Đang tải... (xem toàn văn)
--- ∞0∞--- HUỲNH XUÂN THƯƠNG PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ CAO CHIẾT CHỦNG Bacillus amyloliquefaciens T3 NỘI SINH CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG VI NẤM Corynespora cassii
Trang 1 - ∞0∞ - HUỲNH XUÂN THƯƠNG PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ CAO CHIẾT CHỦNG Bacillus amyloliquefaciens T3 NỘI SINH CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG VI NẤM Corynespora cassiicola GÂY BỆNH RỤNG LÁ CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2020 Trang 2 - ∞0∞ -HUỲNH XUÂN THƯƠNG PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ CAO CHIẾT CHỦNG Bacillus amyloliquefaciens T3 NỘI SINH CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG VI NẤM Corynespora cassiicola GÂY BỆNH RỤNG LÁ CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis) Chuyên ngành: Nông nghiệp – Môi trường Mã số chuyên ngành: KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: ThS Nguyễn Văn Minh TS Nguyễn Tấn Phát Trang 3LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn tất cả các thầy cô Khoa Công nghệ Sinh Học trường Đại Học Mở Tp Hồ Chí Minh đã truyền đạt cho em những kiến thức nền tảng nhất trong suốt quá trình học Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy Nguyễn Văn Minh, cô Dương Nhật Linh Thầy cô luôn tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và chia sẻ cho em những kiến thức chuyên ngành cũng như những việc từ đời sống hằng ngày Thầy cô luôn tiếp động lực cho chúng em trong những lúc khó khăn để hoàn thành tốt đề tài của mình Em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Tấn Phát đã hỗ trợ và giúp đỡ em rất nhiều để hoàn thành đề tài Em xin chân thành cảm ơn anh Trần Kiến Đức, chị Trần Thị Á Ni, anh Nguyễn Thương Toàn, chị Lương Thị Cẩm Vân, bạn Nguyễn Hoài Linh, bạn Đinh Thị Mai Anh luôn ủng hộ, giúp đỡ em trong quá trình làm đề tài Bên cạnh đó, em xin cảm ơn các anh chị, các bạn, các em trong phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh Trường Đại học Mở Tp Hồ Chí Minh đã luôn quan tâm, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài này Con xin gửi lời cảm ơn ba mẹ, cảm ơn gia đình đã luôn bên con những lúc con gặp khó khăn nhất, đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để con hoàn thành tốt việc học của mình Kính chúc tất cả các thầy cô, anh chị, bạn bè lời biết ơn và kính chúc sức khỏe, may mắn, gặt hái nhiều thành công trong cuộc sống Xin chân thành cảm ơn! Tp Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2020 Huỳnh Xuân Thương Trang 4PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY CAO SU Hevea brasiliensis Muell Arg 6 1.2 TÌNH HÌNH BỆNH RỤNG LÁ TRÊN CÂY CAO SU 7 Trang 51.4.4 Dinh dưỡng và tăng trưởng 16 1.4.5 Ứng dụng của Bacillus 18 1.4.6 Hợp chất kháng nấm của Bacillus 19 1.4.7 Tình hình nghiên cứu hợp chất có hoạt tính sinh học từ chủng Bacillus21 1.5 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT 22 1.5.1 Khái niệm 22 1.5.2 Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng 23 1.6 SẮC KÝ BẢN MỎNG 23 1.7 SẮC KÝ CỘT 24 PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 26 2.2 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 26 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 26 2.2.2 Môi trường - hóa chất 26 2.2.3 Thiết bị - dụng cụ 26 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.3.1 Hoạt hóa chủng Bacillus amyloliquefaciens T3 29 2.3.2 Nhuộm Gram 29 2.3.3 Thử nghiệm catalase 29 2.3.4 Hoạt hóa củng Bacillus amyloliquefaciens T3 30 2.3.5 Xác định khả năng kháng Corynespora casiicola từ dịch ngoại bào chủng Bacillus amyloliquefaciens T3 30 2.3.6 Khảo sát khả năng kháng Corynespora cassiicola từ cao chiết chủng Bacillus amyloliquefaciens T3 qua các hệ dung môi khác nhau 32 2.3.7 Thử khả năng kháng Corynespora cassiicola từ cao chiết Bacillus amyloliquefaciens T3 bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch 34 Trang 62.3.8 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết chủng Bacillus amyloliquefaciens T3 bằng phương pháp pha loãng 34 2.3.9 Khảo sát phân đoạn của cao chiết từ chủng Bacillus amyloliquefaciens T3 bằng phương pháp sắc ký bản mỏng 35 2.3.10 Khảo sát khả năng kháng vi nấm của các cao chiết thu được bằng phương pháp tự sinh đồ 36 2.3.11 Sắc ký cột cao chiết 37 2.3.12 Khảo sát khả năng kháng Corynespora cassiicola từ các phân đoạn nhỏ thu được từ phương pháp sắc ký cột 38 2.3.13 Phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc hợp chất thu được 39 PHẦN 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40 3.5 XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC) CỦA CAO CHIẾT Bacillus amyloliquefaciens T3 KHÁNG Corynespora cassiicola 47 3.6 KHẢO SÁT PHÂN ĐOẠN CỦA CAO CHIẾT TỪ CHỦNG Bacillus amyloliquefaciens T3 BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ BẢN MỎNG (TLC) 50 3.7 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG VI NẤM CỦA CÁC CAO CHIẾT THU ĐƯỢC BẰNG PHƯƠNG PHÁP TỰ SINH ĐỒ 52 3.8 SẮC KÝ CỘT CAO CHIẾT 52 3.9 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG Corynespora cassiicola TỪ CÁC PHÂN ĐOẠN THU ĐƯỢC CỦA CAO CHIẾT CHỦNG Bacillus amyloliquefaciens T3 NỘI SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN GIẾNG THẠCH KIRBY – BAUER 56 Trang 73.10 PHÂN LẬP, TINH CHẾ HỢP CHẤT THU ĐƯỢC 59 3.11 TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG Corynespora cassiicola 60 Trang 8DANH MỤC CÁC BẢNGBảng 3.1 Kết quả hoạt hóa 41 Bảng 3.2 Khả năng kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch 42 Bảng 3.3 Kết quả khối lượng và hiệu suất thu hồi của cao chiết thu được với 5 loại dung môi 43 Bảng 3.4 Kết quả vòng kháng C cassiicola của 5 loại cao chiết 46 Bảng 3.5 Kết quả MIC của cao chiết chủng B amyloliquefaciens T3 từ dung môi chloroform, methanol 49 Bảng 3.6 Kết quả sắc ký bản mỏng (TLC) 51 Bảng 3.7 Dữ liệu phổ 13C và 1H–NMR của BA04 và hợp chất so sánh đo trong DMSO-d6 61Trang 9DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1 Khuẩn lạc nấm C cassiicola trên môi trường PDA (A) mặt trên của vi nấm, (B) mặt dưới của vi nấm 11Hình 2.1 Kết quả vòng kháng nấm 32Hình 3.4 Kết quả cao chiết B amyloliquefaciens T3 kháng C cassiicola 45Hình 3.6 Kết quả MIC của cao chiết chủng B amyloliquefaciens T3 từ dung môi methanol 48Hình 3.7 Sắc ký bản mỏng (TLC) cao chiết chủng B amyloliquefaciens T3 thông qua các dung môi dưới tia UV với bước sóng 254 nm 50Hình 3.8 Kết quả tự sinh đồ (A) cao chiết vi khuẩn với dung môi methanol; (B) cao chiết vi khuẩn với dung môi chloroform 52Hình 3.9 Sắc ký bản mỏng (TLC) phân đoạn thu được từ hệ dung môi ethyl acetate : methanol (95 : 5) 53Hình 3.10 Sắc ký bản mỏng (TLC) phân đoạn thu được từ hệ dung môi ethyl acetate : methanol (90 : 10) 53Hình 3.11 Sắc ký bản mỏng (TLC) phân đoạn khảo sát thu được từ hệ dung môi ethyl acetate : methanol (85 : 15) 54Hình 3.12 Sắc ký bản mỏng (TLC) phân đoạn thu được từ hệ dung môi ethyl acetate : methanol (80 : 20) 55Hình 3.13 Sắc ký bản mỏng (TLC) phân đoạn thu được từ hệ dung môi ethyl acetate : methanol (75 : 25) 55Hình 3.14 Khả năng kháng C cassiicola của các phân đoạn 15, 17 trong hệ dung môi ethyl acetate : methanol (95 : 5) 56Hình 3.15 Khả năng kháng C cassiicola của các phân đoạn 22, 26 trong hệ dung môi ethyl acetate : methanol (90 : 10) 57Trang 10Hình 3.16 Khả năng kháng C cassiicola của các phân đoạn 18 trong hệ dung môi ethyl acetate : methanol (85 : 15) 57Hình 3.17 Khả năng kháng C cassiicola của các phân đoạn 2, 7 trong hệ dung môi ethyl acetate : methanol (80 : 20) 58Hình 3.19 Sắc ký bản mỏng (TLC) các phân đoạn thu được A1’, A2’, C1’, C2’ và C3’ 59Hình 3.20 Các chất BA01, BA02, BA03, BA04 dưới dạng bột 60Hình 3.21 Các chất BA01, BA02, BA03, BA04 được soi dưới UV 254 nm 61Hình 3.22 Cấu trúc của hợp chất BA04 64Hình 3.23 Vòng kháng C cassiicola của hợp chất BA04 64Trang 11DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 28Sơ đồ 2.2 Quy trình điều chế cao chiết vi khuẩn B amyloliquefaciens T3 34Sơ đồ 2.3 Quy trình sắc ký cột cao Methanol 38DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của dung môi đến khối lượng cao chiết 44 Trang 12DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ANOVA: One - way analysis of variance B amyloliquefaciens: Bacillus amyloliquefaciens B cereus: Bacillus cereus B subtilis: Bacillus subtilis C cassiicola: Corynespora cassiicola Clo: chloroform cs: cộng sự Di: dichloromethane DMSO: Dimethyl sulfoxide DVT Dòng vô tính He: n - hexane NA Nutrient Agar NB Nutrient Broth S aureus: Staphylococcus aureus TLC: Thin layer chromatography - Sắc ký lớp mỏng Trang 13ĐẶT VẤN ĐỀCây cao su (Hevea brasiliensis Muell Arg.) là một trong những cây trồng chiến lược quan trọng nhất thế giới, một loại cây công nghiệp có ý nghĩa kinh tế, thương mại và xã hội ở nhiều quốc gia Tuy nhiên, việc trồng cao su luôn gặp khó khăn bởi sự tấn công của các mầm bệnh Bệnh rụng lá Corynespora gây ra bởi nấm C cassiicola là mối đe dọa lớn đối với sản xuất cao su tự nhiên ở các nước trồng cao su Đông Nam Á (Phan Thành Dũng, 2009) Bệnh rụng lá do nấm C cassiicola là một bệnh phổ biến, nấm C cassiicola gây bệnh đa số vào mùa mưa trên mọi độ tuổi của lá và mọi giai đoạn sinh trưởng của cây Ngoài ra, nấm C cassiicola còn gây bệnh trên cả cuống lá và chồi Do nấm có khả năng tiết ra độc tố và gây rụng lá hàng loạt, bệnh ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng, sản lượng cao su, gây thiệt hại kinh tế nặng nề cho ngành trồng cao su ở nhiều nước (Nguyễn Tuấn Lộc, 2013) Năm 2009, dịch bệnh xuất hiện gây hại nặng cho gần 3000 ha cao su tại Quảng Nam và Sa Thầy Năm 2010, bệnh đã phát sinh trên diện rộng ở một số tỉnh miền Đông Nam Bộ, Tây Nguyên và miền Trung, tập trung trên dòng vô tính cao su RRIV 4, hiện chiếm diện tích đã trồng khá lớn ở cả vùng cao su đại điền và tiểu điền (Nguyễn Anh Nghĩa và cs., 2011) Nhiều loại thuốc diệt nấm hóa học nhân tạo đã được sử dụng để ngăn ngừa và tiêu diệt nấm như anilinopyrimidine, benzimidazoles, chất ức chế demethylation (DMI), dicarboximide, phenylpyrrole, chất ức chế hô hấp và strobilurin, đã mất hiệu quả chống lại nấm gây bệnh Carbendazim, một loại thuốc trừ nấm đã được khuyến cáo sử dụng để phòng trị bệnh rụng lá, phấn trắng trên cây cao su Một số nghiên cứu cho thấy carbendazim có khả năng gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người, vật nuôi, hệ sinh thái, môi trường Do đó, một số nước đã ban hành lệnh cấm sử dụng (Mỹ, Úc, EU…) Theo quyết định số 03/QĐ-BNN-BVTV carbendazim bị loại bỏ ra khỏi danh mục thuốc bảo vệ thực vật được phép sử dụng tại Việt Nam Tuy nhiên, do phần lớn các loại nấm gây bệnh dễ dàng có khả năng kháng lại thuốc Trang 14diệt nấm thường sử dụng Để giảm nguy cơ bệnh cây trồng và tăng cường sự an toàn cho môi trường, các loại thuốc diệt nấm mới, an toàn hơn cần được phát hiện và phát triển Đồng thời nhằm giảm thiểu tác động tiêu cực của thuốc diệt nấm hóa học gây hại cho sức khỏe và môi trường sống, việc ứng dụng vi sinh vật có lợi nhằm ức chế nấm trở nên phổ biến và thu hút sự quan tâm trong những năm gần đây do nhu cầu của người tiêu dùng ngày càng cao (Yang và cs., 2008) Bacillus là một trong những đối tượng nghiên cứu rất rộng rãi vì khả năng sinh ra các hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm mạnh Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh khả năng kiểm soát nấm bệnh của nó như ức chế sự phát triển của nấm sản xuất độc tố aflatoxin (Cho và cs., 2009), kiểm soát nấm Aspergillus flavus trên đậu phộng (Kong và cs., 2010), kiểm soát Fusarium solani gây bệnh trên cây cà chua (Ebtsam và cs., 2009),… Hợp chất có hoạt tính sinh học là hợp chất có nguồn gốc từ tự nhiên và có những hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng ung thư, kháng virus, hoạt tính dược lý (Shukla., 2015) Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về hợp chất có hoạt tính sinh học ngày càng được chú trọng, các hợp chất có hoạt tính sinh học này gồm các nhóm có hoạt tính kháng nấm là terpen, tannin, flavonoids tinh dầu, ancaloit, lecithin và polypeptide Nalisha và cs (2006) tiến hành nghiên cứu điều tra đặc điểm của hợp chất hoạt tính sinh học được sản xuất bởi Bacillus subtilis chống lại Sclerotium rolfsii - loại nấm gây bệnh trên thực vật Kế thừa từ công trình nghiên cứu trước “Đánh giá khả năng kiểm soát sinh học nấm Corynespora cassiicola của chế phẩm sản xuất từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens T3” Nguyễn Văn Minh và cs (2014) đã chứng minh chủng Bacillus amyloliquefaciens T3 có khả năng kháng nấm Corynespora cassiicola, tôi tiếp tục thực hiện đề tài: “Phân lập và tinh chế các hợp chất có hoạt tính sinh học từ cao chiết chủng Bacillus amyloliquefaciens T3 nội sinh có khả năng kháng vi nấm Corynespora cassiicola gây bệnh rụng lá cây cao su (Hevea Trang 15brasiliensis)” Từ đó, xác định được hợp chất có khả năng kháng vi nấm C cassiicola gây bệnh Corynespora trên cây cao su Trang 16Mục tiêu đề tài: Tinh chế được các hợp chất có hoạt tính sinh học từ cao chiết chủng Bacillus amyloliquefaciens T3 nội sinh có khả năng kháng vi nấm Corynespora cassiicola gây bệnh rụng lá cây cao su (Hevea brasiliensis) Nội dung nghiên cứu: − Khảo sát khả năng kháng C casiicola từ dịch nuôi cấy B amyloliquefaciens T3 − Khảo sát khả năng kháng C cassiicola từ cao chiết chủng B amyloliquefaciens T3 qua các hệ dung môi (n-hexane, dichloromethane, chloroform, methanol và nước) − Khảo sát khả năng kháng C cassiicola bằng phương pháp sắc ký bản Trang 17PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trang 181.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY CAO SU Hevea brasiliensis Muell Arg 1.1.1 Phân loại học Cây cao su trên thế giới thuộc vào năm họ thực vật sau: Euphorbiaceae, Moraceae, Apocynaceae, Aslepiadaceae, Compositae Trong đó mỗi họ lại có nhiều giống, mỗi giống có nhiều loài Nhưng cây cao su thuộc loài Hevea brasiliensis (chi Hevea, họ Euphorbiaceae) là cây duy nhất được chọn để canh tác quy mô lớn (Nguyễn Hữu Trí, 2004) 1.1.2 Nguồn gốc Cây cao su có nguồn gốc từ vùng rừng nhiệt đới, lưu vực sông Amazon Nam Mĩ (Souza và cs., 2013), được du nhập vào Việt Nam năm 1897 Đến đầu thế kỷ XX, được trồng thành đồn điền tại Đông Nam Bộ Đầu thập niên 50 một số diện tích cao su cùng định hình tại Tây Nguyên và miền Trung (Nguyễn Hữu Trí, 2004) 1.1.3 Đặc điểm Cây cao su thuộc loại thân gỗ, to, cao Ở những cây lâu năm có thể cao từ 20 m đến 30 m Cấu tạo của thân cao su có phần quan trọng là vỏ thân, đây là bộ phận sản sinh ra nhựa mủ quyết định đến năng suất sản lượng mủ Lá cao su mọc cách, có ba lá chét nhỏ cuống dài, có hình bầu dục, đuôi nhọn, mặt nhẵn gân song song Đối với cây cao su thì lá có vai trò rất quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến sản lượng mủ Về phương diện sinh thái cây cao su phát triển tốt ở vùng xích đạo Đòi hỏi nhiệt độ trung bình 25oC, lượng mưa 1500 mL mỗi năm, có thể chịu được hạn nhiều tháng, ít đòi hỏi về chất lượng đất, ở nước ta cây cao su được trồng từ Bắc đến Nam (Nguyễn Hữu Trí., 2004) 1.1.4 Vai trò và tình hình sản xuất Cây cao su là loại cây công nghiệp dài ngày, cung cấp mủ và gỗ cho rất nhiều ngành công nghiệp Đây cũng là loại cây có giá trị kinh tế cao trong các lĩnh vực nông - lâm - công nghiệp Trong những năm gần đây, sản lượng mủ không ngừng được nâng cao nhờ những cải tiến về giống, kỹ thuật nông nghiệp, quy trình khai thác Đến năm 2004, tổng diện tích cao su cả nước đạt 454000 ha Sản lượng Trang 19402700 tấn, năng suất 1370 kg/ha/năm Năm 2005, toàn ngành cao su xuất khẩu 587000 tấn đạt kim ngạch xuất khẩu 804 triệu USD, là nông sản đứng thứ 2 về kim ngạch xuất khẩu sau lúa Nếu tính cả đồ gỗ thì tổng kim ngạch xuất khẩu của toàn ngành cao su Việt Nam năm 2005 ước lượng trên 1 tỉ USD Hơn nữa những nghiên cứu gần đây về ảnh hưởng của vườn cây cao su với môi trường đã nêu lên khả năng đóng góp về sinh khối và dưỡng chất của cây cao su sau một chu kỳ trồng, khai thác tương đương với rừng nhiệt đới ở vùng nhiệt đới ẩm, giúp cho đất trồng cây cao su được cải thiện về lý và hóa tính (Trần Thị Thúy Hoa., 2006) 1.2 TÌNH HÌNH BỆNH RỤNG LÁ TRÊN CÂY CAO SU 1.2.1 Phân bố Bệnh rụng lá Corynespora do tác nhân là nấm C cassiicola, có tác hại lớn tại các nước trồng cao su trong khu vực Đông Á và Nam Á Năm 1936 tại Sierra Leone (Châu Phi) bệnh xuất hiện lần đầu tiên, tiếp theo lần lượt ghi nhận tại Ấn Độ năm 1958; Malaysia năm 1961; Nigeria năm 1968; Thái lan, Sri Lanka và Indonesia năm 1985; Brazil và Bangladesh năm 1988 Bệnh gây thiệt hại nặng nhất tại Sri Lanka, nơi phải nhổ bỏ và trồng lại trên 5000 ha Tại Malaysia, Thái Lan và Indonesia nhiều ngàn ha cao su bị hại nặng làm ảnh hưởng lớn đến sản lượng và sinh trưởng đôi khi gây chết toàn bộ cây (Phan Thành Dũng, 2009) Tháng 8 năm 1999 bệnh xuất hiện tại Việt Nam, gây hại nặng cho các dòng vô tính: RRIC 103, RRIC 104 và LH 88 / 372 Năm 2010, bệnh đã phát sinh trên diện rộng ở một số tỉnh miền Đông Nam Bộ, Tây Nguyên và miền Trung, tập trung trên dòng vô tính cao su RRIV4, hiện chiếm diện tích đã trồng khá lớn ở cả những vùng cao su đại điền và tiểu điền (Phan Thành Dũng và cs, 2010) 1.2.2 Tác hại bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su 1.2.2.1 Sri Lanka Dòng vô tính RRIC 103 do RRISL lai tạo từ năm 1958 được đánh giá sinh trưởng mạnh và sản lượng mủ cao, đến cuối thập niên 70 khuyến cáo trồng đại trà Đến năm 1985, phải hủy và trồng lại trên 5000 ha các dòng vô tính cũ (PB 86, ) Trang 20với sản lượng thấp nhưng có khả năng kháng bệnh Chính phủ bồi thường cho người trồng cao su bị thiệt hại trên 5000000USD Trong giai đoạn 1985 - 1986 các dòng vô tính mẫn cảm với bệnh: RRIC 103, RRIC 104, RRIM 600, 725, Tjir 1, IAN 873 FX 25 và RRIIC 52 Gần đây có thêm một số dòng mẫn cảm mới: RRIC110, RRIC 131, RRIC 132 và RRIC 133 (Jayasuriya và Thennakoon., 2007; Phan Thành Dũng., 2000) 1.2.2.2 Ấn Ɖộ Năm 1996 dịch bệnh lớn bùng phát, nguy hiểm nhất trên dòng vô tính RRII 105 chiếm gần 80 % diện tích cao su trong nước Bệnh gây giảm sản lượng mủ đến 50 % ở vùng bị hại nặng Hằng năm, phun thuốc đại trà trên 10000 ha, để hạn chế dịch bệnh và áp dụng ở những vùng có điều kiện thuận lợi cho bệnh xuất hiện Giai đoạn ban đầu: RRIM 600, RRIM 610, RRIM 622 và Tjir 1 Giai đoạn sau: RRII 105, RRII 118, RRII 300, PR 107, PR 255, PR 261, PB 86, PB217, PB235, PB255, PB 260, PB 311 (Jayasinghe, 1997; Phan Thành Dũng, 1995) 1.2.2.3 Indonesia Vào thập niên 80, 1200 ha cao su bị nhiễm bệnh nặng và phải chặt bỏ 400 ha, thiệt hại khoảng 200 triệu Rupiah 70 % diện tích cao su trong nước bị bệnh gây hại ở mức độ khác nhau Nhiều dòng vô tính cao sản phải loại bỏ: IAN 873, một số PR 300 serses Bệnh làm giảm sản lượng từ 30 – 50 % Giai đoạn ban đầu: RRIC 103, KRS 21, RRIM 600, RRIM 725, PPN 2444, PPN 2477, PPN 2658, IAN 873 và GT 1 Giai đoạn sau: AVROS 2037, PR 300, PR 303 và nhiều dòng vô tính thuộc series IR 100, IR 200 (Jayasinghe, 1997) 1.2.2.4 Malaysia Năm 1985 dịch bệnh bùng phát, nhiều ngàn ha cao su bị hại nặng, làm ảnh hưởng lớn đến sản lượng và sinh trưởng, đôi khi chết toàn bộ cây Các dòng vô tính cao su GT 1, RRIM 600 và một số RRIM 2000 series, IAN 873 phải loại bỏ do mẫn cảm với bệnh Bệnh hiện diện trên cả nước và gây hại nặng các tỉnh phía nam Trang 21Giai đoạn ban đầu: RRIC 103, Fx 25, RRIM 725, KRS 21, PPN 2658, PPN 2444 và PPN 2447 Giai đoạn sau: GT 1, PR 107, PBIG, PB 217, PR 261, RRIM 600, RRIM 605, RRIM 701, RRIM 702, RRIM 705, RRIM 2015 và RRIM 2020 (Phan Thành Dũng, 1995; Chee, 1988) 1.2.2.5 Тһáі Lan Xuất hiện năm 1985 và làm chết 2 % số cây của dòng vô tính RRIC 103 và KRS 21 trong vườn thí nghiệm trao đổi giống quốc tế Bệnh hại nặng ở các vùng phía Nam, Tây và Tây Nam Số lượng dòng vô tính mẫn cảm tăng đáng kể Giai đoạn ban đầu: RRIC 103, KRS 21 Giai đoạn sau: RRIM 600, GT 1, KTS 225, 226, PR 255, PR 305, RRIT 251 và Songkhla 36 (Phan Thành Dũng, 1995) 1.2.2.6 Châu Phi Xuất hiện hầu hết tại các nước trồng cao su như: Cote d’Ivore, Gabon, Cameroon và Nigeria Bệnh gây hại trên nhiều dòng vô tính và làm rụng đến 50 % tán lá, dẫn đến giảm 20 - 30 % sản lượng ở vùng có điều kiện thuận lợi Các dòng vô tính bị nhiễm bệnh: RRIC 103, RRIC 110, PB 235, PB 260, PB 28/59, một số dòng vô tính IRCA, MDF 372, RRIM 600, GT 1 và một số dòng vô tính NIG 800 series (Jayasinghe, 1997) 1.2.2.7 Việt Nam Xuất hiện vào tháng 8 năm 1999 tại RRIV, gây hại cho dòng vô tính: RRIC 103, RRIC 104, LH 88/372 Cuối năm 1999, hiện diện tại công ty Đồng Nai, Dầu Tiếng, Phước Hoà và Đồng Phú Đầu năm 2000, gây hại nặng trên diện tích gần 200 ha tại công ty Lộc Ninh ở các lứa tuổi của cây cao su Gây bệnh trên lá non, già và cả chồi Hậu quả, gây rụng lá hàng loạt làm ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và sản lượng Hơn 3000 cây cao su của các dòng vô tính RRIC 103, RRIC 104, LH 88/372 phải tiêu huỷ Tiếp theo nhiều diện tích cao su trồng bằng dòng vô tính RRIC 104 phải trồng lại Từ đó đến nay, bệnh có sự thay đổi về triệu chứng cũng như đang tích lũy để có cơ hội bùng phát Trang 22Giai đoạn ban đầu: RRIC 103, RRIC 104 và LH 88/372 Giai đoạn gần đây: RRIV4 Nhiều dòng vô tính nhiễm bệnh ở mức độ khác nhau trong đó có RRIM 600, GT 1, PB 235, PB 260, VM 515, RRIC 110… (Phan Thành Dũng và cs., 2010) 1.3 NẤM Corynespora cassiicola 1.3.1 Lịch sử phát hiện nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei Do nấm Corynespora có phổ ký chủ rộng nên đã có rất nhiều nhà khoa học tìm thấy loại nấm này trên nhiều ký chủ khác nhau Đầu tiên, vào năm 1896 Cooke phát hiện nấm này trên cây dưa leo và cây dưa hấu tại Mỹ, đặt tên là Cercospora melonis Sau đó Gusgow, (1906) đã đặt tên là Corynespora maizei khi ông tìm thấy chúng trên cây dưa leo tại Đức Đến năm 1948, các nhà khoa học Trung Quốc cho rằng loại nấm họ tìm được trên cây đậu nành, đậu đũa tại Trung Quốc tương tự như những loại nấm gây bệnh trên cùng loại ký chủ ở Mỹ trước đó và họ đặt tên là Corynespora vignicola Kawamura Liu (Kawamura, 1948) Mặc dù có rất nhiều tên gọi khác nhau nhưng cuối cùng Wei cũng đã thu thập, phân tích tất cả những tài liệu về nấm này và khẳng định chúng đều thuộc một loài là C cassiicola Và ông đã đặt tên cho chúng là C cassiicola (Berk & Curt.) Wei (Wei, 1950) Hiện nay, các kỹ thuật sinh học phân tử phát triển, càng khẳng định nhận định của Wei là hoàn toàn đúng 1.3.2 Phân loại học Theo nghiên cứu phân loại (Kirk và cs., 2001) thì nấm C cassiicola được phân loại như sau: Lớp: Dothideomycetes Bộ: Pleosporales Họ: Corynesporascaceae Chi: Corynespora Loài: Corynespora cassiicola Trang 231.3.3 Đặc đểm hình thái Kích thước trung bình của đính bào tử phân lập từ cây cao su (Hevea brasiliensis) là 64,4 x 5,52 µm (23,42 - 132,6 x 2,60 - 7,80 µm) Bào tử nảy mầm tạo ra một hoặc nhiều ống mầm giữa các vách ngăn, nhưng các ống mầm thường mọc nhiều ở các tế bào tận cùng của bào tử (Chee, 1988) Phan Thành Dũng, (2004), đã ghi nhận sự biến thiên về kích thước và hình dạng của đính bào tử phân lập từ lá cao su bị nhiễm bệnh ngoài tự nhiên và nuôi cấy trên môi trường (PDA) Chiều rộng trung bình của đính bào tử và cuống bào tử lớn hơn và số vách ngăn trung bình nhiều hơn Đính bào tử phân lập từ lá cao su thường dài, thon và có hình que trong môi trường nuôi cấy nhưng có đáy hơi rộng Hình 1.1 Khuẩn lạc nấm C cassiicola trên môi trường PDA (A) mặt trên của vi nấm, (B) mặt dưới của vi nấm Trang 24Hình 1.2 Bào tử nấm C cassiicola nhuộm bằng dung dịch lаctophenol 1.3.4 Đặc điểm sinh lý C cassiicola có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ 8 – 36 oC trên môi trường PDA, thích hợp nhất ở 28 oC, ngưng phát triển ở nhiệt độ trên 40 oC. C cassiicola trên các ký chủ khác nhau có nhiệt độ phát triển tối ưu khác nhau Khuẩn ty của C cassiicola phát triển tốt trong điều kiện tối Khuẩn lạc hình thành thay đổi theo mức độ chiếu sáng, phát triển rộng và mỏng dưới ánh sáng huỳnh quang, dày và tụ lại trong điều kiện tối Nấm dễ dàng phát triển trên môi trường nhân tạo nhưng rất khó hình thành bào tử Đối với C cassiicola trên cây cao su, khuẩn lạc phát triển tốt nhất trên môi trường PDA ở nhiệt độ 28 oC Trên cây cao su, bào tử nấm được phóng thích vào ban ngày và cao điểm từ 8 - 11 giờ Sau thời gian mưa nhiều và tiếp theo nắng ráo, số lượng bào tử phóng thích nhiều nhất Bào tử có khả năng tồn tại trên các vết bệnh hoặc trong đất với thời gian dài, trên lá cao su khô nấm vẫn tồn tại và giữ nguyên khả năng gây bệnh đến 3 tháng Nấm xâm nhập chủ yếu ở mặt dưới lá qua biểu bì và khí khỗng, ngoài ra nấm còn tiết ra men (cellulose) giúp phân hủy màng tế bào (Phan Thành Dũng, 2009; Jayasuriya và cs., 2007) Nấm C cassiicola xâm nhập chủ yếu ở mặt dưới lá qua biểu bì và khí khổng, ngoài ra nấm còn tiết ra men (cellulose) giúp phân hủy màng tế bào Trong quá trình sinh trưởng nấm còn tiết ra chất độc (CC toxin), hợp chất này rất độc cho cao su, Trang 25cho nên chỉ với một vết bệnh nhỏ trên gân lá chính cũng đủ gây rụng lá Nấm có khả năng gây hại cho cả lá già và non cũng như cuống lá và chồi (Phan Thành Dũng, 2009) Hơn nữa, do xảy ra quanh năm và suốt chu kỳ sống của cây cao su nên có tác hại lớn, nhất là cho các dòng vô tính cao su mẫn cảm Ngoài cây cao su, nấm còn ký sinh trên 150 loại cây thuộc nhiều họ khác nhau, trên 80 nước trên nhiều vùng khí hậu từ nhiệt đới đến ôn đới và gây hại trên tất cả bộ phận của cây từ lá tới rễ (Phan Thành Dũng, 2009) Trên lá già một số vết bệnh xuất hiện vết thủng Triệu chứng đặc trưng với vết bệnh màu đen có hình dạng xương cá dọc theo gân lá Nếu gặp điều kiện thuận lợi các vết lan rộng gây chết từng phần lá do sự phá hủy của lục lạp, sau đó toàn bộ lá đổi màu vàng - cam và rụng từng lá một Trên cuống lá và chồi: trên cuống lá với vết nứt màu đen có chiều dài 0,5 - 3,0 mm Các chồi xanh dễ nhiễm, đôi khi nấm bệnh cũng gây hại chồi đã hóa nâu Dấu hiệu đầu tiên với vết nứt dọc theo cuống và chồi có dạng hình thoi, có mủ rỉ ra sau đó hóa đen, vết bệnh có thể phát triển dài đến 20 cm gây chết chồi, đôi khi chết cả cây Nếu cuống lá bị hại, toàn bộ lá chết bị rụng khi còn xanh dù không có một triệu chứng nào xuất hiện trên phiến lá Trang 26Hình 1.3 Các dạng triệu chứng gây hại củа nấm C cassiicola trên cây cao su A Dạng bệnһ đốm và xương cá B Dạng đốm trên cuốn lá C Dạng đốm có lỗ và vіền vànһ D Dạng cһáy pһіến lá (Vіện Ngһіên cứu Cao su Vіệt Nam) 1.3.5 Con đường xâm nhập và khả năng gây bệnh của nấm Corynespora cassiicola Nấm C cassiicola xâm nhập chủ yếu ở mặt dưới lá qua biểu bì và khí khổng, ngoài ra nấm còn tiết ra men (cellulose) giúp phân hủy màng tế bào Trong quá trình sinh trưởng nấm còn tiết ra chất độc (CC toxin), hợp chất này rất độc cho cao su, cho nên chỉ với một vết bệnh nhỏ trên gân lá chính cũng đủ gây rụng lá, nấm có khả năng gây hại cho cả lá già và non cũng như cuống lá và chồi Hơn nữa, do xảy ra quanh năm và suốt chu kỳ sống của cây cao su nên có tác hại lớn, nhất là cho các dòng vô tính mẫn cảm (Phan Thành Dũng, 1995) Ngoài cây cao su, nấm còn là ký sinh của trên 150 loại cây trồng thuộc nhiều họ khác nhau trên 80 nước thuộc nhiều vùng khí hậu từ nhiệt đới đến ôn đới và có khả năng gây hại trên tất cả các bộ phận của cây từ lá đến rễ Chưa có ghi nhận nấm từ cây cao su gây hại cho cây khác và ngược lại (Phan Thành Dũng, 2000) A C B D Trang 271.4 VI KHUẨN NỘI SINH Bacillus 1.4.1 Phân loại Theo khóa phân loại của Bergey’s, Bacillus được phân loại như sau: Giới: Prokaryota thuộc Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus 1.4.2 Phân bố Đã có 51 loài thuộc chi Bacillus được xác định chính xác và nhiều loài khác chưa được phân loại rõ ràng Vi khuẩn Bacillus thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc, chúng được phân bố hầu hết trong tự nhiên Phần lớn chúng cư trú trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, vùng đất hoang thì vi khuẩn Bacillus rất hiếm Nước và bùn cửa sông cũng như ở nước biển cũng có mặt bào tử và tế bào Bacillus (Linda, 1999) Bacillus có khả năng chịu đựng và tồn tại trong một thời gian dài trong điều kiện bất lợi, nên đa số chúng rất phổ biến và có thể phân lập được từ nhiều nguồn Trong đất, Bacillus chủ động trao đổi chất khi có sẵn các cơ chất thích hợp cho sự tăng trưởng của nó và nó tạo bào tử khi nguồn dinh dưỡng cạn kiệt Đây cũng là chiến lược sinh tồn của vi sinh vật sống trong môi trường đất Vì đa số các loài Bacillus có thể phân giải hiệu quả các loại cao phân tử sinh học (protein, tinh bột, pectin ) nên chúng đóng một vai trò quan trọng trong vòng tuần hoàn sinh học của cacbon và nitơ (Todar, 2008) 1.4.3 Hình thái, kích thước Đặc điểm cụ thể về chi này được mô tả như sau: tế bào hình que thẳng hoặc gần thẳng, có đầu tròn hay vuông, kích thước 0,5 - 1,2 x 2,5 - 10 µm Trừ B Trang 28anthracis và B mycoides, hầu hết các loài Bacillus đều di động, mặc dù có sự khác biệt rất lớn về khả năng di động trong mỗi loài, roi điển hình nằm hai bên Hình thành nội bào tử chịu nhiệt, chỉ có một bào tử trong một tế bào, hình trụ, oval, tròn, thỉnh thoảng có hình bầu dục Sự hình thành bào tử không bị ngăn cản bởi tiếp xúc với không khí Trao đổi chất trong môi trường hiếu khí hoặc cả hô hấp và lên men đồng thời, đòi hỏi nhiều thành phần dinh dưỡng trong môi trường Chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi chuyển hoá hô hấp là oxi phân tử Hầu hết cho catalase dương tính (Nguyễn Văn Thanh và cs., 2009; Nguyễn Đức Quỳnh Như, 2008) Phần lớn các vi khuẩn thuộc chi Bacillus có vỏ nhầy là polysaccharide, một số ít là glycopeptit Vi khuẩn có vỏ nhầy là polysaccharide khi phát triển trên môi trường dinh dưỡng thạch, thường tạo thành khuẩn lạc ướt, bóng nhờn gọi là khuẩn lạc S (Smoth) Vi khuẩn có vỏ nhầy là glycopeptit tạo khuẩn lạc khô xù xì R (Rough) Vỏ nhầy có tác dụng giúp vi khuẩn chống lại các điều kiện bất lợi của môi trường (Nguyễn Văn Thanh và cs., 2009).1.4.4 Dinh dưỡng và tăng trưởng Phần lớn chúng là ưa nhiệt trung bình, khoảng nhiệt độ tối đa cho sự phát triển của tế bào dinh dưỡng từ 25 ºC – 75 ºC, khoảng pH rộng 2 - 11, nồng độ muối từ dưới 2 % - 25 % (Nguyễn Văn Thanh và cs., 2009; Nguyễn Đức Quỳnh Như, 2008) 1.4.4.1 Môі trường nuôі cấy Môi trường tự nhiên: các loài Bacillus là sinh vật hóa dị dưỡng linh hoạt, có khả năng hô hấp trong khi sử dụng nhiều hợp chất hữu cơ đơn giản (đường, amino axit, axit hữu cơ) Trong một số trường hợp, chúng còn có thể lên men carbohydrate trong một phản ứng hỗn hợp tạo ra glycerol và butanediol Một số ít loài như B megaterium không đòi hỏi tác nhân tăng trưởng hữu cơ, một số khác lại cần có amino axit, D - vitamin hay cả hai (Nguyễn Văn Thanh và cs., 2009; Nguyễn Đức Quỳnh Như, 2008) Môi trường thí nghiệm: các loài Bacillus phát triển tốt trên các môi trường dinh dưỡng thương mại gồm các thành phần cơ bản như: pepton, cao thịt, glucose, Trang 29lactose, chất khoáng… mặc dù trong một số trường hợp đặc biệt, các môi trường này cần được điều chỉnh pH hoặc nồng độ muối (pH từ 2 - 11, và nồng độ muối từ dưới 2 - 25 %) Trong phòng thí nghiệm, dưới điều kiện phát triển tối ưu, thời gian thế hệ của Bacillus khoảng 25 phút Trong môi trường nuôi cấy lỏng chúng tạo váng trên bề mặt Trên môi trường thạch tạo khuẩn lạc to, tròn hay hình dạng bất thường, có màu xám ngả vàng nhạt, trắng trong hay màu trắng đục, bề mặt khóm sần sùi, hơi nhăn hoặc tạo màng mịn lan trên bề mặt thạch Hình dạng khuẩn lạc thay đổi tùy theo độ tuổi và các đĩa nuôi cấy riêng lẻ có thể tạo ra các dạng khuẩn lạc khác nhau B larvae và B popilliae trong môi trường nuôi cấy cần có thêm thiamine Chúng thường phát triển trên môi trường chứa trypton, glucose, dịch chiết nấm men B pasteuri cần bổ sung 0,5 - 1 % urea vào tất cả môi trường nuôi cấy B stearothermophilus phát triển trên môi trường dinh dưỡng có bổ sung canxi và sắt Trong nuôi cấy sự tạo bào tử được cảm ứng sau pha tăng trưởng hàm mũ do nồng độ dinh dưỡng bị cạn kiệt, đặc biệt là việc thiếu nguồn carbon, nitrogen, hoặc photpho Có thể sử dụng môi trường nhân tạo để cảm ứng tạo bào tử như Difico sporulation agar (DSM), 2xSG agar (Nguyễn Văn Thanh và cs., 2009; Nguyễn Đức Quỳnh Như, 2008) 1.4.4.2 Nhiệt độ phát triển Phần lớn các chủng Bacillus ưa nhiệt trung tính và tạo khuẩn lạc đặc trưng sau 24 giờ nuôi cấy ở 37 oC Các loài ưa nhiệt như B stearothermophilus phát triển từ 55 oC đến 70 oC, thường là khoảng 60 oC Các loài này ưa nhiệt bắt buộc và không thể phát triển ở 37 oC Loài ưa nhiệt trung bình như B coagulans phát triển tốt tại 45 oC đến 50 oC Loài gây bệnh cho côn trùng như B larvae và B popilliae phát triển ở nhiệt độ từ 25 oC đến 30 oC Tương tự như vậy đối với B thuringiensis và B cereus (Nguyễn Văn Thanh và cs., 2009; Nguyễn Đức Quỳnh Như, 2008) 1.4.4.3 Quá trình tạo bào tử của Bacillus Khi gặp điều kiện bất lợi hay trong chu trình phát triển tự nhiên, Bacillus có khả năng hình thành nội bào tử Quá trình hóa bào tử bắt đầu vào cuối thời kỳ sinh trưởng, phát triển, khi gặp điều kiện thức ăn cạn kiệt hoặc có tích luỹ các sản phẩm Trang 30trao đổi chất có hại Đặc điểm nổi bật của bào tử Bacillus là có khả năng chịu nhiệt, chịu chất độc và men phân giải nhờ có lớp vỏ bào tử Trong thời kỳ mới bắt đầu hình thành nội bào tử, Bacillus tiết ra kháng sinh tiêu diệt các vi khuẩn xung quanh Kháng sinh đó làm phá vỡ thành tế bào của vi khuẩn lân cận, giải phóng chất dinh dưỡng và dùng làm thức ăn cho nó, đồng thời chất dinh dưỡng đó có thể giúp nó quay trở lại dạng sinh dưỡng (Nguyễn Đức Quỳnh Như, 2009) 1.4.4.4 Sinh sản Các loài Bacillus sinh sản bằng hình thức nhân đôi tế bào Khi tế bào trưởng thành, thể nhân sẽ tập trung giữa tế bào và phân chia trực tiếp từ 1 tế bào ban đầu thành 2 tế bào mới Hai tế bào này sau đó lại tiếp tục nhân đôi thành 4 tế bào… Cứ như vậy từ 1 tế bào vi khuẩn ban đầu sau một thời gian nhân đôi sẽ tạo ra 2n tế bào Do vậy, sự sinh sản của vi khuẩn theo phương thức tăng cấp số nhân (Nguyễn Văn Thanh và cs., 2009) 1.4.5 Ứng dụng của Bacillus Bacillus được ứng dụng nhiều trong sản xuất enzym công nghiệp vì nó có khả năng sinh các loại enzyme như amylase, alkaline phosphatase, cellulase, cyclodextrin glucanotransferase, chitinase, glucanase, lipase, serine, protease,… Ngoài ra, Bacillus còn có khả năng sinh các chất chuyển hóa sơ cấp như nucleotide xanthanylic acid, inosinic acid, guanilic acid,… Dưới điều kiện sống thiếu dinh dưỡng Bacillus còn có khả năng sinh các loại kháng sinh peptid như surfactin vừa có tính kháng khuẩn, vừa có tính kháng nấm, hay subtilin có hoạt tính kháng khuẩn và kháng khối u (Toure và cs., 2004; Hong và cs., 2005) Một số chủng Bacillus như Bacillus laterosporus, Bacillus firmus và Bacillus cereus hiện nay đang được nghiên cứu trong sản xuất chất dẻo sinh học (hydroxybutyrate) Bacillus pasteurii được đưa vào đất ướt đã tạo ra calcite - một chất ximăng liên kết đất, chuyển hóa đất thành đá làm vững nền móng các tòa nhà và giúp chúng chịu được động đất Trong chế phẩm sinh học, Bacillus thuringiensis được dùng làm thuốc trừ sâu vi sinh Bacillus thuringiensis subsp làm chế phẩm Israelensis serotype H14 diệt Trang 31lăng quăng Do khả năng tạo bào tử chịu nhiệt, sinh các loại enzym ngoại bào và khả năng đối kháng với các vi sinh gây bệnh như Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae, Candida albicans, E coli, S aureus, Shigella, Vibrio spp.,… nên Bacillus spp được sử dụng làm probiotic trong chăn nuôi và thủy sản, Bacillus subtilis dùng làm chế phẩm phòng và điều trị viêm tai mũi họng ở người (Berkeley và cs., 2002) Bacillus còn dùng làm vật chủ biểu hiện gen để sản xuất các loại enzym, acid amin, vitamin và polysaccharide Các chủng Bacillus brevis có khả năng tiết nhiều protein nhưng không tiết protease vào môi trường nuôi cấy nên được sử dụng làm hệ thống vector chủ biểu hiện các protein tái tổ hợp của người, động vật hữu nhũ và các sinh vật khác như nhân tố tăng trưởng biểu mô, insulin, interleukin 1 - β của bò, antigen virus viêm gan B, CGTase (Hong và cs., 2005; Nguyễn Đức Quỳnh Như và cs., 2009; Nguyễn Văn Thanh và cs., 2009).1.4.6 Hợp chất kháng nấm của Bacillus Hiện nay, có rất nhiều chất kháng nấm là các sản phẩm chuyển hóa của Bacillus Các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm đã được khai thác trong y học và ngành công nghiệp Đồng thời các chất kháng nấm này thường sử dụng để phòng chống và kiểm soát bệnh trên cây như một tác nhân kiểm soát sinh học (Zhang và cs., 2008; Kumar và cs., 2009) Bacillus mang lại nhiều lợi ích cho việc bảo vệ chống lại những nguồn bệnh do vi khuẩn và vi nấm gây ra bởi khả năng hình thành nội bào tử của chúng và hoạt tính kháng sinh phổ rộng Bacillus sản xuất ra 167 hợp chất sinh học chống lại vi khuẩn, nấm, động vật nguyên sinh và virus Các hợp chất này thường là enzym thủy phân hay là các peptid có hoạt tính sinh học, hoặc các hợp chất polyketide (Zhang và cs., 2008; Kumar và cs., 2009) Enzyme: Bacillus có khả năng sản xuất nhiều loại enzym phân hủy thành tế bào nấm như chitinase, protease, glucanase… Các enzyme này phá hủy thành tế bào của nấm, đặc biệt là chitinase Nhiều chủng Bacillus có thể sản xuất enzym chitinase ở mức cao do đó làm gia tăng khả năng kháng nấm Trong nghiên cứu của Trang 32Chang và cs 2003, Bacillus cereus QQ308 sản xuất các enzym chitinase, chittosanase và protease khi phát triển trên môi trường có chứa bột vỏ tôm và vỏ sò, có tác dụng ức chế sự nảy mầm bào tử và kéo dài ống mầm của Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Pythium ultimum (Bossche, 2003; Maheshwari, 2010) Các peptide: dựa vào đặc điểm cấu trúc của peptid, nó có thể được phân thành 3 loại: cyclic lipopeptide (CLP), phosphono - oligopeptide và dipeptide • Cyclic lipopeptide (CLP): hầu hết các nghiên cứu cho thấy các hợp chất kháng nấm từ Bacillus có bản chất là những peptide vòng nhỏ (như là iturin, fengycin, bacillopeptin và surfactin) liên kết với acid béo Chúng bao gồm 7 (surfactin và iturin) hoặc 10 α - aminoacid (fengycin) được liên kết với một acid béo chỉ có β - amino (iturin) hoặc β - hydroxy (surfactin và fengycin) Chiều dài của chuỗi acid béo này có thể thay đổi từ C - 13 đến C - 16 cho surfactin, từ C - 14 đến C - 18 trong trường hợp của fengycin Iturin và fengycin biểu hiện hoạt tính kháng nấm mạnh Nghiên cứu của Moyne và cs., (2001) đã chứng minh, dịch nuôi cấy Bacillus subtilis AU195 có hoạt tính kháng Aspergillus flavus mạnh nhất sau 7 ngày nuôi cấy, hợp chất kháng nấm có bản chất là iturin Nghiên cứu của Zhang và cs., (2008), Bacillus subtillus B - FS06 có khả năng sinh hợp chất bacillomycin có hoạt tính kháng lại Aspergillus flavus Hợp chất này vẫn giữ được hoạt tính khi thay đổi pH từ 2 đến 12 trong 24 giờ hoặc xử lý nhiệt ở 100 oC trong 30 phút Lượng hợp chất có hoạt tính 200μg/g có thể ức chế hoàn toàn Aspergillus flavus trên đậu phộng sau 5 ngày xử lý Nghiên cứu của Zhao và cs., (2010) chứng minh dịch lên men và dịch chiết n - butanol của Bacillus vallismortis ZZ185, được phân lập từ cây trà đắng (Ilex latifolia), có khả năng ức chế in vitro nấm gây bệnh cho cây trồng như Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum f sp spinaciae, Aspergillus alternata, Rhizoctonia solani, Cannida parasitica và Pythium capsici; và có hiệu quả cao trong thử nghiệm in vivo đối với giống lúa mì bị nhiễm Aspergillus altermata và Fusarium graminearum Nghiên cứu cũng chỉ ra hợp chất kháng nấm Trang 33này là hỗn hợp của hai bacillomycin D chịu nhiệt: bacillomycin D (n - C14) và bacillomycin D (iso - C15) thuộc nhóm iturin • Phosphono - oligopeptide và dipeptide: có rất ít các nghiên cứu đề cập đến các chất kháng nấm từ Bacillus có bản chất là phosphono - oligopeptide và dipeptide Theo sự nghiên cứu của Kugler và cs., (1990) cho thấy rhizocticin A, một phosphono - oligopeptide, thành phần chính có hoạt tính kháng nấm của Bacillus subtilis ATCC 6633, đã được sử dụng để thử nghiệm độ nhạy cảm và cơ chế phân tử của các kháng sinh Rhizocticin A có khả năng ức chế sự hình thành của sợi nấm Tuy nhiên hiệu quả kháng nấm của rhizocticin A đã bị trung hòa bởi một loạt các acid amin và oligopeptide Bacilysin là một dipeptide được tổng hợp không thông qua ribosom có hoạt tính chống lại nhiều vi khuẩn và một số loại nấm Ngoài ra một số hợp chất kháng nấm có bản chất là polyketid như difficidin và oxydifficidin chiết từ Bacillus amyloliquefaciens FZB 42 Đây là các hợp chất có độ không bão hòa cao, gồm 22 nhóm macrolide với một nhóm phosphat (Chen và cs., 2006) Một chất kháng nấm polyketide khác của Bacillus là bacillaene, là phân tử dạng thẳng với 2 liên kết amide: liên kết 1: một α - hydroxy carboxylic acid với một β - amino carboxylic acid chứa một hexane liên hợp; liên kết 2: liên kết hexane chứa carboxylic acid với một (ω - 1) amino carboxylic acid chứa một mối ba liên hợp (Chen và cs., 2006; Butcher và cs., 2007) 1.4.7 Tình hình nghiên cứu hợp chất có hoạt tính sinh học từ chủng Bacillus Bacillus là một trong những loài được sử dụng nhiều nhất trong quá trình kiểm soát sinh học của thực vật Năm 2006, Nalisha và cộng sự tiến hành nghiên cứu nhằm mục đích điều tra đặc điểm của hợp chất hoạt tính sinh học được sản xuất bởi Bacillus subtilis chống lại Sclerotium rolfsii - loại nấm gây bệnh trên thực vật Năm 2015, Torres và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm hoạt tính từ chủng Bacillus sp., phân lập từ mật ong, có hoạt tính kháng khuẩn chống lại ba loại vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes, B cereus và S.aureus ATCC 29213 Okulate., (2009) Trang 34đã nghiên cứu đặc tính của hợp chất sinh học được sản xuất bởi Bacillus sp kháng nấm Paenibacillus thông qua dịch nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thông thường Tabbene và cs, (2009) đã phân lập được chủng B subtilis B38 từ đất, chủng này có tạo ra các chất chuyển hóa có khả năng kháng khuẩn và kiểm soát các vi sinh vật gây bệnh bao gồm Staphylococcus kháng methicillin Năm 2010, Tabbene và cộng sự đã tinh chế được hợp chất S07 - 2 từ Bacillus subtilis B38 có khả năng chống lại P aeruginosa, năm 2011 tinh chế bacillomycin từ chủng vi khuẩn trên có khả năng chống nấm Candida Bacillus mang lại nhiều lợi ích cho việc bảo vệ chống lại những nguồn bệnh do vi khuẩn và vi nấm gây ra bởi khả năng hình thành nội bào tử của chúng và hoạt tính kháng sinh phổ rộng Bacillus sản xuất ra 167 hợp chất sinh học chống lại vi khuẩn, vi nấm, động vật nguyên sinh và virus (Kumar A và cs, 2009) Bacillus sp sản xuất ra lượng lớn enzyme thủy phân như α - amylase, β - glucanase, xylanase, protenase, chitinase,… Các enzym này phá hủy thành tế bào của nấm, đặc biệt là chitinase, trong nghiên cứu của Gomashe Ashok và cs, (2014) , Bacillus subtilis NCIM (2010) sản xuất enzyme chitin có tác dụng chống lại sự sinh trưởng của nấm Các dung môi hữu cơ là những hợp chất ít phân cực nên thường không tan trong nước, chất có độ phân cực rất lớn Diethyl ether, toluen, n - hexane là các dung môi có tỉ trọng nhỏ hơn nước, chúng nổi ở trên pha nước, chloroform (CHCl3), dichloromethane (CH2Cl2), Carbon tetrachloromethane (CCl ) là các dung môi phổ biến có tỉ trọng lớn hơn nước Trang 35Trong hỗn hợp hai pha, một pha nước chiếm ưu thế, pha kia dung môi chiếm ưu thế Quá trình chiết thường xảy ra với vận tốc lớn nên có thể thực hiện chiết tách Sản phẩm chiết thường khá sạch (Nguyễn Kim Phi Phụng., 2007) 1.5.2 Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng Việc chiết lỏng - lỏng được thực hiện bằng bình lóng Sử dụng lần lượt các dung môi hữu cơ, loại không hòa tan vào nước hoặc loại có thể hỗn hợp được vào nước, để chiết ra khỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực khác nhau (tùy vào độ phân cực của dung môi) Tùy vào tỉ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu cơ nằm ở lớp trên hoặc lớp dưới so với pha nước (Nguyễn Kim Phi Phụng., 2007) Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung môi phân cực thí dụ như: ether dầu hỏa và n - hexane, ether ethyl, cloroform, ethyl acetate, n - butanol… với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi; chiết đến khi không còn chất hòa tan vào dung môi thì đổ sang chiết với dung môi có tính phân cực hơn Dung dịch của các lần chiết được gom chung lại, làm khan nước với các chất làm khan như Na2SO4, MgSO4, CaSO4, …, đuổi dung môi, thu được cao chiết (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007) 1.6 SẮC KÝ BẢN MỎNG Sắc ký bản mỏng còn được gọi là sắc ký phẳng (Planar Chromatography), chủ yếu dựa vào hiện tượng hấp thu, trong đó pha động là một dung môi hay hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ như silica gel hoặc oxid alumin Pha tĩnh này được tráng bằng một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic Bình sắc ký: chậu, hũ hay lọ bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng có nắp đậy Pha tĩnh: một lớp mỏng khoảng 0,25 mm của một loại chất hấp thu, ví dụ như silica gel, alumin… được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic Chất hấp thu trên tấm giá đỡ nhờ sulfat calci khan, hoặc tinh bột, hoặc một loại polymer hữu cơ Trang 36Mẫu cần phân tích: thường là hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ phân cực khác nhau Sử dụng khoảng 1 𝜇L dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2 – 5 %, nhờ một vi quản để chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình Pha động: dung môi hoặc hỗn hợp hai dung môi di chuyển chậm dọc theo tấm lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó Dung môi di chuyển đi lên cao nhờ vào tính mao quản Mỗi thành phần của chất mẫu sẽ di chuyển với các vận tốc khác nhau, đi phía sau mức của dung môi Vận tốc di chuyển này phụ thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh níu giữ các mẫu chất ở lại, tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi (Nguyễn Kim Phi Phụng., 2007) 1.7 SẮC KÝ CỘT Sắc ký cột là phương pháp tách các chất dựa vào độ phân cực của từng chất Tùy theo tính chất mục đích của người thí nghiệm mà ta sử dụng loại sắc ký cột ướt hoặc khô Nhồi cột ướt: dùng các chất hấp phụ có khả năng trương phình như Silicagel, Sephadex Nhồi cột khô: dùng các chất hấp phụ tính trương nở như Al2O3, CaCO3 Tùy độ phân cực khác nhau của các loại hợp chất mà chúng được hòa tan cùng với dung môi chạy và chạy ra ngoài bình hứng Đây là phương pháp tách chất mang tính cơ bản vì có rất nhiều chất có độ phân cực giống hoặc tương đương giống nhau nên khi chiết ra không chỉ chứa duy nhất một chất mà có thể chứa thêm chất khác (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007) Trang 37PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Trang 382.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Thời gian: từ tháng 10/2019 - 7/2020 Địa điểm: • PTN Công nghệ Vi sinh trường Đại học Mở Tp Hồ Chí Minh, cơ sở 3 Bình Dương, 68 Lê Thị Trung, Thành phố Thủ Dầu Một, Bình Dương • Viện Công nghệ Hóa học, Thạnh Lộc 29, Thạnh Lộc, Quận 12, TP Hồ Chí Minh 2.2 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu Chủng vi khuẩn B amyloliquefaciens T3 được chứng minh có khả năng kiểm soát sinh học in vitro nấm C cassiicola Được cung cấp bởi PTN Công nghệ Vi sinh - Trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh Chủng nấm C cassiicola gây bệnh trên cây cao su phân lập tại Thị xã Đồng Xoài, tỉnh Bình Phước, được cung cấp bởi PTN Công nghệ vi sinh - Trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh 2.2.2 Môi trường - hóa chất Trang 39− Kính hiển vi − Máy lắc − Cân điện tử − Máy đo OD − Tủ cấy − Lò viba − Tủ ấm − Tủ sấy − Nồi hấp vô trùng ✔ Dụng cụ − Đĩa petri − Becher − Erlen − Ống đong − Ống nghiệm − Ống ly tâm − Các loại micropipette và đầu típ tương ứng (100 - 1000 µL, 20 - 200 µL) − Một số dụng cụ khác bao gồm: đèn cồn, que cấy vòng, que cấy trang, que cấy mốc Trang 402.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Dựa vào mục tiêu của nghiên cứu, tiến hành thí nghiệm theo sơ đồ sau: Bố trí thí nghiệm Sơ đồ 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm Hoạt hóa chủng B amyloliquefaciens T3 Thu dịch ngoại bào Thu cao chiết chủng Bacillus amyloliquefaciens T3 Khảo sát khả năng kháng C casiicola từ dịch ngoại bào Nuôi cấy và thu dịch Chiết dịch vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens T3 với các hệ dung môi n-hexane, chloroform, dichloromethane, methanol và nước Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp pha loãng Khảo sát khả năng kháng Corynespora casiicola bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch Kirby – Bauer Khảo sát phân đoạn của cao chiết bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) Thu nhận phân đoạn chứa hợp chất có hoạt tính sinh học kháng C casiicola bằng phương pháp sắc ký cột cao chiết Tinh sạch và xác định cấu trúc hợp chất có hoạt tính sinh học có khả năng kháng C casiicola Khảo sát khả năng kháng vi nấm của các cao chiết thu được bằng phương pháp tự sinh đồ