phân lập và tinh chế các hợp chất có hoạt tính sinh học từ cao chiết chủng bacillus sp rd26 nội sinh có khả năng kháng staphylococcus aureus atcc 43300 mrsa

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG MRSA TỪ CÁC PHÂN ĐOẠN THU ĐƯỢC CỦA CAO CHIẾT CHỦNG BACILLUS SP.. Phần lớn các hợp chất này được tổng hợp bởi vi khuẩn nội sinh giúp thực vật có khả năng kháng lại



BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài

PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT

TÍNH SINH HỌC TỪ CAO CHIẾT CHỦNG BACILLUS

SP RD26 NỘI SINH CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG

STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 43300 (MRSA)

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: Y DƯỢC

GVHD: ThS DƯƠNG NHẬT LINH TS NGUYỄN TẤN PHÁT SVTH: NGUYỄN THỊ LÀNH MSSV: 1553010086

KHÓA: 2015-2019

Bình Dương, tháng 05 năm 2019



BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài

PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT

TÍNH SINH HỌC TỪ CAO CHIẾT CHỦNG BACILLUS

SP RD26 NỘI SINH CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG

STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 43300 (MRSA)

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: Y DƯỢC

GVHD

SVTH: NGUYỄN THỊ LÀNH MSSV: 1553010086

KHÓA: 2015-2019

Bình Dương, tháng 05 năm 2019

Công nghệ Vi sinh - Trường Đại học Mở Tp Hồ Chí Minh là khoảng thời gian vui vẻ nhất trong hành trang sinh viên của tôi Tôi đã học tập được rất nhiều kiến thức cũng như kinh nghiệm quý báu tại đây Cũng nơi đây tôi có nhiều người bạn mới, nhiều kỷ niệm buồn vui khác nhau Để hoàn thành được đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình từ thầy cô, các anh chị, các bạn và cả gia đình

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến thầy Nguyễn Văn Minh và cô Dương Nhật Linh Thầy cô đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và chia sẻ cho

em những kiến thức chuyên ngành cũng như đời sống hằng ngày Thầy cô cũng luôn tiếp động lực cho chúng em trong những lúc khó khăn để hoàn thành tốt đề tài của mình

Em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Tấn Phát và các anh chị tại Viện Công

nghệ Hóa học - số 1, Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, TP Hồ Chí Minh, đã hỗ trợ và giúp đỡ em rất nhiều để hoàn thành đề tài

Em xin cảm ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh Quý thầy cô đã hết lòng giảng dạy và truyền đạt những kiến thức quý báu làm nền tảng vững chắc để em có thể hoàn thành tốt công việc của mình

Em xin cảm ơn chị Trần Thị Á Ni, chị NguyễnThị Thảo Nguyên và các anh chị

trong phòng thí nghiệm đã nhiệt tình ủng hộ và giúp đỡ em giảo quyết những vấn đề xảy ra trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Bên cạnh đó tôi xin cảm ơn tất cả các bạn thành viên phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh Trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh đã bên cạnh giúp đỡ tạo điều kiện để tôi

hoàn thành tốt đề tài Cảm ơn bạn Đinh Thị Thúy Kiều, bạn Lương Thị Cẩm Vân và hai em Nguyễn Thị Sen, Trần Thị Mỹ Duyên đã hỗ trợ tôi hoàn thành tốt đề tài

và lời động viên những lúc con gặp khó khăn nhất, giúp con vững bước trên con đường mình đã chọn

Kính chúc tất cả quý thầy cô, anh chị, bạn bè, các em, cả gia đình dồi dào sức khỏe, luôn luôn hạnh phúc và gặt hái nhiều thành công trong cuộc sống Xin chân thành cảm ơn!

Bình Dương, tháng 05 năm 2019 Nguyễn Thị Lành

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

2.1 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS KHÁNG METHICILLIN 6

2.2 VI KHUẨN NỘI SINH BACILLUS SP 8

2.2.1 Phân loại 8

2.2.2 Hình dạng và kích thước 9

2.2.3 Đặc điểm nuôi cấy 9

2.2.4 Ứng dụng của Bacillus 9

2.2.5 Chất chuyển hóa kháng khuẩn 10

2.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ CHỦNG BACILLUS SP 11

2.3.1 Khái niệm 11

2.3.2 Đặc tính và vai trò của hợp chất có hoạt tính sinh học 12

2.3.3 Hợp chất có hoạt tính sinh học từ chủng Bacillus sp 12

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 17

- Thời gian: 17

- Địa điểm: 17

3.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 17

3.2.1 Chủng vi sinh vật nghiên cứu 17

3.2.2 Môi trường – hóa chất 17

3.2.3 Thiết bị và dụng cụ 17

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.3.1 Bố trí thí nghiệm 18

3.3.2 Hoạt hóa chủng Bacillus sp RD26 20

3.3.3 Khảo sát khả năng kháng MRSA từ dịch ngoại bào hay nội bào chủng Bacillus sp RD26 20

3.3.4 Thu nhận cao chiết từ chủng Bacillus sp RD26 từ các hệ dung môi khác nhau ………23

3.3.5 Khảo sát phân đoạn cắn của cao chiết từ chủng Bacillus sp RD26 bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng 25

3.3.6 Sắc ký cột cao chiết 27

3.3.7 Khảo sát khả năng kháng Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) từ các phân đoạn nhỏ thu được từ phương pháp sắc ký cột 28

3.3.8 Phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc hợp chất thu được 29

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32

4.1 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG MRSA TỪ DỊCH NGOẠI BÀO HAY NỘI BÀO CỦA CHỦNG BACILLUS SP RD26 33

4.2 THU NHẬN CAO CHIẾT BACILLUS SP RD26 TỪ CÁC HỆ DUNG MÔI KHÁC NHAU 34

4.2.1 Thu cao chiết chủng Bacillus sp RD26 34

4.2.2 Khảo sát khả năng kháng MRSA từ cao chiết Bacillus sp RD26 bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch Kirby - Bauer 36

4.2.3 Phương pháp xác định nồng độ tối thiểu (MIC) của cao chiết Bacillus sp RD26 kháng MRSA bằng phương pháp pha loãng trong môi trường thạch 37

4.3 KHẢO SÁT PHÂN ĐOẠN CẮN CỦA CAO CHIẾT TỪ CHỦNG BACILLUS SP BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG (TLC) 39

4.4 SẮC KÝ CỘT CAO CHIẾT 41

4.5 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG MRSA TỪ CÁC PHÂN ĐOẠN THU

ĐƯỢC CỦA CAO CHIẾT CHỦNG BACILLUS SP RD26 NỘI SINH BẰNG

PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN GIẾNG THẠCH KIRBY – BAUER 46

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả thử khả năng kháng MRSA bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch

Bảng 3.2 Kết quả cao thu được chiết với 6 loại dung môi

Bảng 3.3 Kết quả vòng kháng MRSA của 6 loại cao chiết thu được

Bảng 3.4 Kết quả MIC của 6 loại cao chiết từ chủng Bacillus sp RD26 kháng MRSA

Bảng 3.5 Kết quả hệ số di chuyển Rf của cao chiết chủng Bacillus sp RD26 thông

qua các dung môi

Bảng 3.6 Dữ liệu phổ 1H (500 Hz) và 13C (125 Hz) của BR01 và chất dion đo trong DMSO-d6

pyrimidine-2,4-DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1 Kết quả vòng kháng khuẩn

Hình 3.2 Thử nghiệm MIC của cao chiết trong thạch

Hình 3.3 Kết quả thử khả năng kháng MRSA bằng giếng khuếch tán dịch nuôi cấy

chủng Bacillus sp RD26

Hình 3.4 Kết quả cao chiết Bacillus sp RD26 kháng MRSA

Hình 3.5 Kết quả MIC của cao chiết chủng Bacillus sp RD26 kháng MRSA từ dung

môi dichloromethane và methanol

Hình 3.6 Kết quả MIC của cao chiết chủng Bacillus sp RD26 kháng MRSA từ dung môi n-hexan và ethyl acetate

Hình 3.7 Kết quả MIC của cao chiết chủng Bacillus sp RD26 kháng MRSA từ dung

môi nước và chloroform

Hình 3.8 Sắc ký bản mỏng cao (TLC) chiết chủng Bacillus sp RD26 thông qua các

dung môi dưới tia UV bước sóng 254nm và nướng trên bếp điện

Hình 3.9 Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân đoạn thu được từ hệ dung môi chloroform : methanol (95:5)

Hình 3.10 Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân đoạn thu được từ hệ dung môi chloroform : methanol (92:8)

Hình 3.11 Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân đoạn thu được từ hệ dung môi chloroform : methanol (85:15)

Hình 3.12 Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân đoạn khảo sát thu được từ hệ dung môi chloroform : methanol (70:30)

Hình 3.13 Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân đoạn thu được từ hệ dung môi chloroform : methanol : nước (65:35:5)

Hình 3.14 Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân đoạn thu được từ hệ dung môi chloroform : methanol : nước (60:40:10)

Hình 3.15 Khả năng kháng MRSA của các phân đoạn 1, 5 và 7 trong hệ dung môi chloroform: methanol (92:8)

Hình 3.16 Khả năng kháng MRSA của các phân đoạn 1 và 6 trong hệ dung môi chloroform: methanol (95:5)

Hình 3.17 Khả năng kháng MRSA của các phân đoạn 11,15 và 19 trong hệ dung môi chloroform: methanol (85:15)

Hình 3.18 Khả năng kháng MRSA của các phân đoạn 1, 5, 10, 15, 20, 25 và 29 trong hệ dung môi chloroform: methanol (70:30)

Hình 3.19 Khả năng kháng MRSA của các phân đoạn 1, 4 và 6 trong hệ dung môi chloroform: methanol : nước (63 : 35 : 5)

Hình 3.20 Khả năng kháng MRSA của các phân đoạn 1, 4 và 6 trong hệ dung môi chloroform: methanol : nước (60 : 40 : 1)

Hình 3.21 Sắc ký lớp mỏng (TLC) các phân đoạn thu nhận từ hệ dung môi chloroform : methanol tỉ lệ 85:15 và 70:30

Hình 3.22 Cấu trúc hoá học của BR01

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

MRSA: Methicillin resistant Staphylococcus aureus - S.aureus kháng methicillin S.aureus: Staphylococus aureus

Cs: cộng sự

PBP: Penicillin binding proteins - protein gắn penicillin

PBP2A: Penicillin binding protein 2A - protein gắn penicillin 2A TLC: Thin layer chromatography - Sắc ký lớp mỏng

He: n - hexane

Et: ethyl acetate Di: dichloromethane W: nước

Me: methanol Clo: chloroform DTT: dithiothreitol

PHẦN 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo danh sách công bố của Tổ chức Y tế Thế giới (2018), có 12 loài vi khuẩn và các họ vi khuẩn kháng thuốc gây ra mối đe dọa lớn nhất đối với sức khỏe con người

Trong đó, Staphylococcus aureus - tụ cầu vàng, được xếp vào nhóm vi khuẩn kháng

thuốc ở mức độ ưu tiên cao (WHO, 2018) Vi khuẩn này thường gây ra các bệnh nhiễm trùng trên da như loét, mụn mủ hoặc nhọt Nhiễm trùng có thể đi vào nơi phẫu thuật,

trong máu hoặc gây ra viêm phổi,… Các bệnh nhiễm trùng hầu hết do S.aureus kháng

methicillin (MRSA) gây ra MRSA là một nguyên nhân chính gây nhiễm trùng da và mô mềm trong bệnh viện cũng như nhiễm trùng cộng đồng ở những người khỏe mạnh khác MRSA đang là tác nhân đa kháng thuốc, ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người trên toàn thế giới (WHO, 2018)

Hợp chất sinh học là các chất chuyển hóa thứ cấp từ vi khuẩn hoặc thực vật, có những hoạt tính kháng khuẩn, kháng ung thư, kháng virus, hoạt tính dược lý (Kalia và cs., 2017) Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về hợp chất có hoạt tính sinh học ngày càng được chú trọng, bởi lợi ích của nó đối với sức khỏe con người Phần lớn các hợp chất này được tổng hợp bởi vi khuẩn nội sinh giúp thực vật có khả năng kháng lại các tác nhân gây bệnh, được sử dụng trong các ngành dược phẩm như thuốc kháng sinh, kháng ung thư, kháng virus, chống đái tháo đường và các hợp chất hoạt tính sinh học khác (Guo và cs., 2008) Một số ví dụ điển hình bao gồm thuốc kháng sinh mới

Ecomycin được tạo ra từ vi khuẩn nội sinh Pseudomonas viridiflava và Pseudomycin từ vi khuẩn Pseudomonas syringae (Christina và cs., 2013) Năm 2013, Sunkar và cộng sự đã phân lập và xác định được vi khuẩn nội sinh Brasica oleracea có khả năng sinh

các enzyme amylase, protease, cellulase có tiềm năng trong sản xuất enzyme với quy mô lớn

Bacillus là một trong những đối tượng nghiên cứu rất rộng rãi vì chúng sinh ra các

hợp chất thứ cấp có khả năng kháng khuẩn và kháng nấm mạnh Công trình nghiên cứu của Jeyanthi và cộng sự (2016) đã tiến hành tinh sạch, đánh giá hoạt tính kháng khuẩn

của hợp chất có hoạt tính sinh học kháng MRSA được phân lập từ Bacillus

khuẩn mới từ chủng Bacillus được phân lập từ đất có khả năng kháng lại một số vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc như S aureus, S aureus kháng methicillin và vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm Listeria monocytogenes

Từ một số công trình nghiên cứu trên cho thấy chủng Bacillus có tiềm năng sản

xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học rất cao Các hợp chất này có nhiều các cấu trúc hóa học đặc biệt phức tạp, với hàng loạt các nhóm chức năng đặc trưng, đa dạng hơn so với nhóm kháng sinh và chất chuyển hóa thứ cấp từ vi sinh vật khác (Shukla, 2015)

Ở Việt Nam, còn ít các công trình nghiên cứu về hoạt tính kháng vi khuẩn kháng thuốc từ vi sinh vật nội sinh Thừa kế từ công trình nghiên cứu trước, chủng vi khuẩn

Bacillus sp RD26 được phân lập từ cây Diệp Hạ Châu Đắng (Phyllanthus amarus schum Et thonn) có khả năng kháng MRSA Chính vì vậy, chúng tôi tiếp tục thực hiện

đề tài với nội dung như sau: “Phân lập và tinh chế các hợp chất có hoạt tính sinh

học từ cao chiết chủng Bacillus sp RD26 nội sinh có khả năng kháng Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA).”

Mục tiêu:

Phân lập và tinh chế các hợp chất có hoạt tính sinh học từ cao chiết chủng

Bacillus sp RD26 nội sinh có khả năng kháng Staphylococcus aureus ATCC 43300

(MRSA)

Nộidung:

− Khảo sát khả năng kháng MRSA từ dịch ngoại bào hay nội bào

− Chiết các hợp chất từ vi khuẩn Bacillus sp RD26 với các dung môi: n-

hexane, chloroform, dichloromethane, ethyl axetate, methanol và nước

− Khảo sát hoạt tính kháng MRSA của cao chiết chủng Bacillus sp RD26 thu

được bằng phương pháp khuếch tán đĩa Kirby – Bauer

− Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết chủng Bacillus sp RD26

kháng MRSA bằng phương pháp pha loãng

− Khảo sát các phân đoạn cắn bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)

− Thu nhận phân đoạn chứa các chất có hoạt tính kháng MRSA bằng phương pháp sắc ký cột

− Tinh sạch và xác định cấu trúc hợp chất có hoạt tính sinh học có khả năng kháng MRSA

PHẦN 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS

KHÁNG METHICILLIN

S.aureus đề kháng với penicillin được phát hiện lần đầu tiên vào đầu thập niên

1940, chỉ một thời gian ngắn sau penicillin được đưa vào sử dụng Nhưng trong nhiều năm sau đó thì những dòng vi khuẩn kháng penicillin này vẫn còn nhạy với các penicillin bền vững với penicillinase (oxacillin, methicillin, nafcillin), còn gọi là penicillin M Đến giữa thập niên 1960, bắt đầu xuất hiện những dòng vi khuẩn

S.aureus kháng penicillin M, được gọi là “methicillin resistant S.aureus (MRSA)” vì

methicillin là kháng sinh đầu tiên được sử dụng để phát hiện oxacillin ( Phạm Hùng Vân, 2013)

S.aureus đề kháng với penicillin thông qua cơ chế β-lactamase và hiện nay đã có một tỷ lệ rất cao S.aureus kháng với penicillin bằng cách tiết enzyme β-lactam; MRSA

đề kháng penicillin M chủ yếu qua trung gian gen mecA mã hóa cho protein 2A gắn penicillin (PBP 2A hoặc PBP 2’) Khi được tạo ra, PBP 2A nằm ở vách tế bào vi khuẩn và có ái lực thấp với kháng sinh β-lactam, nhờ vậy mà làm cho vi khuẩn kháng được không chỉ penicillin M mà còn với tất cả các kháng sinh β-lactam ( Phạm Hùng Vân, 2013)

MRSA được viết tắt với tên gọi Methicillin resistant S aureus Kể từ những năm

1960, MRSA trở nên phổ biến trên toàn cầu và là nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm khuẩn ở bệnh viện và cộng đồng Các chủng MRSA mang gen mã hóa protein làm cho vi khuẩn kháng với hầu hết các kháng sinh nhóm beta -lactam (như methicillin) ( Lee và cs., 2018)

Phân loại khoa học

Họ: Staphylococcaceae

S aureus là một trong những mầm bệnh phổ biến nhất trong các cơ sở chăm sóc

sức khỏe và trong cộng đồng, và có thể gây nhiễm trùng xâm lấn, nhiễm trùng huyết và

tử vong, trong khi S aureus kháng methicillin (MRSA) cấu thành một mối quan tâm

nghiêm trọng về sức khỏe cộng đồng do khả năng xâm chiếm và lây nhiễm cho người và động vật (Kourtis và cs., 2019) MRSA được phân lập tại Châu Âu đầu tiên vào năm 1960, phát tán nhanh ở Mỹ và trở thành dịch ở nhiều bệnh viện tại Mỹ ở thập niên 1980 (tỷ lệ nhiễm MRSA 10 - 40%)

Các bệnh nhiễm trùng hầu hết do S aureus kháng methicillin (MRSA) gây ra:

Đông Nam Á hơn 25%, Đông Địa Trung Hải hơn 50%, Châu Âu 60%, Châu Phi 80%, Tây Thái Bình Dương 80%, Châu Mỹ 90% (WHO,2018) MRSA là nguyên nhân chính gây nhiễm trùng da và mô mềm trong bệnh viện cộng đồng ở những người khỏe mạnh khác Tần suất tử vong hàng năm từ MRSA đang gia tăng nhanh chóng và vượt qua những người gây ra bởi virus suy giảm miễn dịch ở người / hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (HIV / AIDS) (Bancroft và cs., 2007), từ năm 1999 đến 2005, số ca nhập viện liên quan đến nhiễm trùng MRSA tăng 119%, hay 14% mỗi năm (Klein và cs., 2007), khoảng 1.650 trường hợp nhiễm dòng máu và 500 trường hợp tử vong hàng năm ở Úc (Turnidge và cs., 2009), 11.000 người chết mỗi năm tại Hoa Kỳ (Dantes và cs., 2011) và một chi phí vượt quá hàng năm cho hệ thống chăm sóc sức khỏe của châu Âu là 380 triệu euro (Köck và cs., 2010)

Đứng trước tình hình S aureus kháng với penicillin do gần 100% có khả năng tiết

được enzyme penicillinase phá huỷ được penicillin, các nhà lâm sàng phải chỉ định

penicillin M để điều trị các nhiễm khuẩn do S aureus Tuy nhiên hiện nay các bác sĩ điều trị phải đối phó với thách thức là tác nhân S aureus kháng được penicillin M

(MRSA) với tỷ lệ ngày càng gia tăng Tại Việt Nam, một nghiên cứu đa trung tâm thực

nhiễm khuẩn do S aureus cho thấy tỷ lệ MRSA là 47% Tổng kết tại Bệnh Viện Chợ

Rẫy và Bạch mai cũng cho thấy tỷ lệ MRSA là 57% và 43% Tổng kết của GARP:VN cho thấy tỷ lệ MRSA ghi nhận từ 15 bệnh viện tại VN vào năm 2008 là từ 30% đến 64% Bệnh viện Thống Nhất TP HCM từ năm 2005 đến 2007 đã ghi nhận có đến 79%

S saprophyticus và 40% S aureus phân lập từ nhiễm khuẩn đường tiết niệu

kháng methicillin Chỉ định kháng sinh dành cho MRSA là vancomycin, tuy nhiên hiện nay chỉ định này đang phải đối diện với một thách thức mới, không phải là do xuất hiện

đề kháng vancomycin mà là do MIC của vancomycin đối với S aureus bị tăng

vượt quá 1.5 μg/mL gây thất bại điều trị vancomycin trên lâm sàng Thách thức này hiện nay đã được ghi nhận tại bệnh viện Bạch Mai và bệnh viện Chợ Rẫy với ghi nhận 46% các chủng MRSA là có MIC của vancomycin ≥2 μg/mL và 93% có MIC ≥1.5 μg/mL ( Phạn Hùng Vân, 2016) Một nghiên cứu tương đối rộng ở 3 tỉnh ( Đà Nẵng, Cần Thơ và Tp Hồ Chí Minh) của Phạm Hồng Vân và Phạm Thái Bình cho thấy MRSA kháng lại hầu hết các loại kháng sinh thông dụng, kể cả kháng sinh thế hệ mới (gentamycin: 42%, erythromycin: 63%, azithromycin: 68%, ciprofloxacin: 39%, cefuroxime: 38%, amoxillin - acid clavuanic: 30%, chloramphenicol: 38%, methicillin: 47%) Tuy chỉ có hai loại kháng sinh là vancomycin và linezolid chưa thấy đề kháng ( Cao Thị Thu Quế, 2015)

2.2 VI KHUẨN NỘI SINH BACILLUS SP

2.2.2 Hình dạng và kích thước

Đặc điểm cụ thể về chi này được mô tả như sau: tế bào hình que thẳng hoặc gần thẳng, có đầu tròn hay vuông, kích thước 0,5 - 1,2 x 2,5 - 10 𝜇m Trừ B anthracis và

B mycoides, hầu hết các loài Bacillus đều di động, mặc dù có sự khác biệt rất lớn về

khả năng di động trong mỗi loài, roi điển hình nằm hai bên Hình thành nội bào tử chịu nhiệt, chỉ có một bào tử trong một tế bào, hình trụ, oval, tròn, thỉnh thoảng có hình bầu dục Sự hình thành bào tử không bị ngăn cản bởi tiếp xúc với không khí Trao đổi chất kiểu hô hấp nghiêm ngặt hoặc cả hô hấp và lên men đồng thời, đòi hỏi nhiều thành phần Chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi chuyển hoá hô hấp là oxi phân tử Hầu hết cho catalase dương tính (Nguyễn Đức Quỳnh Như, 2008)

2.2.3 Đặc điểm nuôi cấy

Phần lớn các loài Bacillus là sinh vật hóa dị dưỡng linh hoạt, có khả năng hô hấp

trong khi sử dụng nhiều hợp chất hữu cơ đơn giản (đường, amino acid, acid hữu cơ) Trong một số trường hợp, chúng còn có thể lên men carbohydrate trong một phản ứng

hỗn hợp tạo ra glycerol và butanediol Một số ít loài như B megaterium không đòi hỏi

tác nhân tăng trưởng hữu cơ, một số khác lại cần có amino acid, D - vitamin hay cả hai Phần lớn chúng là ưa nhiệt trung bình, khoảng nhiệt độ tối đa cho sự phát triển của tế bào dinh dưỡng từ 25 - 75ºC, nhiệt độ tối ưu là 30 - 45o

C, khoảng pH rộng 2 - 11 Trong phòng thí nghiệm, với điều kiện tối ưu, thời gian thế hệ của Bacillus vào khoảng 25 phút (Phạm Văn Ty và cs, 2006)

2.2.4 Ứng dụng của Bacillus

Bacillus được ứng dụng nhiều trong sản xuất enzyme công nghiệp vì nó có khả

năng sinh các loại enzym như amylase, alkaline phosphatase, cellulase, cyclodextrin

glucanotransferase, chitinase, glucanase, lipase, serine, protease,… Ngoài ra, Bacillus

còn có khả năng sinh các chất chuyển hóa sơ cấp như nucleotide xanthanylic acid,

inosinic acid, guanilic acid,… Dưới điều kiện sống thiếu dinh dưỡng Bacillus còn có

khả năng sinh các loại kháng sinh peptid như surfactin vừa có tính kháng khuẩn, vừa

có tính diện hoạt mạnh (Toure và cs., 2004; Hong và cs., 2005) Một số chủng Bacillus

như Bacillus laterosporus, Bacillus firmus và Bacillus cereus hiện nay đang được nghiên cứu trong sản xuất chất dẻo sinh học (hydroxybutyrate) Bacillus pasteurii được

đưa vào đất ướt đã tạo ra calcite - một chất xi măng liên kết đất, chuyển hóa đất thành đá làm vững nền móng các tòa nhà và giúp chúng chịu được động đất

Trong chế phẩm sinh học, Bacillus thuringiensis được dùng làm thuốc trừ sâu vi sinh Bacillus thuringiensis sp làm chế phẩm Israelensis serotype H14 diệt lăng quăng

Do khả năng tạo bào tử chịu nhiệt, sinh các loại enzym ngoại bào và khả năng đối

kháng với các vi sinh gây bệnh như Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae, Candida albicans, E coli, S aureus, Shigella, Vibrio spp.,… nên Bacillus spp được sử dụng làm probiotic trong chăn nuôi và thủy sản, Bacillus subtilis dùng làm chế phẩm

phòng và điều trị viêm tai mũi họng ở người (Berkeley và cs., 2002)

Bacillus còn dùng làm vật chủ biểu hiện gen để sản xuất các loại enzym, acid amin, vitamin và polysaccharide Các chủng Bacillus brevis có khả năng tiết nhiều

protein nhưng không tiết protease vào môi trường nuôi cấy nên được sử dụng làm hệ thống vector chủ biểu hiện các protein tái tổ hợp của người, động vật hữu nhũ và các sinh vật khác như nhân tố tăng trưởng biểu mô, insulin, interleukin 1 - β của bò, antigen virus viêm gan B, CGTase (Hong và cs., 2005; Nguyễn Đức Quỳnh Như và cs., 2009; Nguyễn Văn Thanh và cs., 2009)

2.2.5 Chất chuyển hóa kháng khuẩn

Bacillus mang lại nhiều lợi ích cho việc bảo vệ chống lại những nguồn bệnh do vi

khuẩn và vi nấm gây ra bởi khả năng hình thành nội bào tử của chúng và hoạt tính

kháng sinh phổ rộng Bacillus sản xuất ra 167 hợp chất sinh học chống lại vi khuẩn,

nấm, động vật nguyên sinh và virus Các hợp chất này thường là enzym thủy phân hay là các peptid có hoạt tính sinh học, hoặc các hợp chất polyketide Dưới điều kiện sống

thiếu dinh dưỡng Bacillus còn có khả năng sinh các loại kháng sinh peptid như

surfactin vừa có tính kháng khuẩn, vừa có tính diện hoạt mạnh (Zhang và cs., 2008; Kumar và cs., 2009., Hong và cs., 2005)

Những loại peptide kháng khuẩn được sản xuất bởi các chủng Bacillus spp bao

gồm nhiều lớp bacteriocin (Klaenhammer., 1993) Trong số những hoạt chất sinh học kháng khuẩn hoạt động bề mặt, lipopeptide chứa peptide từ 7 - 10 acid amin, được gắn kết theo chu kỳ thông qua một vòng lacton với một acid béo β - hydroxy cùng với độ dài chuỗi khác nhau

Các lipopeptide được sản xuất bởi nhiều chủng Bacillus sp., được chia thành các

lớp khác nhau như iturin (Delcambe và cs., 1977), sufactin (Arima và cs., 1968), fengycin (Vanittanakom và cs., 1986), kurstakins (Hathaout và cs., 2000), bacillomycin (Roogsawang và cs, 2002), và mycosubtilin (Duiman và cs, 1999) Trong số đó, iturin là lớp được báo cáo rộng rãi nhất của lipopeptide và được sản xuất bởi nhiều chủng

Bacillus subtilis (Duitman và cs., 1999; Isogai và cs., 1982; Peypoux và cs., 1986), B licheniformis (Kakinumua và cs., 1969; Yakimov và cs., 1999; Jenny và cs., 1991; Lin và cs.,1994), và B cereus (Nishikiori và cs., 1986)

Việc sản xuất các peptide kháng khuẩn bởi các chủng Bacillus đã được tìm hiểu

nhiều hơn trong thời gian và nhiều loại peptide được sản xuất bởi nhóm vi khuẩn

Bacillus phù hợp với nhiều ứng dụng hiện nay (Abriouel và cs., 2011)

2.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH

SINH HỌC TỪ CHỦNG BACILLUS SP

2.3.1 Khái niệm

Hợp chất có hoạt tính sinh học là hợp chất có nguồn gốc từ tự nhiên và có những hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, chống ung thư, kháng virus, hoạt tính dược lý (Shukla, 2015), là những hợp chất thiết yếu và không cần thiết (như vitamin hoặc polyphenol) có trong tự nhiên, là một phần trong thức ăn và được chứng minh có ảnh hưởng đến sức khỏe của con người (Biesalski và cs., 2009)

2.3.2 Đặc tính và vai trò của hợp chất có hoạt tính sinh học

Các nghiên cứu dịch tễ học đã chỉ ra rằng hợp chất có hoạt tính sinh học tác động có lợi đến sức khỏe của con người phù thuộc vào liều lượng trong điều trị các bệnh mãn tính (Martirosyan, 2011) Bên cạnh đó, hợp chất tự nhiên có một loạt các tính chất, trong đó các đặc tính chống oxy hóa là quan trọng nhất trong việc phòng ngừa bệnh tim mạch, tiểu đường, béo phì, tăng huyết áp và kích thích phản ứng miễn dịch (Giacometti và cs., 2018)

2.3.3 Hợp chất có hoạt tính sinh học từ chủng Bacillus sp

Bacillus là một trong những loài được sử dụng nhiều nhất trong quá trình kiểm

soát sinh học của thực vật Năm 2006, Nalisha và cộng sự tiến hành nghiên cứu nhằm

mục đích điều tra đặc điểm của hợp chất hoạt tính sinh học được sản xuất bởi Bacillus subtilis chống lại Sclerotium rolfsii - loại nấm gây bệnh trên thực vật Năm 2015, Torres và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm hoạt tính từ chủng Bacillus sp., phân lập từ mật ong, có hoạt tính kháng khuẩn chống lại ba loại vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes, B cereus và S.aureus ATCC 29213 Okulate (2009) đã nghiên cứu đặc tính của hợp chất sinh học được sản xuất bởi Bacillus sp kháng nấm Paenibacillus

thông qua dịch nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thông thường Tabbene và cộng

sự (2009) đã phân lập được chủng B subtilis B38 từ đất, chủng này có tạo ra các chất

chuyển hóa có khả năng kháng khuẩn và kiểm soát các vi sinh vật gây bệnh bao gồm

Staphylococcus kháng methicillin Năm 2010, Tabbene và cộng sự đã tinh chế được hợp chất S07-2 từ Bacillus subtilis B38 có khả năng chống lại P aeruginosa, năm

2011 tinh chế bacillomycin từ chủng vi khuẩn trên có khả năng chống nấm Candida

Bacillus mang lại nhiều lợi ích cho việc bảo vệ chống lại những nguồn bệnh do vi

khuẩn và vi nấm gây ra bởi khả năng hình thành nội bào tử của chúng và hoạt tính

kháng sinh phổ rộng Bacillus sản xuất ra 167 hợp chất sinh học chống lại vi khuẩn, nấm, động vật nguyên sinh và virus (Kumar A và cs, 2009) Bacillus sp sản xuất ra

lượng lớn enzyme thủy phân như α - amylase, β - glucanase, xylanase, protenase,

chitinase,…Các enzym này phá hủy thành tế bào của nấm, đặc biệt là chitinase, trong

nghiên cứu của Gomashe Ashok và cộng sự (2014) , Bacillus subtilis NCIM (2010) sản xuất enzyme chitin có tác dụng chống lại sự sinh trưởng của nấm Sclerotium rolfsii

2.4 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT 2.4.1 Khái niệm

Chiết là quá trình chuyển chất tan từ một pha này sang pha khác dựa trên tính tan khác nhau của chất tan trong hai pha Lý do phổ biến để thực hiện quá trình chiết trong phân tích hóa học là để tách hay làm giàu chất phân tích, hay tách các chất ra khỏi nhau Phổ biến nhất là quá trình chiết giữa dung môi nước và dung môi hữu cơ

Các dung môi hữu cơ là những hợp chất ít phân cực nên thường không tan trong nước, chất có độ phân cực rất lớn

Diethyl ether, toluen, n - hexan là các dung môi có tỉ trọng nhỏ hơn nước, chúng

nổi ở trên pha nước, chloroform (CHCl3), dichloromethane (CH2Cl2), Carbon tetrachloromethane (CCl4) là các dung môi phổ biến có tỉ trọng lớn hơn nước Trong hỗn hợp hai pha, một pha nước chiếm ưu thế, pha kia dung môi chiếm ưu thế Quá trình chiết thường xảy ra với vận tốc lớn nên có thể thực hiện chiết tách Sản phẩm chiết thường khá sạch (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

2.4.2 Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng

Việc chiết lỏng - lỏng được thực hiện bằng bình lóng Sử dụng lần lượt các dung môi hữu cơ, loại không hòa tan vào nước hoặc loại có thể hỗn hợp được vào nước, để chiết ra khỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực khác nhau (tùy vào độ phân cực của dung môi) Tùy vào tỉ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu cơ nằm ở lớp trên hoặc lớp dưới so với pha nước (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung

môi phân cực thí dụ như: ether dầu hỏa và n - hexan, ether ethyl, cloroform, ethyl acetate, n - butanol… với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều

lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi; chiết đến khi không còn chất hòa tan

vào dung môi thì đổ sang chiết với dung môi có tính phân cực hơn Dung dịch của các lần chiết được gom chung lại, làm khan nước với các chất làm khan như Na2SO4, MgSO4, CaSO4, …, đuổi dung môi, thu được cao chiết (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

2.5 SẮC KÝ LỚP MỎNG

Sắc ký lớp mỏng còn được gọi là sắc ký phẳng (Planar Chromatography), chủ yếu dựa vào hiện tượng hấp thụ, trong đó pha động là một dung môi hay hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ như silica gel hoặc oxid alumin Pha tĩnh này được tráng bằng một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic

Bình sắc ký: chậu, hũ hay lọ bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng có nắp đậy

Pha tĩnh: một lớp mỏng khoảng 0,25 mm của một loại chất hấp thu, thí dụ như silica gel, alumin… được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic Chất hấp thu trên tấm giá đỡ nhờ sulfat calci khan, hoặc tinh bột, hoặc một loại polymer hữu cơ

Mẫu cần phân tích: thường là hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ phân cực khác nhau Sử dụng khoảng 1 microlit (1 𝜇L ) dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2 - 5%, nhờ một vi quản để chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình

Pha động: dung môi hoặc hỗn hợp hai dung môi di chuyển chầm chậm dọc theo tấm lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó Dung môi di chuyển đi lên cao nhờ vào tính mao quản Mỗi thành phần của chất mẫu sẽ di chuyển với các vận tốc khác nhau, đi phía sau mức của dung môi Vận tốc di chuyển này phụ thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

2.6 SẮC KÝ CỘT

Sắc ký cột là phương pháp tách các chất dựa vào độ phân cực của từng chất Tùy theo tính chất mục đích của người thí nghiệm mà ta sử dụng loại sắc ký cột ướt hoặc khô

Nhồi cột ướt: dùng các chất hấp phụ có khả năng trương phình như Silicagel, Sephadex Nhồi cột khô: dùng các chất hấp phụ tính trương nở như Al2O3, CaCO3

Tùy độ phân cực khác nhau của các loại hợp chất mà chúng được hòa tan cùng với dung môi chạy và chạy ra ngoài bình hứng Đây là phương pháp tách chất mang tính cơ bản vì có rất nhiều chất có độ phân cực giống hoặc tương đương giống nhau nên khi chiết ra không chỉ chứa duy nhất một chất mà có thể chứa thêm chất khác (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

PHẦN 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU - Thời gian:

Từ tháng 2 năm 2019 đến tháng 5 năm 2019 - Địa điểm:

+ PTN Công nghệ Vi Sinh - cơ sở 3,Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 68 Lê Thị Trung, Thành phố Thủ Dầu Một, Tỉnh Bình Dương

+ Phòng 19, Phòng các chất có hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ Hóa học, số 01 Mạc Đỉnh Chi, Quận 1, TP Hồ Chí Minh

3.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.2.1 Chủng vi sinh vật nghiên cứu

Chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus sp RD26 phân lập từ cây Diệp Hạ Châu Đắng ( Phyllanthus amarus schum et thonn) được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ

Vi sinh, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh

Chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA - Staphylococcus aureus kháng methicillin) được cung cấp bởi công ty TNHH Dịch vụ và Thương mại

Nam Khoa

3.2.2 Môi trường – hóa chất

- Nutrient broth (NB), Nutrient agar (NA), Mueller Hinton Agar (MHA) - Cồn 96o, 70o, NaCl, HCl, NaOH, H2SO4 10%

- Nguồn dinh dưỡng: glucose, pepton - Các muối khoáng: CaCO3, MgSO4

- Các dung môi : n - hexane, chloroform, dichloromethane, ethyl axetate,

methanol và nước

- Nước muối sinh lý 0,85%, nước cất

3.2.3 Thiết bị và dụng cụ

- Máy ly tâm - Máy vortex

- Máy đo pH - Máy chụp hình

- Kính hiển vi - Tủ lạnh - Cân điện tử - Tủ cấy - Tủ ấm - Tủ sấy - Nồi hấp vô - Đĩa petri - Bếp điện - Máy sấy

- Bình serum - Máy lắc - Becher - Máy cô quay - Ống vi quản - Kẹp

- Lọ thủy tinh - Ống đong - Ống nghiệm

- Các loại micropipette và các đầu típ tương ứng ( 100 - 1000 𝜇L, 20 - 200 𝜇L)

- Các loại dung môi: n - hexane, ethyl acetate, methanol, dichloromethane,

chloroform và nước

- Một số dụng cụ khác bao gồm: đèn cồn, que cấy tròn, qua cấy trang

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1 Bố trí thí nghiệm

Dựa vào mục tiêu của nghiên cứu chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Khảo sát khả năng kháng MRSA bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch Kirby -

Bauer

Khảo sát phân đoạn cắn bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)

Thu cao chiết chủng Bacillus sp RD26

Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn (MBC) bằng phương

pháp pha loãng

Hoạt hóa chủng Bacillus sp RD26

Thu dịch nội bào Thu dịch ngoại bào

Chiết dịch vi khuẩn Bacillus sp RD26 với các hệ dung môi n-hexane,

chloroform, dichloromethane, ethyl acetate, methanol và nước

Tinh sạch và xác định cấu trúc hợp chất có hoạt tính sinh học có khả

năng kháng MRSA

Thu nhận phân đoạn chứa hợp chất có hoạt tính sinh học kháng MRSA bằng phương pháp sắc ký cột cao chiết

Khảo sát khả năng kháng MRSA từ dịch ngoại bào hay nội bào

Nuôi cấy và thu dịch

3.3.2 Hoạt hóa chủng Bacillus sp RD26

Kế thừa từ nghiên cứu “Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy chủng Bacillus sp RD26

để nâng cao hoạt tính kháng vi khuẩn MRSA bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm” (Dương Nhật Linh và cs., 2018) trước đó đã xác định công thức môi trường

tối ưu hóa để lên men chủng Bacillus sp RD26 (pepton: 7,36 g/L, glucose: 15 g/L,

CaCO3: 0,72 g/L, MgSO4: 0,6 g/L)

Chủng vi khuẩn Bacillus sp RD26 được hoạt hóa bằng cách lấy một ít sinh khối

từ thạch nghiêng trên môi trường NA vào bình erlen chứa 20 mL môi trường NB, nuôi lắc ở 35°C/ 36 giờ, tốc độ lắc 200 vòng/phút

Nhân giống: Điều chỉnh dịch khuẩn đạt giá trị OD610 có mật độ tế bào khoảng 108

tế bào/ mL Bổ sung 10% thể tích dịch khuẩn Bacillus sp RD26 sau khi hoạt hóa vào 100 mL môi trường tối ưu hóa tương ứng với chủng Bacillus sp RD26 trong bình erlen

100 mL với tỷ lệ 1/20 theo thể tích dùng nuôi lắc ở 35°C/ 36 giờ, tốc độ lắc 200 vòng/ phút (Shrivastava và cs., 2013)

Lên men: Bổ sung 10% thể tích dịch khuẩn giống cấp 2 vào môi trường tối ưu hóa tương ứng với chủng vi khuẩn ở 30°C/ 36 giờ, pH = 7

3.3.3 Khảo sát khả năng kháng MRSA từ dịch ngoại bào hay nội bào

chủng Bacillus sp RD26

Chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng kháng MRSA của dịch nuôi cấy và sinh

khối chủng Bacillus sp RD26 bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch (Kumar A và

cs., 2009)

3.3.3.1 Chuẩn bị dịch ngoại bào vi khuẩn

Chủng vi khuẩn sau khi được lên men, tiến hành ly tâm ở 10000 vòng/phút ở 4oC trong 10 phút thu dịch nổi Tiến hành thử hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch (Ogidi và cs., 2015)

3.3.3.2 Chuẩn bị dịch nội bào

• Ly tâm thu sinh khối tế bào ở 10000 vòng/phút, trong 10 phút ở 4oC

• Rửa tế bào bằng cách phân tán lại trong 3 mL NaCl 0,9% Vortex kĩ, ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC

• Chỉnh OD600 = 1 bằng đệm phosphat 0,1M pH 7 (xác định tỉ lệ thích hợp giữa huyền dịch vi khuẩn và dung dịch đệm)

• Bổ sung DTT đến nồng độ 10mM để giảm quá trình hợp chất của chủng

Bacillus sp RD26 bị oxy hóa, ủ đá để mẫu đạt nhiệt độ 0 - 5oC

• Tán siêu âm 6 lần duy trì nhiệt độ không đổi, mỗi lần tán 30 giây Đầu dò có kích thước dài 9 cm, với chu kì 50% Trước các lần tán siêu âm, mẫu phải đạt nhiệt độ 0 - 5oC Lấy khoảng 10 μL nhuộm đơn và quan sát trên kính hiển vi để theo dõi hiệu quả phá vỡ tế bào Mẫu sau khi tán siêu âm có thể giữ đông ở -20oC

• Ly tâm 10000 vòng/phút ở 4oC trong 10 phút Thu dịch nổi (dịch phá vỡ tế bào chứa enzyme) (Nguyễn Đức Lượng, 2003)

3.3.3.3 Tiến hành thí nghiệm

- Mục đích: Nhằm xác định khả năng kháng MRSA từ cao chiết chủng

Bacillus sp RD26

- Chuẩn bị môi trường

• Môi trường tối ưu và môi trường MHA thử nghiệm được hấp vô trùng ở 121oC trong 20 phút

• Môi trường MHA được đổ đĩa Petri (đường kính 90 mm) với thể tích 15 mL

- Chuẩn bị dịch vi khuẩn MRSA

• Chủng vi khuẩn được cấy ria vào thạch NA, ủ 24 giờ ở 37°C

• Chọn 1 khuẩn lạc đơn, cấy vào nước muối NaCl 0,85% với thể tích 9,9 mL, dùng máy vortex lắc đều ống

• Đem dịch vi khuẩn đo OD ở bước sóng 610 nm, điều chỉnh sao cho có mật độ tế bào tương đương khoảng 108 tế bào/mL, tương ứng với độ đục trong ống McFarland 0,5

- Chuẩn bị dịch vi khuẩn thử nghiệm như mục 2.3.3.1 và 2.3.3.2

- Cách tiến hành:

• Pha loãng vi khuẩn thử nghiệm với nước muối sinh lý 0,85% và so độ đục với ống McFarland 0,5 sẽ có nồng độ vi khuẩn tương đương là 1 - 2 x 108 CFU/ mL

• Dùng que bông vô trùng nhúng vào dịch vi khuẩn gây bệnh đã chuẩn bị, ép que vào thành ống cho ráo nước, sau đó trải đều trên mặt thạch Tiến hành trải dịch cho tới khi thấy mặt thạch khô, mỗi lần xoay hộp 60o

• Đục lỗ đường kính 6 mm trong bản thạch bằng dụng cụ vô trùng

• Dùng micropipet hút 100 µL dịch chiết bơm vào mỗi giếng (Trong đó có một giếng không bơm dịch chiết mà bơm dung môi DMSO làm giếng đối chứng)

• Để yên khoảng 15 phút cho dịch vi khuẩn khuếch tán vào lớp thạch

• Ủ 24 giờ/37oC, đọc kết quả vòng kháng

• Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại, thực hiện lần lượt từng cao chiết được tách từ các dung môi khác nhau (Bexfield A và cs, 2008)

- Kết quả

Cao chiết chủng Bacillus sp RD26 có khả năng kháng vi khuẩn thử nghiệm khi

xung quanh lỗ xuất hiện vòng vô khuẩn (vòng trong không có sự hiện diện của vi khuẩn) Thí nghiệm được lặp lặp 3 lần, kết quả được xử lý bằng phần mềm thống kê Statgraphic Plus 3.0 (Bexfield A và cs, 2008)

Hình 3.1 Kết quả vòng kháng khuẩn

3.3.4 Thu nhận cao chiết từ chủng Bacillus sp RD26 từ các hệ dung môi

khác nhau

3.3.4.1 Thu cao chiết chủng Bacillus sp RD26

Hoạt hóa chủng như mục 3.1

Sau thời gian lên men tiến hành ly tâm ở 10000 vòng/ phút trong 10 phút thu dịch nổi Thu 100 mL dịch khuẩn tiến hành chiết lỏng - lỏng lần lượt với các dung môi: He, Clo, Di, Et, Me và W với tỉ lệ 1:1 Sau đó thu dung môi kèm với các thành phần kháng khuẩn có trong đó

Tiến hành cô quay dịch chiết và dung môi ta thu được cao chiết thô Nhiệt độ cô quay phụ thuộc vào nhiệt độ sôi của dung môi (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Quy trình điều chế cao phân đoạn được trình bày trong sơ đồ 2

Vòng kháng khuẩn

Sơ đồ 2 Quy trình điều chế cao chiết vi khuẩn

3.3.4.2 Thử khả năng kháng MRSA từ cao chiết Bacillus sp RD26 bằng phương pháp khuếch tán đĩa Kirby - Bauer

Cao chiết thô sau khi được thu nhận ở mục 3.3.2 được hòa tan vào DMSO với tỉ lệ 10 mL DMSO 1% và 1 mg cao chiết.

Tiến hành thí nghiệm như mục 2.3.3.3.

Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần Xử lý thống kê ANOVA một yếu tố bằng phần mềm Statgraphics Plus 3.0.

3.3.4.3 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết chủng Bacillus sp.RD26 bằng phương pháp pha loãng

- Mục đích: Nhằm xác định sự kìm hãm sự tăng trưởng của vi khuẩn thử nghiệm khi được ủ chung với cao chiết chủng Bacillus sp RD26, khảo sát trong 16 - 20 giờ (Wiegand và cs., 2008).

- Chuẩn bị:

• Phiến Microwell 96 giếng được ngâm cồn 70% trong 2 giờ để diệt khuẩn, sấy khô và chiếu UV trong 2 giờ.

• Cao chiết chủng Bacillus sp RD26, dịch vi khuẩn thử nghiệm

• Môi trường MHB đã được hấp vô trùng ở 121oC/20 phút để tiến hành tăng sinh các vi khuẩn thử nghiệm

- Cách tiến hành:

• Cao chiết vi khuẩn được hòa tan trong DMSO 1% đạt nồng độ gấp 100 lần nồng độ thử nghiệm tối ưu Pha loãng trong môi trường MHB để có được dãy nồng độ theo cấp số nhân, đồng thời nồng độ của DMSO nhỏ hơn hoặc bằng 1% Từ đó dãy nồng độ này có thể tiến hành thử nghiệm tác động kháng khuẩn

• Dịch khuẩn thử nghiệm sau khi đã tăng sinh trong 18 giờ - 24 giờ, đo OD ở bước sóng 610 nm đạt giá trị khoảng 0,08 - 0,1 thì tương đương với mật độ vi khuẩn là 1 - 2 x 108

CFU/ mL Pha loãng dịch khuẩn với MHB sao cho nồng độ đạt được 103 CFU/ mL

• Hút 100 µL dịch khuẩn thử nghiệm cho vào giếng Microwell trộn chung với 100 µL cao chiết Lặp lại 3 lần Giếng đối chứng thay cao chiết bằng 200 µL dung môi DMSO

C, bắt đầu đọc kết quả sau 18 - 20 giờ

- Kết quả: Đọc kết quả dựa trên sự sinh trưởng của vi khuẩn thử nghiệm (Wiegand và cs., 2008)

3.3.5 Khảo sát phân đoạn cắn của cao chiết từ chủng Bacillus sp RD26

Là bình thủy tinh hình trụ cao 25 cm, đường kính miệng 10 cm, có nắp đậy kín Bão hòa hơi dung môi trong bình bằng cách lót giấy lọc xung quanh thành trong của bình, cho một lượng vừa đủ dung môi vào bình, lắc rồi để giấy lọc thấm đều dung môi Lượng dung môi sử dụng sao cho sau khi thấm đều giấy lọc còn lại một lớp dày khoảng 5 - 10 mm ở đáy bình Ðậy kín nắp bình và để yên 10 phút ở nhiệt độ phòng

• Sắc ký lớp mỏng

- Cách tiến hành:

Sử dụng ống thuỷ tinh mao quản hoặc micropipet để đưa mẫu lên bản mỏng Thể tích dung dịch từ 0,001 - 0,005 mL đối với trường hợp đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng điểm và từ 0,1 - 0,2 mL khi đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng vạch Ðường xuất phát phải cách mép dưới của bản mỏng 1,5 - 2 cm và cách bề mặt dung môi từ 0,8 - 1 cm Các vết chấm phải nhỏ, có đường kính 2 - 6 mm và cách nhau 15 mm Các vết ở bìa phải cách bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm để tránh hiệu ứng bờ

Ðặt bản nhôm gần như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi khai triển Ðậy kín bình và để yên ở nhiệt độ không đổi

- Đọc kết quả:

Khi dung môi đã triển khai trên bản mỏng được một đoạn, lấy bản mỏng ra khỏi bình, đánh dấu mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại trên bản mỏng Đọc kết quả dưới tia UV có bước sóng 254 nm hoặc phun dung dịch H2SO4 10% trong EtOH, tiếp theo làm nóng trên bếp điện 1 - 2 phút, 105°C

Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf.Gía trị hệ số Rf để phân tích định tính sự hiện diện của loại hợp chất nào đó (so với chất chuẩn), được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi (Olfa Tabbene và cs, 2009):

Rf =

Trong đó:

a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử (cm)

b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết (cm)

3.3.6 Sắc ký cột cao chiết

Từ cao chiết có hoạt tính mạnh nhất tiến hành sắc ký cột pha thường, kết hợp với sắc ký bản mỏng (TLC) để chia ra nhiều phân đoạn nhỏ có hệ dung môi rửa giải khác nhau

- Chuẩn bị cột:

• Chọn cột phù hợp với lượng cao chuẩn bị phân lập Làm khô cột

• Cho một ít bông gòn ở đáy cột (ngay phía dưới vòi nhỏ giọt) để silica gel không chảy ra ngoài

• Cân lượng silica gel vừa đủ cho vào cốc thủy tinh cùng với dung môi ít phân cực trộ đều

• Đổ hỗn hợp silica gel vào cột cùng với một ít dung môi, mở cột xae để ổn định cột

- Nạp cao vào cột:

• Thu nhận cao chiết methanol (42g)

• Nghiền nhuyễn cao khô với một ít silica gel thành hỗn hợp bột khô, mịn và đồng nhất

• Cho hết hỗn hợp vừa nghiền vào cột đã chuẩn bị sẵn bằng phễu thủy tinh

• Tiếp đó, cho từ từ dung môi vào cột và tiễn hành phân lập

Tiến hành sắc ký cột cao methanol với dung môi ít phân cực là chloroform, tiếp theo dùng với hệ dung môi có độ phân cực cao hơn: hệ chloroform : methanol với các tỷ lệ: (92;8), (95:5), (85:15), (70:30); hệ chloroform : methanol : nước với tỷ lệ: (65:35:5) và (60:40:1)

Trong quá trình chạy sắc ký luôn sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) giải ly bằng hệ dung môi chloroform: methanol với tỷ lệ thích hợp để kiểm tra và thăm dò các chất có trong cao thô và các phân đoạn, gôm các phân đoạn có các vết giống nhau lại chung một phân đoạn (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Thu được 6 phân đoạn cao Clo : Me (95 : 5) – (Cao A), Clo : Me (92 : 8) – (Cao B), Clo : Me (85 : 15) – (Cao C), Clo : Me (70 : 30) – (Cao D), Clo : Me : W (65 : 35 : 5)- (Cao E), Clo : Me : W (60 : 40 : 1) – (Cao F) Quy trình được trình bày theo sơ đồ

3:

Sơ đồ 3 Quy trình sắc ký cột cao Me

3.3.7 Khảo sát khả năng kháng Staphylococcus aureus ATCC 43300

(MRSA) từ các phân đoạn nhỏ thu được từ phương pháp sắc ký cột

Chuẩn bị môi trường MHA đã trải dịch khuẩn MRSA (108

Sắc ký cột lần lượt với các hệ dung môi Clo : Me (95 : 5), Clo : Me (92 : 8), Clo : Me (85 : 15); Clo : Me (70 : 30), Clo : Me : W (65 : 35 :

5), Clo : Me : W (60 : 40 : 1)

3.3.8 Phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc hợp chất thu được

Sử dụng sắc ký cột pha thường để phân lập hợp chất có hoạt tính sinh học

Hợp chất kháng khuẩn được tinh sạch bằng kỹ thuật HPLC sử dụng sắc ký cột pha đảo RP 18 Trong sắc ký pha đảo, pha động sử dụng là nước và methanol Thu nhận phân đoạn kết hợp với sắc ký bản mỏng (TLC) để xác định hợp chất thu được, tiến hành cô đổi dung môi và thử hoạt tính kháng MRSA như mục 2.3.3.3

- Cao phân đoạn C được cô lập bằng phương pháp sắc ký cột pha thường silicagel với hệ dung môi Clo : Me tỉ lệ (85 : 15) – (Cao C3) và Clo : Me tỉ lệ (8 : 2) kí hiệu là (Cao C4)

- Cao phân đoạn C4 được sắc ký cột lần 2 với hệ dung môi Clo : Me tỉ lệ (8 : 2) thu được phân đoạn nhỏ C4-1 và C4-2

- Tiến hành sắc ký cột cao phân đoạn C4- với hệ dung môi Clo : Me có tỉ lệ (85 : 15) và (8 : 2) Thu được 5 phân đoạn nhỏ được kí hiệu từ C4-1a đến C4-1e

- Cao phân đoạn C4-2 được sắc ký cột với hệ dung môi Clo : Me tỉ lệ (85 : 15) kí hiệu là (C4-2A), tỉ lệ (8 : 2) kí hiệu là (C4-2B) Cao chiết phân đoạn C4-2A thu được 7 phân đoạn được ký hiệu từ C4-2a đến C4-2g Cao phân đoạn C4-2B thu được 4 phân đoạn nhỏ được ký hiệu từ C4-2h đến C4-2l

- Sắc lý cột tinh sạch phân đoạn C4-2h với hệ dung môi chloroform : methanol tỉ lệ (8 : 2)

- Cao phân đoạn D được chia làm 2 cột chạy với hệ dung môi Clo : Me tỉ lệ (75 : 25) kí hiệu là D5 và D6 Cao phân đoạn D5 thu được 11 phân đoạn nhỏ D5-1 đến D5-11 và D6 thu được 21 phân đoạn nhỏ D6-1 đến D6-21

- Cao phân đoạn D5-7 đến D5-8 tiếp tục được sắc ký cột với hệ dung môi Clo : Me : W với tỉ lệ (7 : 3 : 0.1) Thu được 10 phân đoạn từ D5-a đến D5-k

- Cao phân đoạn D5-g tiến hành sắc ký cột tinh sạch với hệ dung môi chloroform : methanol tỉ lệ (70 : 30)

- Cao phân đoạn D6-6 đến D6-7 đước sắc ký cột với hệ dung môi Clo : Me : W với tỉ lệ (7 : 3 : 0.1) Sau đó thu được 9 phân đoạn từ D6- a đến D6-i Thí nghiệm được tiến hành như sơ đồ 4 và 5:

C4-2a C4-2b

C4-2c C4-2d

C4-2e

C4-2f

C4-2g

C4-2B C4-2k

C4-2i

C4-2h Cao C

Sắc ký cột