khảo sát đặc điểm phân tử thuộc exon 26 gen apob liên quan đến bệnh cao cholesterol trong máu

Mục tiêu nghiên cứu: Khảo sát đặc điểm phân tử có hoặc không có sự xuất hiện các đột biến điểm: thay thế nucleotide, mất nucleotide hoặc gắn chèn nucleotide trên trình tự gen mục tiêu, đ

TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2020

Mã số sinh viên: 1653010313

Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY

TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2020

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨAVIỆT NAM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Độc lập – Tự do – Hạnh phúc KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là: Đỗ Nguyễn Mai Thy

Ngày sinh: 02/04/1998 Nơi sinh: Vĩnh Long Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã sinh viên: 1653010313 Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

Ký tên

(Ghi rõ họ và tên)

Đỗ Nguyễn Mai Thy

Ý KIẾN CHO PHÉP BẢO VỆ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Lê Huyền Ái Thuý ThS Trương Kim Phượng

Học viên thực hiện: Đỗ Nguyễn Mai Thy Lớp: DH16YD61 Ngày sinh: 02/04/1998 Nơi sinh: Vĩnh Long

Tên đề tài: Khảo sát đặc điểm phân tử thuộc exon 26 gen ApoB liên quan đến bệnh cao

cholesterol trong máu

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép sinh viên:

được bảo vệ khóa luận trước Hội đồng:

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành được bản luận văn tốt nghiệp này là cả một giai đoạn quan trọng và khó quên trong quãng đời sinh viên của em Lời đầu tiên, em xin trân trọng cảm ơn ban giám hiệu nhà trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh vì đã tạo điều kiện về cơ sở và vật chất về hệ thống phòng nghiên cứu đa dạng, đầy đủ thiết bị dụng cụ, thuận lợi cho việc nghiên cứu của em

Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn và lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến PGS TS Lê Huyền Ái Thuý và ThS Trương Kim Phượng đã trực tiếp giảng dạy tận tình, hướng dẫn chi tiết Giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn Nếu không có những lời giảng dạy, động viên và giúp đỡ của các Cô thì em khó mà có thể hoàn thành được luận văn này

Qua đây, em cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến các thầy cô trong khoa Công nghệ Sinh học, các anh chị, bạn bè đã giúp đỡ, động viên cũng như ủng hộ và chia sẻ những kinh nghiệm đã có lại cho em

Cuối cùng, con xin cảm ơn Ba Mẹ đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho con trong suốt quãng đường sinh viên

Em xin chân thành cảm ơn!

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2020 Sinh viên

Đỗ Nguyễn Mai Thy

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

WHO World Health Organization FH Familial Hypercholesterolemia LDL Low Density Lipoprotein HDL HighDensity Lipoprotein VDL Very-Low Density Lipoprotein LDL-C Low Density Lipoprotein Cholesterol HDL-C High Density Lipoprotein Cholesterol VDL-C Very-Low Density Lipoprotein Cholesterol PCR Polymerase Chain Reaction

NGS Next Gen Sequencing

RT-PCR Realtime- Polymerase Chain Reaction CVD Cardiovascular Disease

ApoB Apolipoprotein B

LDLR Low Density Cholesterol Receptor

PCSK9 Poliprotein convertase subtilsin/ kexin loại 9 HeFH Heterozygous Familial Hypercholesterolemia HoFH Homozygous Familial Hypercholesterolemia

MLPA Multiplex Ligation- dependent Probe Amplification NCBI National Center for Biotechnology Information SSCP Single Strand Conformational Polymorphism

2.5.4 Khảo sát thực nghiệm 19 2.5.5 Xác định các dạng biến thể xuất hiện trên vùng trình tự exon 26 gen ApoB

2.5.6 Bước đầu thiết lập cấu trúc mô hình (3D) của chuỗi polypeptide (tương ứng

3.1 Khai thác dữ liệu và phân tích tổng hợp 23 3.1.1 Tỉ lệ đột biến tổng thể trên bộ dữ liệu về gen ApoB 24 3.1.2 Tỉ lệ đột biến trên bộ dữ liệu về gen ApoB, xét theo một số phân hạng 31 3.2 Kết quả khảo sát In silico 34 3.3 Khảo sát thực nghiệm phân tích đặc điểm phân tử vùng trình tự exon 26 trên

3.3.1 Đặc điểm phân tử vùng trình tự exon 26 gen ApoB ở một số mẫu bệnh phẩm

3.3.2 Bước đầu tạo mô phỏng cấu trúc protein ApoB của mẫu bệnh phẩm cao

3.3.3 Tổng hợp dữ liệu phân tử của vùng trình tự 334 bp thuộc exon 26 gen ApoB

DANH MỤC HÌNH

Hình 3 1 Sơ đồ trích xuất dữ liệu trong phân tích tổng hợp 23 Hình 3 2 Đồ thị “Forest plot” và “Funnel plot” phản ánh tỉ lệ “Proportion” đột biến gen ApoB, thuộc 28 nghiên cứu đoàn hệ 28 Hình 3 3 Đồ thị “Forest plot” và “Funnel plot” phản ánh tỉ lệ “Proportion” đột biến gen ApoB, thuộc 22 nghiên cứu đoàn hệ 30

50 Hình 3 18 Mô hình II của cấu trúc ApoB (NP_000375.3), trên công cụ SWISS Model

51 Hình 3 19 Mô hình cấu trúc I của protein ApoB (NP_000375.3) 52

Hình 3 20 Mô hình cấu trúc M17 của protein ApoB, có mang vùng polypeptide tương ứng với exon 26 gen ApoB của mẫu bệnh nhân số M17 52

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2 1 Thành phần phản ứng PCR 21

Bảng 3 1 Thông tin các công bố khoa học về tính chất đột biến trên gen ApoB 24

Bảng 3 2 Dữ liệu đồ thị “Forest plot” biểu thị giá trị “Proportion” của các dạng đột biến

gen APOB trên nhóm bệnh nhân FH, thuộc 28 nghiên cứu đoàn hệ 27

Bảng 3 3 Dữ liệu đồ thị “Forest plot” biểu thị giá trị “Proportion” của các dạng đột biến

gen ApoB trên nhóm bệnh nhân FH, thuộc 22 nghiên cứu đoàn hệ 29

Bảng 3 4 Chỉ số “Proportion” phản ánh tỉ lệ đột biến trên gen ApoB ở bệnh nhân FH,

trên một số phân nhóm, thuộc 28 nghiên cứu đoàn hệ 31

Bảng 3 5 Chỉ số “Proportion” phản ánh tỉ lệ đột biến trên gen ApoB ở bệnh nhân FH,

trên một số phân nhóm, thuộc thuộc 22 nghiên cứu đoàn hệ 32

Bảng 3 6 Thông tin bộ mồi khuếch đại vùng trình tự exon 26 gen ApoB 36 Bảng 3 7 Thông số vật lý của bộ mồi khuếch đại vùng trình tự exon 26 gen ApoB 37

Bảng 3 8 Thông tin bệnh nhân và chỉ số cholesterol trong 20 mẫu máu 38

Bảng 3 9 Các dạng biến thể xuất hiện trên vùng trình tự 334 bp exon 26 gen ApoB, thuộc

Bảng 3 10 Tổng hợp dạng biến thể xuất hiện ở vùng trình tự 334 bp exon 26 gen ApoB,

thuộc một số mẫu bệnh phẩm máu 58

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh Familial hypercholesterol (FH) là bệnh cao cholesterol máu có tính gia đình, là một dạng bệnh di truyền trội, dẫn đến rối loạn chuyển hoá LDL–cholesterol với biểu hiện tăng cao nồng độ LDL–Cholesterol trong máu và là yếu tố nguy cơ gây ra bệnh lý tim mạch (Cardiovascular Diseases – CVD), bệnh động mạch vành sớm (Coronary Artery Diseases – CAD),… Theo tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization –WHO), bệnh lý thiếu máu cục bộ tim (Coronary Artery Disease – CAD), bệnh tim mạch vành (Coronary Heart Disease –CHD) thuộc nhóm bệnh lý gây tử vong cao trên thế giới Sự rối loạn chuyển hoá lipid, cholesterol trong máu (>5 mmol/L) là nguyên nhân hình thành mảng xơ vữa tích tụ trong thành mạch máu, dẫn đến tắc nghẽn các động mạch và động mạch chủ, là nguy cơ dẫn đến bệnh lý thiếu máu cục bộ tim (Coronary Artery Disease – CAD) hoặc bệnh tim mạch vành (Coronary Heart Disease – CHD) [1,2,3] Bệnh cao cholesterol mang tính gia đình (FH) có hai dạng là đồng hợp và dị hợp, trong đó tỉ lệ thể dị hợp FH là 1/200, tỉ lệ đồng hợp FH xấp xỉ 1/160.000-1/300.000 [10] Bệnh FH thể dị hợp làm tăng nguy cơ mắc bệnh tim mạch trước 50 tuổi ở nam và 60 tuổi ở nữ Bệnh FH đồng hợp thường gây tử vong ở độ tuổi 30 [4] Công bố khoa học của Jensen và cộng sự (1967) ghi nhận tỉ lệ mắc bệnh tim mạch vành là 45,1% trong nhóm bệnh nhân nam giới mắc FH ở Đan Mạch

Bên cạnh một số yếu tố dinh dưỡng, sự hạn chế vận động/ít tập thể dục và điều kiện môi trường sống, nguyên nhân chính của bệnh lý rối loạn chuyển hoá cholesterol trong máu theo hướng tăng cao bất thường là do sự xuất hiện tính chất đột biến ở các gen có vai trò

trong cơ chế chuyển hoá cholesterol, điển hình là gen ApoB (Apolipoprotein B) Gen ApoB (Apolipoprotein B) định vị ở nhiễm sắc thể số 2, có kích thước khoảng 43kb, gồm 29 exon Gen ApoB mã hoá protein ApoB–100 và ApoB–48, có chức năng là phối tử

hình thành phức hợp giữa Low Density Lipoprotein (LDL) và Low Density Lipoprotein Receptoer (LDLR) Công bố của Knott và cộng sự (1985), Brown và cộng sự (1986), Innerarity và cộng sự (1990), Whitfield và cộng sự (2004) xác định một số dạng đột biến

trên gen ApoB làm cho protein ApoB sai hỏng cấu trúc và chức năng – gây nên bệnh FH,

ở thể bệnh khiếm khuyết Apolipoprotein (Familial defective Apolipoprotein-100 – FDB)

Hòa cùng với xu hướng phát triển công cụ sinh học phân tử hỗ trợ dự đoán, tiên lượng, chẩn đoán sớm các bệnh lý di truyền và kế thừa, kết hợp với các dữ liệu nghiên cứu cùng

nhóm nghiên cứu, chuyên đề khóa luận tốt nghiệp được thực hiện: “Khảo sát đặc điểm

phân tử thuộc exon 26 gen ApoB liên quan đến bệnh cao cholesterol trong máu”

Công trình nghiên cứu giúp cập nhật, hoàn thiện cơ sở khoa học tiền đề có ý nghĩa khoa học thực tiễn đối với ứng dụng trong hướng phát triển công cụ sinh học phân tử phù hợp để hỗ trợ trong dự đoán, tiên lượng và chẩn đoán sớm bệnh FH (bệnh cao cholesterol

trong máu có tính gia đình) ở Việt Nam

Mục tiêu nghiên cứu:

Khảo sát đặc điểm phân tử (có hoặc không có sự xuất hiện các đột biến điểm: thay thế nucleotide, mất nucleotide hoặc gắn chèn nucleotide) trên trình tự gen mục tiêu, đó là

exon 26 gen ApoB liên quan đến bệnh cao cholesterol trong máu – tiêu điểm cụ thể là

bệnh FH một cách tổng thể dựa vào dữ liệu khoa học trên thế giới và trên một số mẫu

bệnh phẩm ở Việt Nam

Nội dung nghiên cứu:

- Khai thác dữ liệu và phân tích tổng hợp xác định chỉ số Proportion phản ánh mức

độ xuất hiện đột biến điểm trên gen ApoB trên người bệnh cao cholesterol trong

máu (tập trung vào bệnh lý cao cholesterol trong máu có tính gia đình), dựa trên dữ liệu khoa học trên thế giới có tính cập nhật đến thời điểm thực hiện khóa luận tốt nghiệp

- Khảo sát in silico bộ mồi phù hợp với quy trình PCR khuếch đại vùng trình tự gen mục tiêu: exon 26 gen ApoB

- Khảo sát thực nghiệm bằng quy trình PCR kết hợp giải trình tự nhằm xác định đặc

điểm phân tử trên vùng trình tự exon 26 gen ApoB của một số mẫu máu của bệnh

nhân Việt Nam, có hoặc không có chỉ số sinh hóa máu bất thường về lượng cholesterol trong máu

- Bước đầu thiết lập cấu trúc mô hình (3D) của chuỗi polypeptide được mã hóa bởi

exon 26 gen ApoB thuộc trình tự tham chiếu và thuộc một số mẫu bệnh phẩm máu

của bệnh nhân Việt Nam

1 TỔNG QUAN

1.1 Cao Cholesterol

Cao cholesterol là tình trạng nồng độ cholesterol lưu thông trong máu cao hơn mức bình thường (nồng độ cholesterol≥190 mg/dL) [5] Cholesterol đóng một vai trò quan trọng trong việc cấu tạo nên các tế bào khoẻ mạnh nhưng cholesterol cao có thể làm tăng nguy cơ mắc bệnh tim, xơ vữa động mạch vành sớm

Các dạng lipoprotein gồm có: HDL (High Density Lipoprotein) là những hạt lipoprotein có tỉ trọng cao; LDL (Low Density Lipoprotein) là những hạt lipoprotein có tỉ trọng thấp; VLDL (Very Low Density Lipoprotein) là những hạt lipoprotein có tỉ trọng rất thấp [2] HDL được tổng hợp tại gan, có thể gắn kết với cholesterol, tạo thành HDL–Cholesterol (HDL–C) để vận chuyển cholesterol dư thừa từ các mô, cơ quan, mạch máu về gan để chuyển hoá Nhờ đó, lượng cholesterol trong máu và các mô được cân bằng Trong những trường hợp HDL–C giảm, dẫn đến làm sự tích tụ cholesterol trong máu và trong các mô tăng cao, đây là nguyên nhân dẫn đến bệnh xơ vữa động mạch [6]

LDL được tổng hợp tại gan, có thể gắn kết với cholesterol, tạo thành LDL–C để vận chuyển cholesterol từ gan đến cung cấp cho các cơ quan khác và từ các cơ quan này quay về gan để bài tiết và tổng hợp acid mật, chủ yếu là tuyến thượng thận và các mô mỡ Nồng độ LDL–cholesterol trong máu cao có thể dẫn đến sự tích tụ trong động mạch của người bệnh làm tăng việc đau tim hoặc đột quỵ do LDL không được chuyển hoá hoặc chỉ chuyển hoá một phần ở gan VLDL có thể gắn kết với cholesterol, tạo thành VLDL–cholesterol, quá trình sản sinh được kiểm soát chủ yếu bởi các thụ thể LDL điều chỉnh sản xuất các hạt VLDL thông qua các tương tác của nó với VLDL trong con đường bài tiết [6]

Theo Tổ Chức Y Tế Thế Giới (World Health Organization – WHO), bệnh cao cholesterol trong máu là yếu tố nguy cơ dẫn đến các bệnh lý về tim mạch, thiếu máu cục bộ và đột quỵ Trên thế giới, tổng số ca bệnh thiếu máu cục bộ và đột quỵ do bị cao cholesterol trong máu là 2,6 triệu ca, các ca bệnh này bị tử vong Theo WHO, nếu giảm lượng

cholesterol trong máu ở nam giới trong độ tuổi 40 thì sẽ giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch trong vòng 5 năm

1.1.1 Nguyên nhân mắc bệnh cao cholesterol

Cơ thể sẽ tự sản sinh ra tất cả các LDL-C cần thiết cho con người Đối với một lối sống không lành mạnh chúng sẽ sản sinh ra nhiều LDL-C hơn lượng cơ thể chúng ta cần, đó là một trong những yếu tố gây nên bệnh cao cholesterol

Có 2 yếu tố chính dẫn đến sự tăng cao cholesterol trong máu là yếu tố ngoại cảnh và yếu tố di truyền:

- Yếu tố ngoại cảnh: là những yếu tố môi trường sống tác động lên người bệnh như chế độ ăn uống không lành mạnh, thiếu vận động, hút thuốc, thừa cân

- Yếu tố di truyền: là khi người bệnh được thừa hưởng gen từ những người thân trong gia đình như cha, mẹ, ông bà; đây được xem là bệnh FH (familial hypercholesterol)

1.2 Một số bệnh lý liên quan đến việc chuyển hoá Cholesterol 1.2.1 Bệnh tim mạch (Cardiovascular Disease – CVD)

Bệnh tim mạch (CVD) là nguyên nhân gây tử vong số một trên thế giới Theo WHO, Trong số 17 triệu ca tử vong sớm (dưới 70 tuổi) được báo cáo do các bệnh không truyền nhiễm vào 2015, 37% là do bệnh tim mạch gây nên Đây còn được xem là một nhóm các bệnh lý của tim và mạch máu Bệnh tim mạch là tình trạng thu hẹp của các mạch máu nhỏ cung cấp máu và oxy cho tim là nguyên nhân dẫn đến bệnh động mạch vành sớm [7] Các cơn đau tim và đột quỵ thường là những yếu tố cấp tính và được gây ra bởi sự tắc nghẽn, ngăn máu chảy vào tim hoặc não

Một số nước cho thấy rằng, nồng độ LDL–C trong động mạch tăng cao là yếu tố nguy cớ đẫn đến bệnh tim mạch Các ca bệnh này đều được ghi nhận là mắc bệnh HeFH (nam giới ở độ tuổi 50 và nữ giới ở độ tuổi 40) Mặt khác, các bệnh nhân mắc bệnh tim mạch đồng thời mắc bệnh HoFH ở độ tuổi nhỏ và ở độ tuổi 20 [8]

Theo WHO, bệnh lý thiếu máu cục bộ tim (Coronary Artery Disease – CAD), bệnh tim mạch vành (Coronary Heart Disease – CHD) thuộc nhóm bệnh lý gây tử vong cao trên thế giới Sự rối loạn chuyển hoá lipid máu (>50 mmol/L) là nguy cơ dẫn đến bệnh lý CAD/CHD và sự hình thành mảng xơ vữa tích tụ trong thành mạch, dẫn đến tắc nghẽn các động mạch và động mạch chủ [1,2,3]

1.2.2 Bệnh Familial Hypercholesterolemia (FH)

Bệnh Familial hypercholesterolemia (FH) là bệnh cao cholesterol máu có tính gia đình, là một dạng bệnh di truyền trội, dẫn đến tăng nồng độ cholesterol trong máu một cách bất thường Bệnh FH là yếu tố nguy cơ cao gây ra bệnh lý tim mạch (Cardiovascular Diseases, CVD), bệnh động mạch vành sớm (Coronary Artery Disease – CAD) [7] Bên cạnh đó, các dấu hiệu tiên lượng của bệnh là nồng độ lipoprotein mật độ thấp (LDL–C) tăng cao dẫn đến bệnh tim mạch nói chung và bệnh động mạch vành nói riêng Người nam mắc bệnh FH dẫn đến bệnh động mạch vành sớm hơn 20 năm so với người nam bình thường Nhưng ở phụ nữ, bệnh động mạch vành sẽ xuất hiện sớm hơn 30 năm so với dự kiến, bên cạnh đó, 30% những người phụ nữ không được điều trị kịp thời sẽ mắc bệnh tim mạch trước khi 60 tuổi Theo Tổ Chức Tim Mạch ở Anh (Heart Organization England) cho biết, so sánh với những bệnh nhân có lượng LDL–C trung bình (<130 mg/dL), những bệnh nhân FH này có nguy cơ mắc bệnh động mạch vành cao gấp 5 lần ở ngoài 30 tuổi Đối với các trường hợp mắc bệnh FH, chỉ số nguy cơ mắc bệnh động mạch vành vào khoảng 16,7:1000 ở bệnh nhân dưới độ tuổi 35 [9]

Bệnh FH ở thể dị hợp tử (Heterozygous Familial Hypercholesterolemia – HeFH) và thể đồng hợp tử (Homozygous Familial Hypercholesterolemia – HoFH) [10] Bệnh nhân mắc bệnh HoFH với nồng độ cholesterol tổng trong máu cao, trong khoảng 650-1.000 mg/dL (tương ứng khoảng 17–26 mmol/L) Tần suất mắc bệnh HoFH xấp xỉ 1:100.000 trường hợp đã được khảo sát, các ca bệnh HoFH này thường có chỉ số cholesterol tổng trong khoảng >500 mg/dL (>13 mmol/L) [12] Tần suất mắc bệnh HeFH xấp xỉ 1:500 truờng hợp đã được khảo sát, các ca bệnh HeFH này thường có chỉ số cholesterol tổng

trong khoảng 350–550 mg/dL (tương ứng khoảng 9–14 mmol/L) và chỉ số cholesterol LDL trong máu cao hơn 600 mg/dL (>15,5 mmol/L) [11]

1.3 Nguyên nhân dẫn đến bệnh FH

Nguyên nhân chính dẫn đến bệnh FH là do tính chất đột biến xảy ra trên trình tự của một

trong các gen có vai trò trong con đường chuyển hoá cholesterol: LDLR (Low Density Cholesterol Receptor), ApoB (Apolipoprotein B), PCSK9 (Poliprotein convertase subtilsin/ kexin loại 9), Các dạng đột biến trong các gen này dẫn đến các protein LDLR

bị sai hỏng hoặc khiếm khuyết [12] gây nên rối loạn sự chuyển hoá cholesterol trong máu, làm cho lượng lipoprotein mật độ thấp (LDL) hoặc LDL-C tăng cao bất thường, có

thể tích tụ trong các thành của động mạch, đặc thù là gen ApoB Đây là yếu tố nguy cơ

dẫn đến các vấn đề về tim mạch và thậm chí đột quỵ ở người trẻ tuổi, đôi khi là trẻ em [9]

1.4 Các gen có vai trò trong chuyển hoá cholesterol

1.4.1 Gen LDLR

Gen LDLR (Low Density Cholesterol Receptor) nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể

số 19 (19p13,1-13.3), bao gồm 18 exon và 17 intron có kích thước 45kb Nồng độ LDL trong huyết tương có vai trò điều hoà hoạt động của thụ thể LDL (LDLR) [9] Chúng có thể ảnh hưởng đến bất kì vùng domain nào của protein LDLR do đó dẫn đến suy giảm khả năng liên kết với hạt LDL, không thể xâm nhập vào tế bào sau khi liên kết, hoặc

thiếu hoàn toàn gen LDLR Khiếm khuyết do đột biến gen LDLR dẫn đến sự dị hoá

LDL-C giảm dần, dẫn đến nồng độ trong huyết tương tăng cùng với mức độ bình thường khác của các lipoprotein khác [8] Có 5 loại bệnh FH chính do đột biến LDLR [13]

Loại 1: LDLR hoàn toàn không được tổng hợp

Loại 2: LDLR không được vận chuyển đúng cách từ mạng lưới nội chất đến bộ máy Golgi để biểu hiện trên mặt tế bào

Loại 3: LDLR không liên kết đúng với LDL trên bề mặt tế bào do khiếm khuyết về Apolipoprotein B100 (R3500Q) hoặc trong LDL-R

Loại 4: LDLR liên kết với LDL không được tập hợp đúng cách trong các hố được phủ clathrin để điều trị nội tiết qua trung gian thụ thể

Loại 5: LDLR không thể quay lại bề mặt tế bào

Một số công trình nghiên cứu trên thế giới đã xác định khoảng 1.200-1.700 dạng đột

biến trên gen LDLR liên quan đến bệnh FH [15] Bên cạnh đó cũng có nhiều nghiên cứu nhằm xác định tính chất đột biến điểm trên gen LDLR Tiếp theo, công trình nghiên cứu

của nhóm tác giả Humphries và cộng sự vào năm 2014, phân tích các dạng đột biến điểm

trên gen LDLR bằng phương pháp PCR kết hợp với giải trình tự

năng PCSK9 sẽ dẫn đến mức LDL-C thấp hơn Ngược lại, bệnh nhân có đột biến PCSK9

tăng chức năng sẽ bị cao cholesterol trong máu có tính chất gia đình (ADH), một bệnh đặc trưng bởi nồng độ LDL-C trong huyết tương tăng [12]

1.4.3 Gen Apolipoprotein (Apo) B

Gen ApoB (Apolipoprotein B) định vị ở nhiễm sắc thể số 2, có kích thước khoảng 43kb, gồm 29 exon và 28 intron Gen ApoB mã hoá protein ApoB–100 và ApoB–48, có chức

năng là phối tử hình thành phức hợp giữa Low Density Lipoprotein (LDL) và Low

Density Lipoprotein Recepter (LDLR) [16, 17, 18] Gen ApoB được phiên mã và dịch

mã thành một protein gồm 4563 axit amin Có 2 dạng đột biến do sự thay đổi của gen ApoB gây ra là đột biến gây chứng giảm protein máu (hypobetlipoproteinemia) do sự đột biến cắt đoạn xảy ra và đột biến cao cholesterol trong máu (hypercholesterolemia) do đột biến sai lệch dẫn đến protein ApoB phối tử bị khiếm khuyết làm sai hỏng chức năng [19]

Gen ApoB mã hóa protein ApoB có chức năng cơ bản là vận chuyển lipid, cụ thể là các

chức năng như sau:

- Thành phần cấu tạo phức hợp với lipoprotein để chuyển hóa lipoprotein giàu triglycerid ở gan [20]

- Thành phần cấu tạo phức hợp giữa cholesterol và lipoprotein mật độ rất thấp (VLDL) và lipoprotein mật độ thấp (LDL) [20]

- Thành phần tương tác với heparin và các proteoglycan khác nhau trong thành động mạch [20]

- Thành phần tương tác với thụ thể LDL, giữ vai trò trong cơ chế đào thải LDL ra khỏi huyết tương [20]

Protein ApoB-100 có chức năng cơ bản giống với các Apolipoprotein khác, nhưng ApoB-100 có sự khác biệt với các apolipoprotein khác ở đặc điểm tương tác với lipid Hầu hết các loại apolipoprotein liên kết với lipid tại các cấu trúc domain xoắn α lưỡng cực Tuy nhiên, ApoB-100 có thể tương tác với lipid thông qua cấu trúc domain xoắn β kị nước và tiểu phần amino acid kỵ nước và vùng thụ thể xuyên màng [21]

Gen ApoB-100 được biểu hiện chủ yếu ở gan và ruột non [19] Đột biến trên gen ApoB

dẫn đến protein ApoB bị khiếm khuyết, làm giảm liên kết các hạt LDL với LDLR (thụ

thể), khiến cho mức cholesterol lưu thông trong máu tăng cao [22]

Một số công bố của Knott và cộng sự (1985), Brown và cộng sự (1986), Innerarity và cộng sự (1990), Whitfield và cộng sự (2004) xác định các dạng đột biến nổi trội là nguyên

nhân chính dẫn đến protein ApoB khiếm khuyết (sai hỏng chức năng) - gây nên bệnh FH

ở thể FDB (Familial defective Apolipoprotein B–100), gồm có dạng đột biến điểm xảy ra tại vị trí codon 3500 (vị trí cập nhật: 3527) hoặc trải dài về phía 5’ và 3’ (bao quanh)

codon 3500 thuộc exon 26 gen ApoB Các dạng đột biến sai nghĩa, mất nucleotide hoặc gắn chèn thêm nucleotide trên trình tự mã hóa của gen ApoB làm cho protein ApoB bị

sai hỏng, không thể tương tác với các lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL) ảnh hưởng đến sự chuyển hoá lipoprotein trong huyết tương, giảm sự loại thải LDL trong máu, gây tăng cao bất thường lượng cholesterol trong máu

1.5 Hướng nghiên cứu về đặc điểm phân tử gen ApoB và bệnh FH trên thế

giới và ở Việt Nam

Cho đến nay, có nhiều công bố khoa học trên thế giới xác định được đặc điểm phân tử

(tính chất đột biến điểm) xuất hiện trên gen ApoB Đồng thời, các nhà khoa học đã ghi

nhận ý nghĩa khoa học thực tiễn của hướng nghiên cứu xác định các yếu tố nguy cơ liên

quan đến bệnh FH, cụ thể là tính chất đột biến điểm trên gen ApoB đối với việc hỗ trợ

chẩn đoán, điều trị bệnh FH, cụ thể là thể bệnh FDB

Công bố khoa học của Soufi và cộng sự (2004) sử dụng phương pháp PCR kết hợp giải

trình tự và DGGE nhằm xác định các dạng đột biến điểm xuất hiện trên gen ApoB đối

với 835 bệnh nhân người Đức mắc bệnh FH Kết quả nghiên cứu cho thấy tỉ lệ đột biến

xuất hiện trên gen ApoB là 98,46%

Một nghiên cứu của Liyanage và cộng sự (2008) sử dụng phương pháp PCR kết hợp giải

trình tự phân tích các dạng đột biến điểm xuất hiện trên gen ApoB trên quần thể người bệnh FH ở Úc Kết quả nghiên cứu ghi nhận tỉ lệ đột biến trên gen ApoB là 22,86% trên

Một nghiên cứu của Chatziste và cộng sự (2013) sử dụng phương pháp Allele specific -

PCR (AS-PCR) xác định tỉ lệ đột biến trên gen ApoB là 100%, trên tổng số 6 bệnh nhân

mắc FH ở Đức

Tiếp theo, công bố khoa học của Benn và cộng sự (2016) sử dụng phương pháp Realtime

- PCR ghi nhận tỉ lệ đột biến trên gen ApoB là 64,74% đối với 76 bệnh nhân mắc FH, ở

người Đan Mạch

Công bố khoa học của Gabcova và cộng sự (2017) sử dụng phương pháp Realtime - PCR

phân tích tính chất đột biến trên gen ApoB đối với các bệnh nhân mắc FH ở Slovakia

Kết quả nghiên cứu ghi nhận tỉ lệ đột biến được ghi nhận là 5,96% trên 235 bệnh nhân FH

Cho đến nay, ở Việt Nam có một vài nghiên cứu khoa học về đặc điểm phân tử - khảo sát các dạng đột biến trên các gen có chức năng chuyển hóa cholesterol trong máu, cụ thể là đề tài nghiên cứu của Trương Kim Phượng và cộng sự (2016) sử dụng phương

pháp PCR giải trình tự xác định tỉ lệ đột biến R3500Q trên gen ApoB là 84,37%, trên

tổng số 32 bệnh nhân mắc bệnh FH ở Việt Nam Đề tài nghiên cứu của Nguyễn Trà My

và cộng sự năm (2009) khảo sát và thiết kế mồi để dò đột biến trên gen LDLR và ApoB

bằng phương pháp PCR ở người Việt Nam Đề tài của Trương Kim Phượng và cộng sự (2017) sử dụng phương pháp PCR kết hợp giải trình tự xác định tỉ lệ đột biến R3500Q

trên gen ApoB là 68%, trên tổng số 40 bệnh nhân mắc bệnh FH

1.6 Phương pháp PCR kết hợp với giải trình tự xác định tính chất đột biến điểm liên quan đến bệnh FH

Bên cạnh một số phương pháp mới: Amplification Refractory Mutation System (ARMS), Giải trình tự thế hệ mới (Next Gene Sequencing - NGS), phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) và phương pháp giải trình tự được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu về đặc điểm phân tử gen của sinh vật [23]

Phương pháp PCR

Phương pháp PCR được phát triển bởi Kary Mullis vào năm 1984 Nguyên tắc của phương pháp PCR là dùng để khuếch đại lượng lớn bản sao từ các chuỗi DNA khuôn dựa trên sự hoạt động của DNA polymerase để tổng hợp các chuỗi DNA bản sao theo nguyên tắc bắt cặp bổ sung và bán bảo tồn [24] PCR bao gồm 25–40 chu kỳ lặp lại, thường bắt đầu bằng giai đoạn nhiệt độ cao (> 90OC), dừng lại sau khi phản ứng cuối cùng được tổng hợp và được bảo quản lạnh ở 4OC trong thời gian ngắn Có ba bước thay đổi nhiệt độ riêng biệt:

- Bước 1 (Giai đoạn biến tính): giai đoạn này DNA sẽ được biến tính ở nhiệt độ khoảng 90-95OC, mạch đôi DNA được biến tính sẽ trở thành phân tử DNA sợi đơn Lúc này phản ứng enzyme sẽ được dừng lại

- Bước 2 (Giai đoạn ủ – gắn mồi): Các sợi DNA sẽ được bắt cặp với mồi Thông thường nhiệt độ khi gắn mồi sẽ thấp hơn 3–5OC so với nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi

- Bước 3 (Giai đoạn kéo dài): Nhiệt độ 72OC là nhiệt độ tối ưu của Taq DNA

polymerase Sau đó, các mạch DNA mới sẽ được tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung

Phương pháp giải trình tự DNA (Sequencing)

Phương pháp giải trình tự DNA xác định đặc điểm các chuỗi nucleotide (DNA), từ đó cho phép phân tích những dạng biến thể xuất hiện trên từng trình tự DNA cũng như các dạng đột biến (đột biến điểm, đột biến mất đoạn, đột biến lặp đoạn, ) xuất hiện trên các chuỗi DNA

Cho đến nay, phương pháp giải trình tự Sanger được sử dụng rộng rãi để xác định các chuỗi trình tự nucleotide có kích thước khoảng 1 kilobase [25] Phương pháp giải trình tự Sanger sử dụng các dideoxyribonucleotide triphosphate (ddNTP) để dừng phản ứng kéo dài mạch của DNA polymerase vì ddNTP không chứa nhóm 3’-OH dùng để tạo liên kết với nucleotide kế tiếp [22] Trong quy trình giải trình tự Sanger, các thành phần thiết yếu của phản ứng khuếch đại DNA gồm có DNA bản mẫu, cặp mồi (một cặp oligonucleotide tổng hợp bổ sung cho hai chuỗi DNA đích), enzyme DNA polymerase

ổn định nhiệt (ví dụ Taq DNA polymerase), cation hoá trị hai (Mg2+) và hỗn hợp của một ddNTP cụ thể với các dNTP bình thường (ví dụ: ddATP với dATP, dCTP, dGTP và dTTP) Các dideoxynucleotide (ddNTP) được đánh dấu bằng chất nhuộm huỳnh quang, cho phép xác định nucleotide ddNTP tại vị trí dừng kéo dài chuỗi DNA ở đầu 3’ [26]

1.7 Phương pháp phân tích tổng hợp để xác định mối tương quan giữa tính chất đột biến trên một số gen liên quan đến bệnh FH

Phương pháp phân tích tổng hợp (meta - analysis) là phương pháp thu thập tài liệu khoa học một cách có hệ thống, dựa vào các kết quả nghiên cứu riêng biệt kết hợp phương pháp thống kê để xác định một xu hướng chung, đồng nhất cho một vấn đề nghiên cứu (khả năng mắc bệnh,…) Đối với hướng nghiên cứu y học thực chứng và các nghiên cứu

liên quan, cụ thể là trong nhiều nghiên cứu ca chứng hoặc nghiên cứu đoàn hệ, phản ánh cùng một chủ đề nghiên cứu nhưng các kết quả nghiên cứu có thể khác biệt Nguyên nhân là do sự khác biệt trong một số yếu tố liên quan đến bộ mẫu nghiên cứu (loại mẫu, nguồn gốc/chủng tộc của người bệnh, người khỏe mạnh cho mẫu bệnh phẩm, ), phương pháp nghiên cứu, Do vậy, sự khác biệt về giá trị của các biến số/yếu tố khảo sát giữa các nghiên cứu là không tránh khỏi Phân tích tổng hợp cùng với hệ thống tổng quan các dữ liệu khoa học giúp phản ánh rõ nét về tính đặc trưng của một biến số khảo sát, dựa trên tập hợp dữ liệu thông tin khoa học được trích xuất từ các công bố khoa học phù hợp Phân tích tổng hợp được tiến hành dựa trên các thuật toán tính toán của thống kê liên quan đến việc xác định giá trị P-value, khoảng tin cậy (95% Confidence intervals), trọng số, cùng với mô hình phân tích hiệu ứng tác động/ảnh hưởng của giá trị biến số trong từng mẫu (công bố khoa học) đối với một chỉ số phân tích (chỉ số tỷ lệ - Proportion; chỉ số tỷ suất chênh – Odds ratio; chỉ số nguy cơ – Relative risk/Hazard ratio; )

Đối với nghiên cứu công nghệ sinh học ứng dụng trong y dược cũng như hướng nghiên cứu y học thực chứng, quy trình phân tích tổng hợp thường trải qua các bước như sau [27]:

- Bước 1: sử dụng các hệ thống tra cứu dữ liệu khoa học (NCBI, Pubmed,…) và từ khóa thích hợp để tìm kiếm và thu thập các bài báo khoa học phù hợp với chủ đề nghiên cứu

- Bước 2 và bước 3: Khai thác dữ liệu, trích xuất dữ liệu thích hợp để tạo nên bộ dữ liệu phù hợp trong phân tích tổng hợp Các công bố khoa học được chọn lọc phải đảm bảo tiêu chí trích xuất, cụ thể là có đầy đủ và rõ ràng các thông tin: loại mẫu nghiên cứu, nguồn gốc/chủng tộc người cho mẫu, số lượng mẫu cho kết quả dương tính/âm tính,

- Bước 4: Xác định ước tính mức độ ảnh hưởng của từng công bố khoa học đối với xu hướng chung của “biến số được khảo sát”

- Bước 5: Xác định tính bất đồng nhất của bộ dữ liệu để từ đó lựa chọn mô hình phân tích đối với từng chỉ số: chỉ số tỷ lệ - Proportion; chỉ số tỷ suất chênh –

Odds ratio; chỉ số nguy cơ – Relative risk/Hazard ratio; Đối với mỗi bộ dữ liệu, chỉ số đồng nhất (homogeneity) và bất đồng nhất (heterogeneity) được xác định thông qua xác định giá trị I2, để từ đó lựa chọn mô hình ảnh hưởng bất biến (Fixed effects meta analysis – F hoặc mô hình ảnh hưởng biến thiên (Random effects meta analysis – R) Trong quá trình tiến hành phân tích tổng hợp, luôn kiểm tra độ chính xác của bộ dữ liệu để khẳng định các kết quả phân tích tổng hợp

2 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu

Mẫu bệnh phẩm:

Bộ mẫu bệnh phẩm gồm 20 mẫu máu được thu thập từ các bệnh viện ở Thành phố Hồ Chí Minh Bộ mẫu máu này là sản phẩm của đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh (Mã số: T2015.2.181), việc thu thập mẫu máu quy định về việc thu thập mẫu nghiên cứu y sinh phù hợp với thời điểm lấy mẫu và thực hiện đề tài.

2.2 Công cụ tin sinh học

- Phần mềm MedCalc phiên bản 19.4.1 - NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)

- Google Scholar (https://www.google.com.vn/scholar) - GeneCards (https://www.genecards.org)

- CodonCode Aligner - Annhyb phiên bản 4.946 - Bioedit phiên bản 7.2 - Chromas phiên bản 2.1

- Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) - Swiss Model (https://swissmodel.expasy.org) - PDB (https://www.rcsb.org)

- IDT (https://www.idtdna.com/pages)

2.3 Thiết bị

- Tủ thao tác - Máy ly tâm lạnh - Máy vortex

- Máy đo quang phổ - Máy PCR

- Bể điện di - Lò vi sóng - Cân kỹ thuật - Máy luân nhiệt

2.4 Hoá chất

- Bộ mồi (Hãng Genewiz)

- Agarose (Ca# BO-41025, Bioline)

- Master mix 2X (Ca# BIO-25041, Bioline) - Ethanol tuyệt đối

- Gelred (6X) GelRedTM Loading Buffer with Tricolor (Ca# DD-012, Công ty cổ phần công nghệ TBR)

- Loading dye 5x Loading Buffer Tri-Color (Cat# BIO-37070, Công ty cổ phần công nghệ TBR)

- Bộ Toppure Blood DNA extraction KIT (HI-312, công ty ABT) - Thang chuẩn 50bp (Ca# BIO-33054, Bioline)

- Dung dịch TAE 25X (Công ty cổ phần công nghệ TBR)

gen mục tiêu ApoB, liên quan đến bệnh cao cholesterol trong máu có tính gia đình

- Phân tích tổng hợp xác định chỉ số Proportion nhằm khảo sát mức độ xuất hiện

đột biến điểm trên gen ApoB trên người bệnh cao cholesterol trong máu (tập trung

vào bệnh lý cao cholesterol trong máu có tính gia đình)

- Khảo sát in silico bộ mồi phù hợp với quy trình PCR khuếch đại vùng trình tự gen mục tiêu: exon 26 gen ApoB

- Khảo sát thực nghiệm bằng quy trình PCR kết hợp giải trình tự nhằm xác định

đặc điểm phân tử trên vùng trình tự exon 26 gen ApoB của một số mẫu máu của

bệnh nhân Việt Nam, có hoặc không có chỉ số sinh hóa máu bất thường về lượng cholesterol trong máu

- Bước đầu thiết lập cấu trúc mô hình (3D) của chuỗi polypeptide (tương ứng exon

26 gen ApoB), đây là cơ sở khoa học mô tả rõ hơn về đặc điểm biến thể xuất hiện

trên gen mục tiêu ở một số mẫu máu ở Việt Nam

2.5.1 Khai thác dữ liệu

Khai thác dữ liệu được tiến hành để thu thập các báo cáo khoa học thực hiện về đặc điểm phân tử (tính chất đột biến điểm nổi trội) trên một số gen liên quan đến sự chuyển hoá

lipid, cholesterol trong máu, tập trung trên gen mục tiêu ApoB, liên quan đến bệnh cao

cholesterol trong máu có tính gia đình Trong quá trình tìm kiếm bài báo khoa học, các từ khóa tiếng Anh được sử dụng: Familial hypercholesterolemia, Apolipoprotein B,

Coronary Artery Disease, Cardiovascular Diseases, HeFH, HoFH, ApoB, Nguồn bài

báo khoa học (tiếng Anh, tiếng Việt) được tìm kiếm trên các cơ sở dữ liệu trực tuyến: NCBI, Google Scholar, Pubmed,…

2.5.2 Phân tích tổng hợp (Meta – analysis)

Phân tích tổng hợp là một phương pháp thống kê phổ biến và được sử dụng rộng rãi, tập hợp dữ liệu từ các nghiên cứu và quan sát lại và cho ra thống kê hiệu quả của các nghiên cứu Phân tích tổng hợp còn cho phép kết hợp các dữ liệu và tóm tắt những phát hiện đã công bố của các nghiên cứu lâm sàng, chẩn đoán Từ đó có thể đánh giá hiệu quả các thông số được nêu trong nghiên cứu trên cùng một nhóm bệnh nhân Các nghiên cứu dựa trên các thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên, có đối chứng Kết quả từ phân tích tổng hợp có thể bao gồm ước tính chính xác hơn về hiệu quả của việc điều trị hoặc yếu tố nguy cơ gây bệnh, hoặc các kết quả khác Dựa trên các yếu tố chi tiết sau để chọn lọc các công bố khoa học:

- Nghiên cứu đoàn hệ (Cohort study)

- Các công bố khoa học được viết bằng tiếng Anh/ Việt

- Gen mục tiêu: ApoB

- Số lượng mẫu bệnh phẩm

- Tỉ lệ xuất hiện đột biến trên gen ApoB đối với người bệnh cao cholesterol trong

máu liên quan đến bệnh FH

- Phương pháp nghiên cứu: PCR- giải trình tự,PCR- realtime, NGS,… - Thông tin về mẫu bệnh phẩm: mẫu máu

- Thông tin về bệnh nhân: quốc tịch, chủng tộc, hàm lượng cholesterol,…

Phân tích tổng hợp bắt đầu được thực hiện với việc trích xuất dữ liệu theo sơ đồ Prisma (hình 3.1) và sau đó tiến hành xác định chỉ số Proportion, nhằm khảo sát mức độ xuất

hiện đột biến điểm trên gen ApoB trên người bệnh cao cholesterol trong máu (tập trung

vào bệnh lý cao cholesterol trong máu có tính gia đình) Phân tích tổng hợp được áp dụng trên công cụ MedCalc (Phiên bản 19.4.1), thuật toán thống kê theo kiểm định Chi bình phương và mô hình ảnh hưởng cố định (F: Fixed) hoặc mô hình ảnh hưởng biến thiên (R: Random) Sự lựa chọn mô hình phân tích để xác định giá trị Proportion với khoảng tin cậy 95% CI phù hợp và dựa vào tính bất đồng nhất của tham số (tỉ lệ đột biến trên gen mục tiêu) Sự bất đồng nhất của về tỉ lệ đột biến trên gen mục tiêu thuộc từng nghiên cứu thuộc bộ dữ liệu, được biểu thị qua giá trị chỉ số I2 (Inconsistency, Index of heterogeneity):

𝐈𝟐 =𝐐 − (𝐤 − 𝟏)

𝐐 × 𝟏𝟎𝟎% = (

𝐐 − 𝐝𝐟

𝐐 ) × 𝟏𝟎𝟎% Trong đó: Q = ∑ki=1Wi × (di − d)2; df: độ phân tán

df = tổng số công bố khoa học –1

Q lớn thì sự khác biệt có ý nghĩa dẫn đến sự không đồng nhất của các nghiên cứu Biểu đồ rừng (forest plot) cung cấp một bản tóm tắt trực quan về phân tích và phát hiện Đồ thị này được biểu thị bằng đồ hoạ các ước tính về kích thước và khoảng tin cậy tương ứng cho mỗi nghiên cứu so với tổng thể tất cả các nghiên cứu được tập hợp

Tính không đồng nhất (Heterogeneity) là một thuật ngữ được sử dụng để mô tả sự thay đổi giữa các nghiên cứu và sự không đồng nhất về thống kê mà cần được xem xét Các

nghiên cứu với sai sót về phương pháp và các nghiên cứu nhỏ có thể đánh giá quá cao hiệu quả của bài nghiên cứu và có thể đóng góp vào sự không đồng nhất và mặt thống kê Sự không đồng nhất có thể được kiểm tra và định lượng bằng phương pháp thống kê Sự không đồng nhất trên lâm sàng đề cập đến sự khác biệt trong các phương pháp nghiên cứu, ảnh hưởng đến khả năng so sánh và/ hoặc kết hợp dữ liệu từ các nghiên cứu khác nhau

2.5.3 Khảo sát in silico

Dựa vào dữ liệu trên ngân hàng Genbank (NCBI), các trình tự gen ApoB được thu thập

Sau đó, dựa vào công cụ Blast (NCBI) và Annhyb phiên bản 4.946, Bioedit phiên bản

7.2 để tìm hiểu mức độ tương đồng của các trình tự gen ApoB thu thập được, đồng thời xác định trình tự ApoB phù hợp làm trình tự tham chiếu cho các nội dung phân tích khác

(khảo sát bộ mồi khuếch đại vùng trình tự gen đích, khảo sát đặc điểm trình tự gen đích thuộc các mẫu bệnh phẩm)

2.5.4 Khảo sát thực nghiệm 2.3.4.3 Tách chiết DNA bộ gen

Xác định sự tương quan giữa tính chất đột biến điểm nổi trội trên vùng exon 26 của gen

ApoB với khả năng mắc bệnh cao cholesterol có tính chất gia đình liên quan đến bệnh

FH trong các nội dung được thực nghiệm sau đây

Quy trình tách chiết DNA bộ gen được thực hiện bằng bộ Kit Toppure Blood DNA extraction với các bước tiến hành sau đây:

- Hút 200 μL máu toàn phần/ huyết thanh cho vào tube 1,6ml Nếu lượng thể tích nhỏ hơn 200 μL, bổ sung dung dịch PBS đến đủ 200 μL Thêm 20 μL dung dịch proteinase K và trộn đều bằng cách vortex

- Thêm 200 μL BL buffer, vortex đều và ủ khoảng 10 phút ở 72OC

- Thêm 200 μL Ethanol (96-100%), trộn đều và chuyển hỗn hợp sang cột silica đặt sẵn trong tube 2mL Ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng trong 1 phút Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới

- Đặt lại cột vào tube 2mL cũ Thêm 500 μL WB1 buffer và ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng trong 1 phút Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới - Đặt lại cột vào tube 2mL cũ Thêm 500 μL WB2 buffer và ly tâm ở tốc độ

13.000 vòng trong 1 phút Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới - Đặt lại cột vào tube 2mL cũ Làm khô cột bằng cách ly tâm ở tốc độ 13.000

vòng trong 1 phút

- Chuyển cột sang tube 1.5mL mới Thêm 50 μL EB buffer và ủ một phút ở nhiệt độ phòng Ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng trong 1 phút, thu nhận phần dịch chứa DNA bên dưới

- DNA thu được sử dụng ngay hoặc bảo quản ở -20OC

Quy trình thực hiện: DNA sau khi tách chiết sẽ được đem pha loãng bằng nước cất hai lần đã hấp với tỉ lệ 5 μl DNA với 75 μl nước cất hai lần Tiếp theo, các DNA đã được pha loãng sẽ được lần lượt chuyển vào cuvette và đo nồng độ DNA ở các bước sóng 260nm và 280nm

2.3.4.5 Phản ứng PCR khuếch đại trình tự gen mục tiêu

Phản ứng PCR khuếch đại trình tự gen mục tiêu được tiến hành với tổng thể tích là 50 µl, thành phần phản ứng thể hiện ở bảng 2.1 và chu kỳ luân nhiệt

Bảng 2 2 Thành phần phản ứng PCR

Master mix 2X 25 Mồi xuôi (10 μM) 2 Mồi ngược (10 μM) 2 DNA (10-100 ng/μl) X Nước cất hai lần Y Tổng thể tích (50μl) 50

Chú thích: X: thể tích DNA phù hợp; Y= 50 – 925+0,5+0,5+X)

Chu kì luân nhiệt: 95oC trong 5 phút; sau đó là 35 chu kì, mỗi chu kì: 95oC trong 30 giây, 54oC trong 30 giây, 72oC trong 30 giây; và cuối cùng là 72oC trong 10 phút Sau khi để hạ nhiệt độ xuống còn 4oC

Các sản phẩm PCR sẽ được phân tích bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose và tiến hành gửi giải trình tự

2.5.5 Xác định các dạng biến thể xuất hiện trên vùng trình tự exon 26

gen ApoB thuộc một số mẫu bệnh phẩm

Công cụ Bioedit phiên bản 7.2 được sử dụng để so sánh sự tương đồng giữa trình tự NG_011793.1 và NM_000384.3 (bước này đã được thực hiện ở nội dung 2.3.3), khi đó

xác định được trình tự tham chiếu exon 26 gen ApoB Nghiên cứu này kiểm tra sản phẩm

giải trình tự bằng phần mềm Chromas phiên bản 2.1 và BLAST Sau đó, phần mềm CodonCode Aligner được sử dụng với trình tự tham chiếu NG_011793.1 để xác định các dạng biến thể (đột biến điểm) xuất hiện trên các sản phẩm giải trình tự của bệnh nhân ở Việt Nam Tổng hợp dữ liệu phân tích để xác định mức độ xuất hiện biến thể (đột biến

điểm) xuất hiện trên exon 26 gen ApoB đối với nhóm bệnh nhân có chỉ số cao cholesterol

trong máu hoặc có chỉ số cholesterol bình thường

2.5.6 Bước đầu thiết lập cấu trúc mô hình (3D) của chuỗi polypeptide

(tương ứng exon 26 gen ApoB)

Đồng thời, xác định trình tự khuôn mẫu polypeptide tương ứng bằng công cụ Swiss Model Tiếp theo, xây dựng và so sánh cấu trúc không gian 3D chuỗi polypeptide (exon 26) của chuỗi polypeptide khuôn mẫu và các chuỗi polypeptide của mẫu khảo sát Các

chuỗi polypeptide khảo sát là sản phẩm được mã hóa bởi trình tự exon 26 gen ApoB có

sự xuất hiện biến thể (đột biến điểm), thuộc một số mẫu bệnh phẩm máu ở người Việt Nam

3 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

3.1 Khai thác dữ liệu và phân tích tổng hợp

Cập nhật đến tháng 6/2020, bộ dữ liệu khoa học (nghiên cứu đoàn hệ - cohort study) thu thập được về đặc điểm phân tử (tính chất đột biến điểm nổi trội) trên một số gen liên

quan đến sự chuyển hoá lipid, cholesterol trong, tập trung trên gen mục tiêu ApoB, liên

quan đến bệnh cao cholesterol trong máu có tính gia đình, gồm có 45 bài báo khoa học tiếng Anh (hình 3.1) Theo tiêu chí của PRISMA, bộ dữ liệu được chọn lọc, trích xuất dữ liệu trong 28 nghiên cứu đoàn hệ (hình 3.1)

Hình 3 1 Sơ đồ trích xuất dữ liệu trong phân tích tổng hợp

Chú thích:

Tổng số công bố khoa học

Bộ dữ liệu gen ApoB 45 5 40 5 35 4 31 3 28

3.1.1 Tỉ lệ đột biến tổng thể trên bộ dữ liệu về gen ApoB

Trong 28 nghiên cứu đoàn hệ (bảng 3.1), tổng số mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân FH là 38.741 mẫu Chỉ số bất đồng nhất I2 phản ánh sự khác biệt, không đồng nhất về tỉ lệ xuất

hiện tính chất đột biến trên gen ApoB giữa các công bố khoa học nêu trên là 99,96% Do đó, chỉ số Proportion phản ánh tỉ lệ xuất hiện tính chất đột biến trên gen ApoB được xác

định theo mô hình R, kết quả phân tích ở bảng 3.2, hình 3.1 và hình 3.2 Bộ dữ liệu gồm 28 nghiên cứu đoàn hệ Trong bộ dữ liệu (bảng 3.1) cho thấy trên người bệnh FH (FDB),

các dạng đột biến nổi trội trên gen ApoB xuất hiện tập trung ở vùng exon 26, cụ thể là

Số mẫu đột biến

2016 Anh Châu Âu

PCR, Melting

Curve genotyping 635 4 R3527Q * Benn,

2016 Đan Mạch Châu Âu Realtime-PCR,

MLPA 76 49 R3500Q Han,

2015 Hàn Quốc Châu Á PCR – Giải trình tự 69 2 R3527Q *

2014 Anh Châu Âu PCR – Giải trình tự 125 2 R3527Q Bertolini,

2013 Ý Châu Âu

Northern Blot,

RT-PCR 1018 18 R3527Q Chatziste

fanidis, 2013

Hy Lạp Châu Âu AS-PCR 6 6 R3527Q Futema,

2012 Mỹ Châu Mỹ PCR – Giải trình tự 48 2 R3527Q Tichý,

2011 Croatia Châu Âu PCR – Giải trình tự 8 1 R3527Q * Chmara,

2011 Ba Lan Châu Âu

PCR – Giải trình tự

MLPA 378 25 R3527Q * Liyanag,

2008 Úc Châu Úc PCR – Giải trình tự 35 8 R3500QR3500W Yang,

2007 Đài Loan Châu Á PCR – Giải trình tự 30 3 R3527Q * Tosi,

2008 Anh Châu Âu

PCR – Giải trình tự

MLPA 200 14 R3500W Soufi,

2004 Đức Châu Âu PCR – Giải trình

tự, DGGE 853 844 R3005Q * Real,

2001 Anh Châu Âu

SSCP, Southern

Blot 227 8 R3500Q Bochman

n, 2001 Đức Châu Âu PCR – Giải trình tự

SSCP 31 22 R3500Q * Kalina,

2001 Hungary Châu Âu AS–PCR 21000 2 R3500Q Lombard,

2000 Hà Lan Châu Âu

PCR – Giải trình tự

DGGE 1223 30 R3500Q Haddad,

1999 Uhta Châu Mỹ PCR – Giải trình tự 47 3 R3500Q

Chú thích (*): Tiêu chí xác định bệnh FH với khoảng giá trị xác định lượng cholestereol tổng số (≥5 mmol/L) và lượng LDL cholesterol (5≥ mmol/L hoặc ≥190 mg/dL) trong được xác định

chi tiết trong một số công bố khoa học của Gabcova và cộng sự, 2017: 8,3 ± 0,3 và 6,0 ± 0,3;

Du và cộng sự, 2016: 5,52 – 20,15 và 5,47 - 18,21; Pandey và cộng sự, 2016: 5,5 – 9,2 và 4 –

7,2; Han và cộng sự, 2015: 8,2 ± 1,24 và 6 ± 1,06; Pecin và cộng sự, 2011: 6,1 – 10,7 và 4,4 –

8,41; Chmara và cộng sự, 2011: 9 ± 2,5 và 6,94 ± 2,4; Yang và cộng sự, 2007: 8,2 ± 1,8 và 5,7 ± 1,4; Soufi và cộng sự, 2004: 2,46 – 8,8 và 1,6 – 6,2

Dựa vào thông tin của 28 công bố khoa học được trình bày ở bảng 3.1, phân tích chỉ số

Proportion phản ánh tỉ lệ tổng thể xuất hiện tính chất đột biến trên gen ApoB là

22,067% (95%CI: 3,497- 50,454; p<0,0001, mô hình R) Xét trên từng nghiên cứu, tỉ lệ

xuất hiện tính chất đột biến trên gen ApoB biến thiên rộng, trong khoảng 0,01%

(95%CI: 0,001 – 0,03) đến 100% (95%CI: 54,07 - 100), kết quả trình bày ở bảng 3.2 và

hình 3.1, hình 3.2

Kết hợp với đồ thị Funnel plot (hình 3.2) và chỉ số I2 (bảng 3.2) cho thấy một số công

bố khoa học biểu thị sự biến thiên lớn về tỉ lệ đột biến trên gen ApoB và khoảng tin cậy

(95%CI) có thể lân cận 0 hoặc bao quanh giá trị 1 Do đó, nghiên cứu tiếp tục thực hiện chọn lọc dữ liệu đưa vào phân tích tổng hợp lần 2, nhằm làm rõ hơn về chiều hướng đột biến (tỉ lệ đột biến) trên người bệnh FH Thông tin của các công bố khoa học được rời

khỏi mô hình phân tích, cụ thể là Du et al., 2016, Han et al., 2015; Futema et al., 2014; Futema et al., 2012; Pecin et al., 2011; Kaline et al., 2001

Các kết quả phân tích lần 2 được thể hiện ở bảng 3.3 và hình 3.3 Dựa vào 22 công bố

khoa học, kết quả phân tích ghi nhận tỉ lệ xuất hiện tính chất đột biến trên gen ApoB là

28,31% (95%CI: 6,16 – 58,53; p<0,0001; mô hình R)

Tóm lại, dựa vào bộ dữ liệu ban đầu (28 công bố khoa học) và bộ dữ liệu đã được lọc (22 công bố khoa học), chỉ số Proportion phản ánh tỉ lệ xuất hiện tính chất đột biến trên

gen ApoB trong các mẫu bệnh phẩm máu của bệnh nhân FH lần lượt là là 22,067%

(95%CI: 3,497 – 50,454; p<0,0001) và 28,316% (95%CI: 6,169 – 58,539; p<0,0001; mô hình R) Kết quả nghiên cứu này xấp xỉ với nghiên cứu của Liyanage và cộng sự (2008)

được ước tính chỉ số Proportion phản ánh tỉ lệ xuất hiện tính chất đột biến trên gen ApoB

trong các mẫu bệnh phẩm ở người Úc là 20%; cao hơn nghiên cứu của Real và cộng sự

(2003), phản ánh tỉ lệ xuất hiện tính chất đột biến trên gen ApoB trong các mẫu bệnh

phẩm của bệnh nhân người Tây Ban Nha là 9%

Bảng 3 2 Dữ liệu đồ thị “Forest plot” biểu thị giá trị “Proportion” của các dạng

đột biến gen APOB trên nhóm bệnh nhân FH, thuộc 28 nghiên cứu đoàn hệ

Công bố khoa học (tác giả, năm)

Tổng mẫu

Chỉ số Khoảng tin cậy Proportion 95%CI

Trọng số (%)

38741 22,06 (3,49 – 50,45) 100 Phân tích tính bất đồng nhất: Chi2 = 64220,7671; df= 27 (P<0,0001), I2=99,96%

Hình 3 2 Đồ thị “Forest plot” và “Funnel plot” phản ánh tỉ lệ “Proportion” đột

biến gen ApoB, thuộc 28 nghiên cứu đoàn hệ

Chú thích: Standard Error là sai số chuẩn

Bảng 3 3 Dữ liệu đồ thị “Forest plot” biểu thị giá trị “Proportion” của các dạng

đột biến gen APOB trên nhóm bệnh nhân FH, thuộc 22 nghiên cứu đoàn hệ

17480 28,31 (6,16 – 58,53) 100 Phân tích tính bất đồng nhất: Chi2 = 24426,57; df= 21 (P<0,0001), I2=99,91%