡng mộ của Nathan R

Smith, Francis E Clark, và Ruth E Gordon trong những năm 1930 và 1940 Họ đã sử dụng giống, bao gồm “vi khuẩn hình que có khả năng hình thành các tế bào endospores khúc xạ có khả năng kháng hơn các tế bào thực vật để làm nóng, khô và các cơ quan phá

hoại khác” (Gordon và cs., 1973a) Smith lắp ráp một bộ sưu tập 1134 chủng Bacillus mesophilic mang 158 tên loài khác nhau Với các đồng nghiệp của mình, ông bắt đầu tập

hợp một số dữ liệu hình thái và sinh lý học tỉ mỉ, khắt khe trên từng dòng Sau khi phân tích dữ liệu - với sự thiên về cố ý đối với việc "gộp" chứ không phải là "tách" họ đã gép từng nhóm phân lập cho một trong 19 loài được xác định chặt chẽ (Smith và cs., 1946)

Ngay sau đó, Gordon và Smith lặp lại quá trình với một bộ sưu tập 206 chủng Bacillus

nhiệt phân, chỉ định chúng cho hai loài bổ sung (Gordon và cs., 1949)

Năm 1973, trong chuyên khảo cổ điển của chi Bacillus (Gordon và cs., 1973b),

Ruth Gordon và các đồng nghiệp đã cung cấp các mô tả chi tiết, chính xác cho 18 loài

Bacillus Phân loại Bacillus đã phát triển thành khoa học hợp lý, có trật tự và sáng suốt

Phân Loại

Theo khóa phân loại Bergey, Bacillus được phân loại như sau:

Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes

Lớp: Bacilli

Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae

Chi: Bacillus Hình 1.2 Hình vi thể của Bacillus

Hình dạng và kích thước

Bacillus là một trong những vi sinh vật đầu tiên được phát hiện và mô tả trong giai

đoạn đầu của tiến trình phát triển ngành vi sinh vật học ở cuối thế kỷ 19 Đây là một chi lớn với gần 200 loài vi khuẩn hiếu khí, hình que, có khả năng sinh nội bào tử để chống

chịu các điều kiện bất thường của môi trường sống Bacillus phân bố rộng rãi trong các

hệ sinh thái tự nhiên: từ trên cạn đến dưới nước, từ nước ngọt đến nước mặn và từ vùng ven bờ đến đáy các Đại Dương (Trịnh Thành Trung và cs., 2013) Tuy nhiên, cũng có

một số loài Bacillus không tạo bào tử như B thermoamylovorans, B halodenitrificans, một số khác có gram âm hay gram dương yếu như B horti, B oleronius, … Thêm vào

đó, khi phân loại dựa vào giải trình DNA – ARN, dạng vi khuẩn không tạo bào tử, kỵ

khí bắt buộc cũng thuộc nhóm Bacillus như B infernus Tế bào sinh dưỡng Bacillus

thường có đầu vòng hay vuông, kích thước từ 0,5 – 1,2 x 2,5- 10 𝜇𝑚, ở dạng đơn lẻ hay

chuỗi ngắn hoặc dài Đối với Bacillus có nội bào tử thì bào tử hình trụ, oval, tròn, thỉnh

thoảng có hình bầu dục Tùy theo loài, bào tử có thể nằm ở giữa, gần cuối hoặc ở cuối, và bào tử phồng hoặc không phồng (Nguyễn Đức Quỳnh Như và cs., 2009; Nguyễn Văn Thanh và cs., 2009)

Đặc điểm nuôi cấy

Vi khuẩn Bacillus là loài ưa muối, chúng có khả năng chịu đựng và sống xót ở tất

cả các nồng độ muối 0.5% và 6% với tỷ lệ mật độ vi khuẩn dao động không đáng kể

Ngoài ra, Bacillus phát triển tốt nhất và cho khả năng đối kháng mạnh nhất với E ictaluri ở nồng độ muối 3% trong môi trường nuôi Bacillus có khả năng tiết cellulase, amylase,

và caseinase nhằm phân hủy cellulose, tinh bột và đường trong ruột cá giúp tăng cường tiêu hóa thức ăn (Hồ Thị Trương Thi và cs., 2011)

Phần lớn các loài Bacillus là sinh vật hóa dị dưỡng linh hoạt, có khả năng hô hấp

trong khi sử dụng nhiều hợp chất hữu cơ đơn giản (đường, amino acid, acid hữu cơ) Trong một số trường hợp, chúng còn có thể lên men carbohydrate trong một phản ứng

hỗn hợp tạo ra glycerol và butanediol Một số ít loài như B megaterium không đòi hỏi

tác nhân tăng trưởng hữu cơ, một số khác lại cần có amino acid, D-vitamin hay cả hai Phần lớn chúng ưa nhiệt độ trung bình, khoảng nhiệt độ tối đa cho sự phát triển của tế bào dinh dưỡng từ 25 - 75ºC, nhiệt độ tối ưu là 30 – 45oC, khoảng pH rộng 2 - 11 Trong

phòng thí nghiệm, với điều kiện tối ưu, thời gian thế hệ của Bacillus vào khoảng 25 phút

măng liên kết đất, chuyển hóa đất thành đá làm vững nền móng các tòa nhà và giúp

chúng chịu được động đất Trong chế phẩm sinh học, Bacillus thuringiensis được dùng làm thuốc trừ sâu vi sinh Bacillus thuringiensis sp làm chế phẩm Israelensis serotype

H14 diệt lăng quăng Do khả năng tạo bào tử chịu nhiệt, sinh các loại enzym ngoại bào

và khả năng đối kháng với các vi sinh gây bệnh như Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae, Candida albicans, E coli, S aureus, Shigella, Vibrio spp, … nên Bacillus spp được sử dụng làm probiotic trong chăn nuôi và thủy sản, Bacillus

subtilis dùng làm chế phẩm phòng và điều trị viêm tai mũi họng ở người (Berkeley và

cs., 2002)

Bacillus mang lại nhiều lợi ích cho việc bảo vệ chống lại những nguồn bệnh do vi

khuẩn và vi nấm gây ra bởi khả năng hình thành nội bào tử của chúng và hoạt tính kháng

sinh phổ rộng Bacillus sản xuất ra 167 hợp chất sinh học chống lại vi khuẩn, nấm, động

vật nguyên sinh và virus Các hợp chất này thường là enzym thủy phân hay là các peptid có hoạt tính sinh học hoặc các hợp chất polyketide Dưới điều kiện sống thiếu dinh dưỡng

Bacillus còn có khả năng sinh các loại kháng sinh peptid như surfactin vừa có tính kháng

khuẩn, vừa có hoạt tính mạnh (Kumar và cs., 2009; Hong và cs., 2005)

Bacillus subtilis đã dẫn đầu trong việc trở thành vi khuẩn Gram dương đầu tiên có

bộ gen được giải trình tự và chú thích (Kunst và cs., 1997) Với trình tự bộ gen trong tay, điều này đã dẫn đến việc thiết lập các thư viện loại bỏ gen (Kobayashi và cs., 2003; Schumann và cs., 2001), toàn bộ hệ genome (Caldwell và cs., 2001), cơ sở dữ liệu nguyên tố điều tiết (Makita và cs., 2004), xác định nửa đời mRNA toàn cầu (Hambraeus và cs., 2003), xác định genome tối thiểu (Westers và cs., 2003), tất cả đều cung cấp

những hiểu biết vô giá về B subtilis

Hợp chất từ Bacillus có hoạt tính sinh học

Bacillus mang lại nhiều lợi ích cho việc bảo vệ chống lại những nguồn bệnh do vi

khuẩn và vi nấm gây ra bởi khả năng hình thành nội bào tử của chúng và hoạt tính kháng

sinh phổ rộng Bacillus sản xuất ra 167 hợp chất sinh học chống lại vi khuẩn, nấm, động

vật nguyên sinh và virus Các hợp chất này thường là enzym thủy phân hay là các peptid có hoạt tính sinh học, hoặc các hợp chất polyketide (Kumar A và cs, 2009)

Bacillus có khả năng sinh các chất chuyển hóa sơ cấp như nucleotide xanthanylic acid, inosinic acid, guanilic acid, … Dưới điều kiện sống thiếu dinh dưỡng Bacillus còn

có khả năng sinh các loại kháng sinh peptid như surfactin vừa có tính kháng khuẩn, vừa có tính diện hoạt mạnh, hay subtilin có hoạt tính kháng khuẩn và kháng khối u (Toure Y và cs, 2004; Hong và cs, 2005)

Năm 2006, Nalisha và cộng sự tiến hành nghiên cứu nhằm mục đích điều tra đặc

điểm của hợp chất hoạt tính sinh học được sản xuất bởi Bacillus subtilis chống lại Sclerotium rolfsii - loại nấm gây bệnh trên thực vật

Những loại peptide kháng khuẩn được sản xuất bởi các chủng Bacillus spp bao

gồm nhiều lớp bacteriocin (Klaenhammer., 1993) Trong số những hoạt chất sinh học kháng khuẩn hoạt động bề mặt, lipopeptide chứa peptide từ 7 - 10 acid amin, được gắn kết theo chu kỳ thông qua một vòng lacton với một acid béo β - hydroxy cùng với độ dài chuỗi khác nhau

Năm 2015, Torres và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm hoạt tính từ chủng Bacillus

sp., phân lập từ mật ong, có hoạt tính kháng khuẩn chống lại ba loại vi khuẩn gây bệnh

Listeria monocytogenes, B cereus và Staphylococcus aureus ATCC29213

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ HỢP CHẤT TỪ BACILLUS Tình hình nghiên cứu về hợp chất từ Bacillus trên thế giới

Kim và cộng sự đã tách chất ức chế β-lactamase từ vi khuẩn sống trong mô thực

vật, nhóm nghiên cứu đã phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sống trong mô thực vật của 25 loài thực vật khác nhau và phân lập được 600 chủng vi khuẩn Trong đó đã tìm ra được

10 chủng có hoạt tính mạnh và có khả năng kháng nấm Candida albicans (Kim và cs.,

2000)

Năm 2000, Strobel và cộng sự đã nghiên cứu về vai trò của xạ khuẩn nội sinh

Streptomyces sp chủng NRRL 30562 được tách chiết từ cây Kennedianigricans, sản xuất kháng sinh phổ rộng munumbicin, kháng vi khuẩn Gram (+) như Bacillus anthracis, M Tuberculosis đa kháng và một số vi khuẩn kháng thuốc khác (Strobel và cs.,

2000)

Nghiên cứu của Phongpaichit (2006) đã thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của

dịch lên men vi nấm nội sinh từ Garcinia spp., kết quả cho thấy từ 377 trong số 1979 vi nấm phân lập có khả năng kháng S aureus, MRSA, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, (Phongpaichit, 2006)

Năm 2008, Olfa Tabbene và cộng sự nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của chủng

Bacillus subtilis B38 đối với vi khuẩn kháng thuốc MRSA Đến năm 2010, Olfa Tabbene

và cộng sự đã nghiên cứu xác định được hợp chất S07 - 2, đây là một hợp chất kháng

khuẩn có khối lượng phân tử là 905,6 Da có thể kháng Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis và Listeria monocytogenes (Tabbene và cs., 2009)

Theo nghiên cứu của Arun và cộng sự đã phân lập các chủng vi khuẩn và vi nấm

từ Terminalia arjuna, Azadirachta indica và Catharanthus roseus, trong đó chủng vi khuẩn NRL2 có hoạt tính kháng cao đối với chủng Staphylococcus aureus và dịch chiết

thô từ chủng vi khuẩn này cũng có khả năng kháng MRSA (Arun và cs., 2015)

Năm 2016, các nhà nghiên cứu tìm thấy một loài bọt biển ở Nam Cực, có tên gọi

Dendrilla membranosa, các xét nghiệm ban đầu cho thấy chất này có thể tiêu diệt 98,4%

các tế bào MRSA Các nhà khoa học trên thế giới đã bước đầu nghiên cứu và tìm ra được

một số hợp chất kháng khuẩn từ các vi sinh vật nội sinh kháng MRSA (Michael và cs.,

2017)

Năm 2017, Michael và cộng sự đã phát triển được một giải pháp để đẩy lùi kháng

thuốc kháng sinh và ngăn chặn các bệnh nhiễm trùng như Staphylococcus aureus kháng

Methicillin (MRSA) Nhóm nghiên cứu đã thiết lập 45000 hợp chất, sử dụng cấu trúc ba chiều của ribosome ty thể Nhóm nghiên cứu đã xác định 800 phân tử nhỏ có thể ức chế ty thể dựa trên đặc điểm cấu trúc của chúng và sau đó giảm bớt xuống còn 10 hợp chất nhờ sử dụng phương pháp sàng lọc thuốc theo kiểu hình truyền thống Kết quả của họ

đã ức chế một phổ rộng 2 loại vi khuẩn thông thường, bao gồm Streptococcus, Pseudomonas (Michael và cs., 2017)

Tình hình nghiên cứu về hợp chất từ Bacillus ở Việt Nam

Tại Việt Nam, đã có một số công trình nghiên cứu trong nước hiện nay Năm 2009,

Trần Thị Như Hằng và cộng sự nghiên cứu về vi nấm nội sinh trên cây Khổ Sâm (Croton tonkinensis Gapnep) và Bùm Bụp (Mallotus apelta (Lour) thu được chủng nấm Trichoderma konilangbra KS14 sản sinh chất ergosterol, ergosterol peroxide, sorbicillin

cho hoạt tính kháng vi sinh vật, chống oxy hóa và hoạt tính enzyme ngoại bào, sorbicillin

có khả năng kháng S aureus với MIC = 25mg/ml (Trần Thị Như Hằng và cs., 2009)

Năm 2015, một nghiên cứu phát hiện các hợp chất kháng lao và kháng sinh từ nguồn vi sinh vật đáy biển vùng Đông bắc Việt Nam Kết quả nghiên cứu đã xác định có 5 hợp chất mới (G016-1, G016-2, G057-1, G019-1 và G019-2) và 4 hợp chất mới lần

đầu phân lập từ tự nhiên (G057-2, G057-3, G115-1 và G115-2) Một nhóm nghiên cứu

đã tiến hành đánh giá sàng lọc và phát hiện 1 chủng xạ khuẩn Micromonospora sp G006,

phân lập từ mẫu trầm tích tại Vịnh Hạ Long, có khả năng sản sinh hoạt chất chloramphenicol (G016-1) - một hoạt chất đang được sử dụng làm thuốc kháng sinh, là tiền đề cho việc nghiên cứu sản xuất kháng sinh chloramphenicol (Phạm Văn Cường, 2015)

Năm 2016, Phan Thị Hoài Trinh và cộng sự đã sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn của 50 chủng vi khuẩn phân lập từ 23 loài bọt biển thu thập từ vùng đảo Phú Quốc Chủng vi khuẩn 045 – 203 - 4 thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh với 6 chủng vi khuẩn gây

bệnh cho người và sinh vật biển, đó là Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Bacillus cereus và Streptococcus faecalis Nghiên cứu cho thấy,

vi khuẩn phân lập từ bọt biển tại vùng đảo Phú Quốc có triển vọng là nguồn tiềm năng để nghiên cứu và ứng dụng các hợp chất có hoạt tính sinh học (Phan Thị Hoài Trinh và cs., 2016)

Năm 2018, Dương Nhật Linh và cộng sự đã chọn được ba yếu tố ảnh hưởng chính

đến hoạt tính kháng khuẩn của chủng Bacillus sp RD26 gồm: peptone, glucose, CaCO3, MgSO4 Sử dụng phương pháp khuếch tán bề mặt Box-Benhken đã xác định được giá trị tối ưu thành phần môi trường năng cao hoạt tính kháng khuẩn với 7,36 g/L peptone, 15 g/L glucose, 0,72 g/L CaCO3 và 0,6 g/L MgSO4 Kết quả so sánh trên môi trường tối ưu cho khả năng kháng vi khuẩn MRSA bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch tăng 1,3 lần so với trước khi tối ưu sau 36 giờ nuôi cấy (Dương nhật Linh và cs., 2018)

PHƯƠNG PHÁP CHIẾT

Đặc điểm chung của phương pháp

Chiết là quá trình chuyển chất tan từ pha này sang pha khác dựa trên tính tan khác nhau của chất tan trong hai pha

Lý do phổ biến để thực hiện quá trình chiết trong phân tích hóa học là để tách hay làm giàu chất phân tích, hay tách nó ra những chất có thể gây nhiều trong phân tích Phổ biến nhất là quá trình chiết giữa dung môi nước và dung môi hữu cơ

Các dung môi hữu cơ là những hợp chất ít phân cực nên thường không tan trong nước, chất có độ phân cực rất lớn

Dietyl ete, toluen, hexan là các dung môi có tỉ trọng nhỏ hơn nước, chúng nổi ở trên pha nước CHCl3, CH2Cl2, CCl4 là các dung môi phổ biến có tỷ trọng lớn hơn nước Trong hỗn hợp hai pha, một pha nước chiếm ưu thế, pha kia dung môi chiếm ưu thế

Qúa trình chiết thường xảy ra với vận tốc lớn nên có thể thực hiện quá trình chiết tách, chiết làm giàu một cách nhanh chóng, đơn giản Sản phẩm chiết thường quá sạch Vì các lý do đó, ngày nay phương pháp chiết không chỉ ứng dụng trong phân tích mà còn được sử dụng vào quá trình tách, làm giàu trong sản xuất công nghiệp (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Kĩ thuật chiết lỏng-lỏng

Kỹ thuật chiết lỏng- lỏng thường được áp dụng để:

- Chiết hợp chất cần quan tâm ra khỏi dung dịch ban đầu

- Phân chia cao alcol thô ban đầu có chứa quá nhiều loại hợp chất từ không phân cực đến rất phân cực thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau

Việc chiết lỏng-lỏng được thực hiện bằng bình lóng Sử dụng lần lượt các dung môi hữu cơ, loại không hòa tan với nước hoặc loại có thể hỗn hợp được với nước, để chiết ra khỏi hợp chất có tính phân cực khác nhau (tùy vào độ phân cực của dung môi) Tùy vào tỷ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu cơ nằm ở lớp trên hoặc ở dưới so với pha nước

Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung môi phân cực như eter dầu hỏa hoặc hexan, eter etyl, cloroform, etyl acetat, butanol… Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ dung môi, chiết đến khi không còn chất hòa tan dung môi thì đổi sang dung môi có tính phân cực hơn Dung dịch của các lần chiết được gom chung lại, làm khan nước với các chất làm khan như Na2SO4, MgSO4, CaSO4, …, đuổi dung môi thu được cao chiết

Muốn kiểm tra xem các hợp chất nào đã được chiết vào pha hữu cơ cũng như các hợp chất nào còn ở lại trong pha nước và chiết bao nhiêu lần thì hoàn tất, có thể sử dụng sắc ký lớp mỏng Trên bản mỏng cần được so sánh đồng thời vết của pha nước và của pha hữu cơ Sự chiết bởi một dung môi cụ thể nào đó được gọi là hoàn tất khi lần chiết thứ n trên bản mỏng không còn nhìn thấy vết của chất đó trong pha nước cũng như trong pha hữu cơ Cũng có thể kiểm tra bằng cách nhỏ một giọt dung dịch chiết lần thứ n lên trên một tấm kiếng sạch, sau khi bay hết dung môi, không còn để lại vết gì trên phiến kiếng

Lưu ý: sự chiết lỏng-lỏng cần thực hiện ở nhiệt độ phòng, nếu gia tăng nhiệt độ cho dung môi thì khả năng hòa tan của dung môi sẽ tăng lên và nguyên tắc nêu trên sẽ có nhiều sự thay đổi (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Sắc ký cột

Sự sắc ký là một phương pháp vật lý để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất đó đối với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha tĩnh)

Việc tách hai hợp chất nào đó ra riêng có đạt được kết quả tốt hay không là tùy vào hệ số phân chia Bất kỳ một hợp chất nào khi được đặt vào một hệ thống gồm có hai pha, lúc đạt đến trạng thái cân bằng, hợp chất đó sẽ phân bố vào mỗi pha với một tỷ lệ nồng độ cố định, tỉ lệ này thay đổi tùy vào các tính chất động học của hợp chất và của cả hai pha

Hệ số phân chia K được biểu diễn như sau:

K = 𝐶𝑠

𝐶𝑚 = 𝑁ồ𝑛𝑔 độ 𝑐ủ𝑎 ℎợ𝑝 𝑐ℎấ𝑡 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑝ℎ𝑎 𝑡ĩ𝑛ℎ𝑁ồ𝑛𝑔 độ 𝑐ủ𝑎 ℎợ𝑝 𝑐ℎấ𝑡 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑝ℎ𝑎 độ𝑛𝑔

Cũng tương tự, một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất khác nhau khi được đặt vào một hệ thống gồm có 2 pha, mỗi loại hợp chất sẽ có ái lực riêng của nó đối với hai pha, vì thế sẽ có tương tác mạnh hay yếu Hệ quả là mỗi loại hợp chất sẽ di chuyển ngang qua pha tĩnh với một vận tốc khác nhau, nhờ vậy, kỹ thuật sắc ký có thể tách riêng các loại hợp chất (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng hay còn gọi là sắc ký phẳng là kỹ thuật phân bố rắn-lỏng Trong đó pha động là chất lỏng được xuyên qua một lớp chất hấp thụ trơ như silicagel hoặc nhôm oxit, chất hấp thụ này được tráng thành một lớp mỏng, đều phủ lên một nền phẳng như tấm kính, tấm nhôm, hoặc tấm plastic Sắc ký lớp mỏng được dùng trong cả phân tích định tính và phân tích định lượng Hệ số di chuyển Rf là đại lượng đặc trưng quan trọng về mức độ tách Hệ số di chuyển được tính theo công thức sau:

Rf = 𝑙𝑙

𝑜 hoặc Rf = 𝑣𝑣𝑜Trong đó:

l: Khoảng cách từ tuyến xuất phát tới tâm vệt sắc ký lo: Là khoảng cách từ tuyến xuất phát tới tuyến dung môi v: Tốc độ di chuyển của chất tan

vo: Tốc độ của dung môi

Như vậy Rf chỉ có giá trị từ 0 đến 1 Khi Rf = 0 thì chất tan hoàn toàn không di chuyển, còn khi Rf = 1 thì chất tan di chuyển bằng tốc độ của dung môi Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến Rf nhưng quan trọng là:

+ Chất lượng và hoạt tính chất hấp thụ + Bề dày của lớp mỏng

+ Chất lượng và độ tinh khiết của pha động

Tiến hành thí nghiệm

Bình khai triển là bình thủy tinh hình trụ cao 25 cm đường kính miệng 10 cm, có nắp đậy kín Bão hòa hơi dung môi trong bình bằng cách lót giấy lọc xung quanh thành trong của bình, rồi rót một lượng vừa đủ dung môi vào bình, lắc rồi để giấy lọc thấm đều dung môi Lượng dung môi sử dụng sao cho sau khi thấm đều giấy lọc còn lại một lớp dày khoảng 5 mm đến 10 mm ở đáy bình Ðậy kín nắp bình và để yên 10 phút ở nhiệt độ phòng

Sử dụng bản mỏng TLC silica gel 60 F254 của hãng Merck được cắt bằng kéo thành bản hình chữ nhật có kích thước 3.5 cm x 12 cm và bản tự chế tạo từ tinh bột sắn dây kích thước 4 cm x 12 cm

Sử dụng ống thuỷ tinh mao quản hoặc micropipet để đưa mẫu lên bản mỏng Thể tích dung dịch từ 0.001 ml đến 0.005 mL đối với trường hợp đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng điểm và từ 0.l – 0.2 mL khi đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng vạch Ðường xuất phát phải cách mép dưới của bản mỏng 1.5 cm – 2 cm và cách bề mặt dung môi từ 0.8 - 1 cm Các vết chấm phải nhỏ, có đường kính 2 – 6 mm và cách nhau 15 mm Các vết ở bìa phải cách bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm để tránh hiệu ứng bờ

Ðặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi khai triển Ðậy kín bình và để yên ở nhiệt độ không đổi Khi dung môi đã triển khai trên bản mỏng được một đoạn, lấy bản mỏng ra khỏi bình, đánh dấu mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại trên bản mỏng rồi chụp ảnh, đo khoảng di chuyển của dung môi và các chất cần tách Tính hệ số Rf (Trần Mạnh Cường, 2011)

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

SVTH: ĐỊNH THỊ THÚY KIỀU

THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Đề tài được thực hiện trong thời gian từ tháng 9 năm 2018 đến tháng 12 năm 2018 tại Phòng thí nghiệm Vi Sinh 01 – Cơ sở 3, Trường Đại Học Mở – Tp Hồ Chí Minh và Phòng 19- phòng các chất có hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ Hóa học, 01 Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, TP HCM

VẬT LIỆU

Chủng vi sinh vật nghiên cứu

Chủng vi khuẩn nội sinh cây Diệp Hạ Châu Đắng (Phyllanthus amarus schum Et thonn) Bacillus sp RD26 được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh,

Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh

Chủng vi khuẩn E coli sinh ESBL 128a được cung cấp bởi Bộ môn Xét nghiệm,

Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh

Môi trường – hóa chất

- Nutrient broth (NB), Nutrient agar (NA), Mueller Hinton Agar (MHA) - Cồn 96o, 70o, NaCl, HCl, NaOH

- Nguồn dinh dưỡng: pepton

- Các muối khoáng: CaCO3, MgSO4

- Các dung môi: n-hexan, ethyl axetat, chlorofrome, dichloromethane, methanol, DMSO

- Nước muối sinh lý 0,85%, nước cất

- Silica gel dạng hạt dường kính 0,04 – 0,06 mm - Sắc ký bản mỏng có tráng sẵn TLC silica gel F254.

Thiết bị và dụng cụ

- Máy ly tâm lạnh - Tủ ấm - Cây cột sắc ký - Máy vortex - Tủ sấy - Kẹp treo cột, giá sắc

- Máy chụp hình - Đĩa petri - Cốc thủy tinh, ống nhỏ giọt

- Kính hiển vi - Máy cô quay - Máy cô quay thu hồi dung môi - Tủ lạnh - Ống đong - Bình cô quay

- Cân điện tử - Ống nghiệm - Giấy lọc

- Tủ cấy - Becher - Phễu, bếp điện hồng ngoại - Các loại micropipette và các đầu típ tương ứng (100 - 1000 𝜇L, 20 – 200 𝜇L) - Một số dụng cụ khác bao gồm: đèn cồn, que cấy tròn, que cấy trang

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Bố trí thí nghiệm

Dựa vào mục tiêu đề tài chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo sơ đồ sau:

SVTH: ĐỊNH THỊ THÚY KIỀU

Sơ đồ 2.1 Bố trí thí nghiệm

Hoạt hóa chủng Bacillus sp RD26

Thu nhận cao chiết từ các hệ dung môi khác nhau (HE, Cl, DI, EA, Me, W)

Xác định hoạt tính kháng khuẩn từ các cao chiết thô

Xác định nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu

(MIC)

Khảo sát các phân đoạn cắn

bằng phương pháp sắc ký

lớp mỏng (TLC)

Xác định khả năng kháng E coli sinh

ESBL từ dịch ngoại bào và nội bào

Thu nhận phân đoạn chứa hợp chất có hoạt tính sinh

học kháng E coli sinh ESBL bằng phương pháp sắc ký

cột cao chiết

Phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc hợp chất có hoạt

tính sinh học có khả năng kháng E coli sinh ESBL Khảo sát khả năng kháng E coli sinh ESBL của cao

chiết từ các hệ dung môi khác nhau

Xác định khả năng kháng E coli sinh ESBL từ dịch ngoại bào và nội bào của chủng Bacillus sp RD26

Xác định khả năng kháng E coli sinh ESBL từ dịch ngoại bào và nội bào của chủng Bacillus sp RD26

Xác định khả năng kháng E coli sinh ESBL từ dịch ngoại bào Bacillus sp RD26 bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch

Chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng kháng khuẩn của chủng Bacillus sp

RD26 thử nghiệm bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch (Kumar và cs., 2009)

1.3.2.2.1 Chuẩn bị môi trường

Môi trường NB và môi trường MHA thử nghiệm được hấp vô trùng ở 121oC / 20 phút Môi trường MHA được đổ đĩa Petri (đường kính 90 mm) với thể tích 15 mL

1.3.2.2.2 Chuẩn bị dịch vi khuẩn E coli sinh ESBL

Chủng vi khuẩn được cấy ria vào thạch NA, ủ 24h ở 37oC

Chọn 1 khuẩn lạc đơn, cấy vào nước muối NaCl 0,85% với thể tích 9,9 mL, dùng máy vortex lắc đều ống

Đem dịch vi khuẩn đo OD ở bước sóng 610 nm, điều chỉnh sao cho có mật độ tế bào tương đương khoảng 108 tế bào/mL, tương ứng với độ đục trong ống

McFarland 0,5 Dịch vi khuẩn E coli sinh ESBL đã chuẩn bị cần được sử dụng trong

vòng 15 phút (Kumar và cs., 2009)

1.3.2.2.3 Chuẩn bị dịch vi khuẩn thử nghiệm

Vi khuẩn được hoạt hóa bằng cách lấy một ít sinh khối từ môi trường thạch nghiêng NA vào bình erlen chứa 20 mL môi trường NB Nuôi cấy lắc ở 37oC / 24 giờ, tốc độ lắc 200 vòng / phút (Chen và cs., 2007) Sau thời gian nuôi cấy, tiến hành ly tâm ở 10000 vòng/ phút ở 4oC trong 10 phút thu dịch nổi Tiến hành thử hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch Tiếp theo, lấy dịch nổi đã ly tâm đem lọc qua màng lọc 0.2 𝜇𝑚 (Shrivastava và cs., 2013)

Đục lỗ đường kính 6 mm trong bản thạch bằng dụng cụ vô trùng

Dùng micropipet hút 100 µL dịch lọc vi khuẩn thử nghiệm bơm vào mỗi giếng Để yên khoảng 15 phút cho dịch vi khuẩn khuếch tán vào lớp thạch

Ủ 24h/ 37oC, đọc kết quả vòng kháng

Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại, thực hiện lần lượt từng dịch chiết được tách từ các dung môi khác nhau (Bexfield A và cs, 2008)

1.3.2.2.5 Kết quả

Vi khuẩn có khả năng kháng khuẩn khi xung quanh lỗ có vòng kháng khuẩn

Hình 2.1 Kết quả kháng khuẩn của vi khuẩn thử nghiệm

Xác định khả năng kháng E coli sinh ESBL từ dịch nội bào Bacillus sp RD26 bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch

1.3.2.3.1 Thu nhận sinh khối Bacillus sp RD26 bằng phương pháp sóng siêu âm

Ly tâm thu sinh khối tế bào ở 10000 vòng/ phút, trong 10 phút ở 4oC Rửa tế bào bằng cách phân tán lại trong 3 mL NaCl 0,9%

Vortex kĩ, ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC

Vòng kháng khuẩn

Chỉnh OD600 = 1 bằng đệm phosphat 0,1M pH = 7 (xác định tỉ lệ thích hợp giữa huyền dịch vi khuẩn và dung dịch đệm)

Bổ sung DTT đến nồng độ 10 mM để giảm quá trình hợp chất của chủng

Bacillus sp RD26 bị oxy hóa, ủ đá để mẫu đạt nhiệt độ 0-5oC

Tán siêu âm 6 lần duy trì nhiệt độ không đổi, mỗi lần tán 30 giây Đầu dò có kích thước dài 9 cm, với chu kì 50% Trước các lần tán siêu âm, mẫu phải đạt nhiệt độ 0-5oC Lấy khoảng 10 μL nhuộm đơn và quan sát trên kính hiển vi để theo dõi hiệu quả phá vỡ tế bào Mẫu sau khi tán siêu âm có thể giữ đông ở -20oC

Ly tâm 10000 vòng/phút ở 4oC trong 10 phút Thu dịch nổi (dịch phá vỡ tế bào chứa enzyme) (Nguyễn Đức Lượng, 2011)

1.3.2.3.2 Tiến hành thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành như mục 1.3.2.1.1, 1.3.2.1.2, 1.3.2.1.4

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần Xử lý thống kê ANOVA một yếu tố bằng phần mềm Statgraphics Plus 3.0

Nuôi cấy và thu nhận cao chiết Bacillus sp RD26 từ các hệ

dung môi khác nhau

Nuôi cấy vi khuẩn Bacillus sp RD26 bằng phương pháp lên men trên môi trường tối ưu

Công thức môi trường tối ưu trong quá trình lên men chủng Bacillus sp RD26

đã được kế thừa từ nghiên cứu trước “Xác định các điều kiện ảnh hưởng và tối ưu

hóa khả năng kháng vi khuẩn kháng thuốc từ chủng vi khuẩn Bacillus sp RD26 được

phân lập từ cây Diệp hạ châu đắng” (Dương Nhật Linh và cs., 2018)

Hoạt hóa giống: Chủng vi khuẩn Bacillus sp RD26 được hoạt hóa bằng cách

lấy một ít sinh khối từ thạch nghiêng trên môi trường NA vào bình erlen chứa 20 mL môi trường NB, nuôi lắc ở 35oC/36h, pH =7, tốc độ lắc 200 vòng/phút

Nhân giống: điều chỉnh dịch khuẩn đạt giá trị OD610 có mật độ tế bào khoảng 108 tế bào/mL Bổ sung 10% thể tích dịch khuẩn Bacillus sp RD26 sau khi hoạt hóa vào 100 mL môi trường tối ưu hóa tương ứng với chủng Bacillus sp RD26 (pepton:

SVTH: ĐỊNH THỊ THÚY KIỀU

7,36 g/L, glucose: 15 g/L, CaCO3: 0,72 g/L, MgSO4: 0,6 g/L) trong bình erlen 100 mL với tỷ lệ 1/20 theo thể tích dùng nuôi lắc ở 35oC/36h, tốc độ lắc 200 vòng/phút (Shrivastava và cs., 2013)

Lên men: bổ sung 10% thể tích dịch khuẩn giống cấp 2 vào môi trường tối ưu hóa tương ứng với chủng vi khuẩn ở 30oC/36h, pH=7.

Thu nhận cao chiết Bacillus sp RD26 từ các hệ dung môi khác nhau

Quy trình điều chế cao phân đoạn

Cao phân đoạn được tiến hành điều chế từ dịch nuôi cấy vi khuẩn bằng cách sử dụng các dung môi có độ phân cực khác nhau như HE, Cl, DI, EA, Me, W với tỉ lệ 1:1 Quy trình điều chế cao phân đoạn được trình bày trong sơ đồ 2.2

Sơ đồ 2.2 Quy trình điều chế cao phân đoạn dịch vi khuẩn

Sau thời gian lên men tiến hành ly tâm ở 10000 vòng/ phút trong 10 phút thu dịch nổi Thu 100 mL dịch khuẩn tiến hành chiết lỏng-lỏng lần lượt với các dung môi: HE, Cl, DI, EA, Me, W với tỉ lệ 1:1 Sau đó thu dung môi kèm với các thành phần kháng khuẩn có trong đó Nhiệt độ cô quay phụ thuộc vào nhiệt độ sôi của dung môi

Dịch khuẩn sau khi lọc

Chiết kiệt với HE, Cl, DI, EA, Me, W

Thu nhận cao chiết HE, Cl,

DI, EA, Me, W

Tiến hành cô quay dịch chiết và dung môi ta thu được cao chiết thô Nhiệt độ cô quay phụ thuộc vào nhiệt độ sôi của dung môi (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Thử khả năng kháng E coli sinh ESBL từ cao chiết Bacillus

sp RD26 bằng phương pháp khuếch tán đĩa kirby-bauer

Cao chiết thô sau khi được thu nhận ở mục 3.3.2 được hòa tan trong DMSO 1% đạt nồng độ gấp 100 lần nồng độ thử nghiệm tối ưu Thí nghiệm được thực hiện như mục 1.3.2.1.4

Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần Xử lý thống kê ANOVA một yếu tố bằng phần mềm Statgraphics Plus 3.0

Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC (Minimum Inhibatory

Concentration) của cao chiết với vi khuẩn E coli sinh ESBL

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết chủng Bacillus sp RD26 được

xác định bằng phương pháp pha loãng (Wiegand và cs., 2008)

Mục đích:

Nhằm xác định sự kìm hãm sự tăng trưởng của vi khuẩn thử nghiệm khi được ủ

chung với cao chiết chủng Bacillus sp RD26, khảo sát trong 16 - 20 giờ (Wiegand

và cs., 2008)

Chuẩn bị:

Phiến Microwell 96 giếng được ngâm cồn 70% trong 2 giờ để diệt khuẩn, sấy khô và chiếu UV trong 2 giờ

Cao chiết chủng Bacillus sp RD26, dịch vi khuẩn thử nghiệm

Môi trường MHB đã được hấp vô trùng ở 121oC/20 phút để tiến hành tăng sinh các vi khuẩn thử nghiệm

Cách tiến hành:

Cao chiết vi khuẩn được hòa tan trong DMSO 1% đạt nồng độ gấp 100 lần nồng độ thử nghiệm tối ưu Pha loãng trong môi trường MHB để có được dãy nồng độ theo cấp số nhân, đồng thời nồng độ của DMSO nhỏ hơn hoặc bằng 1% Từ đó dãy nồng độ này có thể tiến hành thử nghiệm tác động kháng khuẩn