khảo sát tính đa hình của gene lmp1 trên bệnh nhân ung thư vòm họng tại việt nam

Do đó, các nghiên cứu về xây dựng dấu chứng sinh học tiềm năng cũng được tập trung trên các gene của EBV, đặc biệt là việc phát hiện các biến thể trên các gene của EBV trên bệnh nhân ung

TẠI VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TÔT NGHIỆPNGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2020

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨAVIỆT NAM

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Độc lập – Tự do – Hạnh phúc KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là: Lê Thị Mỹ Kim

Ngày sinh: 08/05/1997 Nơi sinh: Ninh Thuận

Chuyên ngành: Y Dược – Khoa Công nghệ sinh học Mã sinh viên: 1653010128 Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

Lê Thị Mỹ Kim

Ý KIẾN CHO PHÉP BẢO VỆ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

Giảng viên hướng dẫn: ThS Lao Đức Thuận

Học viên thực hiện: Lê Thị Mỹ Kim Lớp: DH16YD61

Ngày sinh: 08/05/1997 Nơi sinh: Ninh Thuận

Tên đề tài: KHẢO SÁT TÍNH ĐA HÌNH CỦA GENE LMP1 TRÊN BỆNH NHÂN

UNG THƯ VÒM HỌNG TẠI VIỆT NAM

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép sinh viên được bảo vệ khóa luận

LỜI CẢM ƠN

Trong khoảng thời gian thực tập vừa qua, em đã học tập được nhiều kiến thức chuyên ngành quan trọng và lý thú dưới sự giúp đỡ rất nhiều từ trường học, các thầy cô, các bạn và sự động viên của gia đình mỗi lúc khó khăn Em rất biết ơn về điều đó!

Đầu tiên, em xin cảm ơn phòng Sinh học phân tử thuộc khoa Công nghệ sinh học của trường đại học Mở Tp.HCM – là nơi em làm khóa luận đã tạo các điều kiện về cơ sở vật chất để em có thể được học tập và trải nghiệm thực tế qua các buổi thực hành tại nơi đây Tuy còn nhiều thiếu sót, nhưng em tin rằng em đã học được rất nhiều kiến thức về các thao tác để làm việc với các máy móc trong phòng thí nghiệm

Tiếp theo, em muốn đặc biệt cảm ơn Thầy – Thạc sĩ Lao Đức Thuận, thầy đã hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt quá trình thực tập tại phòng Em sẽ không thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp được nếu không có sự dẫn dắt, trợ giúp từ thầy Những kiến thức thầy chỉ dạy rất thực tế, thầy đã giảng giải, giúp đỡ em rất nhiều kể cả trong học tập và cuộc sống Em cảm ơn thầy, những kiến thức ấy em sẽ luôn quý trọng và nhớ mãi!

Và những người không thể thiếu là các thành viên của phòng Sinh học phân tử, em xin cảm ơn chị Thiều Hồng Huệ, anh Quang Trọng Minh và các thành viên khác của phòng đã luôn hỗ trợ, chỉ dạy em rất nhiều điều Mọi người đã luôn quan tâm, chăm sóc cho em, giúp đỡ em khi em làm sai và hướng dẫn em khi em không làm được

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình em đã luôn bên em, yêu thương cổ vũ và động viên em mỗi ngày Sự yêu thương, giúp đỡ từ mọi người là động lực quan trọng để giúp em từng bước một hoàn thành khóa luận cũng như hoàn thiện chính bản thân Trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp em đã học được rất nhiều, nhưng chắc chắn sẽ còn nhiều hạn chế và thiếu sót, thế nên nếu khóa luận còn nhiều sai sót, em mong nhận được sự chỉ bảo, đóng góp ý kiến từ các quý thầy cô, để em có thể được học hỏi, nâng cao được vốn kiến thức và kinh nghiệm của bản thân Em xin chân thành cảm ơn!

1.2 Phân loại ung thư 3

1.3 Tình hình ung thư trên thế giới và trong nước ta 4

2 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ VÒM HỌNG 7

2.1 Sơ lược về ung thư vòm họng 7

2.2 Bệnh nguyên 9

2.3 Tình hình ung thư vòm họng trên thế giới và trong nước ta 11

3 EPSTEIN-BARR VIRUS VÀ TÍNH ĐA HÌNH 14

PHẦN II – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

1 CÁC CÔNG CỤ TIN SINH DÙNG ĐỂ KHAI THÁC DỮ LIỆU 25

2 MẪU THÍ NGHIỆM 25

3 DỤNG CỤ, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 26

3.1 Dụng cụ 26

3.2 Thiết bị 26

3.3 Hóa chất 26

4 QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU 36

5 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

5.1 Phương pháp khai thác CSDL 27

5.2 Khảo sát in silico 29

5.3 Phương pháp thu nhận trình tự 29

5.4 Phương pháp đánh giá mồi 30

5.5 Phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) và giải trình tự 31

5.6 Phương pháp thực nghiệm 32

PHẦN III – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 38

1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT IN SILICO 38

1.1 Kết quả khảo sát in silico đa hình 30-bp deletion 38

1.2 Kết quả khảo sát in silico đa hình XhoI-loss 40

2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỒI 42

2.1 Khảo sát mồi bằng phần mềm IDT 42

2.2 Khảo sát mồi bằng phần mềm ANNHYB 44

2.3 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi bằng phần mềm BLAST 46

3 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 48

3.1 Kết quả tách chiết và tinh sạch DNA 48

3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR 49

DANH MỤC VIẾT TẮT

aa: amino acid

APOC3: gene apolipoprotein C3

BARTs: BamHI-A Right-ward Transcripts

CSDL: Các cơ sở dữ liệu

EBNA-1: Epstein-Barr Nuclear Antigen-1

EBV: Epstein-Barr virus

LCL: dòng tế bào lymphoblastoid bị nhiễm trùng vĩnh viễn

LMP1: Lantent membrane protein 1

OD: Optical Density

PCR: Polymerase Chain Reaction

PH: Phenol Chroloform

PI3-K: phosphatidylinositol 3-kinase

SNP: Đa hình đơn nucleotide

UTVH: Ung thư biểu mô vòm họng

WHO: Tổ chức Y tế Thế giới WHO

MỤC LỤC HÌNH ẢNH

Phần I – Tổng quan

Hình 1.1 Tỷ lệ mắc ca mới (Incidence) và tỷ lệ tử vong (Mortality) do ung thư trên cả

hai giới tính của từng châu lục trên thế giới 5

Hình 1.2 Tỷ lệ ca mắc mới do các ung thư trên toàn thế giới năm 2018 5

Hình 1.3 Tỷ lệ ca tử vong do các ung thư trên toàn thế giới năm 2018 6

Hình 1.4 Tỷ lệ các loại ung thư ở Việt Nam năm 2018 6

Hình 1.5 Vị trí giải phẫu của ung thư vòm họng 7

Hình 1.6 Tỷ lệ mắc ca mới (Incidence) và tỷ lệ tử vong (Mortality) do UTVH trên cả hai giới tính của từng châu lục trên thế giới 12

Hình 1.7 Tỷ lệ ca mắc mới của UTVH trên thế giới năm 2018 12

Hình 1.8 Tỷ lệ ca tử vong của UTVH trên thế giới năm 2018 13

Hình 1.9 Tỷ lệ ca mắc mới (Incidence) và tỷ lệ chết (Mortality) do ung thư vòng họng tại Việt Nam 13

Hình 1.10 Cấu trúc hệ gene của EBV (46) 16

Hình 1.11 Minh họa một SNP, thay thế G-C thành A-T và ngược lại 18

Hình 1.12 Sơ đồ biểu diễn sự tương tác của các phân tử và đường dẫn tín hiệu của gene LMP1 (64) 20

Phần II – Vật liệu và phương pháp Hình 2.1 Tóm tắt quy trình nghiên cứu 37

Hình 2.2 Chu trình nhiệt của mồi L30-F, R 34

Hình 2.3 Chu trình nhiệt của mồi ET1, 2-F, R 34

Phần III – Kết quả nghiên cứu và thảo luận Hình 3.1 Kết quả khảo sát mồi L30-F và L30-R 44

Hình 3.2 Kết quả khảo sát mồi ET1-F và ET2-R 45

Hình 3.3 Kết quả bắt cặp của trình tự mồi L30-F, R với CSDL 46

Hình 3.4 Kết quả bắt cặp của trình tự mồi ET1, 2-F, R với CSDL 46

Hình 3.5 Hình sắp gióng cột trình tự mồi L30-F, R với trình tự trong CSDL có độ tương đồng cao nhất 47

Hình 3.6 Hình sắp gióng cột trình tự mồi ET1, 2-F, R với trình tự trong CSDL có độ tương đồng cao nhất 48

Hình 3.7 Kết quả điện di mẫu bệnh của cặp mồi L30-F, R 49

Hình 3.8 Kết quả điện di mẫu lành của cặp mồi L30-F, R 50

Hình 3.9 Kết quả điện di mẫu bệnh của cặp mồi ET1, 2-F, R 51

Hình 3.10 Kết quả điện di mẫu lành của cặp mồi ET1, 2-F, R 51

Hình 3.11 Trình tự khuếch đại LMP1 trên các mẫu sinh thiết UTVH đại diện 54

Hình 3.12 Trình tự vị trí XhoI khi không bị đột biến và vị trí đột biến của đa hình loss trên gene LMP1 62

XhoI-Hình 3.13 Trình tự không bị đột biến G169373C và trình tự bị đột biến G169373C 67

Hình 3.14 Trình tự không bị đột biến G169422T và trình tự bị đột biến G169422T 68

Phần III – Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Bảng 3.1 Bảng kết quả trích xuất dữ liệu các công bố khoa học về đa hình 30-bp deletion

Bảng 3 9 Số liệu đột biến tên các mẫu UTVH được giải trình tự với cặp mồi ET1, 2-F, R 71Bảng 3.10 Thống kê amino acid đột biến của các mẫu trong nghiên cứu hiện tại và các nghiên cứu trước đó 73Bảng 3 11 Thống kê sự hiện diện của các đa hình LMP1 trên mẫu UTVH 75

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư là một nhóm các bệnh phổ biến mà nhiều người bị mắc phải trên thế giới Mỗi ngày hàng triệu người bệnh phải đối mặt với nỗi đau bệnh tật và gánh nặng về kinh tế gia đình do ung thư gây ra Ung thư vòm họng là một trong mười loại ung thư phổ biến của nước ta Theo thống kê của Globocan (2018), nước ta có số ca mắc ung thư vòm họng mới là 6.212 ca, đứng thứ hai trong các nước Đông Nam Á Cũng theo thống kê này, cùng năm chúng ta có tới 4.232 ca tử vong do ung thư vòm họng và cũng là nước đứng thứ hai về tỉ lệ chết do ung thư vòm họng gây ra trong cùng khu vực

Thế nhưng, ung thư vòm họng có thể được điều trị tốt nếu được phát hiện sớm và kịp thời Tuy nhiên, bệnh nhân bị loại ung thư này thường bị phát hiện khi đã tiến triển bệnh ở giai đoạn cuối hoặc gần cuối Có nhiều nguyên nhân gây ra sự trễ nải này và các nhà nghiên cứu luôn luôn tìm kiếm các phương pháp để phát hiện và điều trị sớm nhất có thể cho bệnh nhân ung thư vòm họng Những năm gần đây, việc tìm kiếm các dấu chứng sinh học để phục vụ cho việc sàng lọc, chẩn đoán ung thư vòm họng ngày càng phát triển và có tính ứng dụng cao Các nghiên cứu từ trước cho thấy, sự xâm nhiễm của Epstein-Barr virus (EBV) là nguyên nhân chính gây ra ung thư vòm họng Do đó, các nghiên cứu về xây dựng dấu chứng sinh học tiềm năng cũng được tập trung trên các gene của EBV, đặc biệt là việc phát hiện các biến thể trên các gene của EBV trên bệnh nhân ung thư vòm họng Hơn nữa, việc phát hiện các biến thể còn cung cấp cơ sở cho các nghiên cứu về chức năng và cơ chế phát sinh ung thư Việt Nam hiện nay cũng có nhiều nghiên cứu

về ung thư vòm họng trên các họ gene của EBV như họ gene: EBNAs, LMPs, EBERs, Trong đó LMP1 của họ gene LMPs là một protein màng tiêu biểu của EBV đã được các

nhà nghiên cứu trên thế giới tập trung nghiên cứu và khẳng định là một gene mang nhiều biến thể tiêu biểu cho dấu chứng sinh học tiềm năng Nhưng tại Việt Nam, nghiên cứu

về các biến thể trên gene LMP1 cũng như tính đa hình gene LMP1 vẫn chưa có nhiều

Hai biến thể, xóa 30-bp (30-bp deletion) và mất vị trí xhoI (XhoI-loss) được xem là các

biến thể tiêu biểu thể hiện tính đa hình của gene LMP1 Vì vậy, em thực hiện triển khai

đề tài:” Khảo sát tính đa hình của gene LMP1 trên bệnh nhân ung thư vòm họng tại Việt Nam” với mong muốn nghiên cứu được tính đa hình của gene LMP1 với hai biến

thể xóa 30-bp và mất vị trí XhoI, đồng thời khám phá thêm các đột biến xung quanh vùng gene được khảo sát Từ đó, nghiên cứu có thể so sánh kiểu gen, vị trí các biến thể tìm được với cơ sở dữ liệu của những nghiên cứu trên thế giới trước đó về đa hình gene

LMP1 để có thể đưa ra sự tương đồng hoặc khác biệt, cũng như tần số hiện diện của các đa hình gene LMP1 của EBV giữa Việt Nam và những nước khác hoặc khu vực khác

trên thế giới Đồng thời, em cũng mong đề tài sẽ góp phần là một tiền đề để có thể giúp xây dựng được một dấu chứng sinh học sàng lọc cho EBV trong tương lai

1.2 Phân loại ung thư

Có hơn 100 loại ung thư hiện nay Ung thư thường được đặt tên theo nơi chúng hình thành hoặc loại tế bào hình thành nên chúng (2)

Về cơ bản, ung thư thường được chia thành các nhóm chính sau (2):

- Ung thư biểu mô (Carcinoma): là loại ung thư phổ biến nhất Chúng được hình thành ở các tế bào biểu mô, là các tế bào bao phủ bên trong và bên ngoài bề mặt của cơ thể

- Ung thư mô liên kết (Sarcoma): là ung thư hình thành trong các mô xương và mô mềm, bao gồm cơ, mỡ, mạch máu, mạch bạch huyết và mô sợi (như gân và dây chằng)

- Bệnh bạch cầu (Leukemia): là ung thư hình thành trong mô tạo máu của tủy xương Những ung thư này không tạo thành khối u rắn, mà thay vào đó tạo thành một lượng lớn bạch cầu bất thường tích tụ trong máu và tủy xương, lấn át các tế

bào máu bình thường Do đó, nó gây ra lượng tế bào máu trong cơ thể bị thấp khiến cơ thể khó lấy oxy hơn đến các mô, khó kiểm soát chảy máu hoặc chống nhiễm trùng

- Ung thư hạch (Lymphoma): là ung thư bắt đầu trong tế bào lympho (tế bào T hoặc tế bào B) Trong ung thư hạch, các tế bào lympho bất thường tích tụ trong các hạch bạch huyết và mạch bạch huyết, cũng như trong các cơ quan khác của cơ thể Có hai loại ung thư hạch chính là ung thư hạch Hodgkin ( có các tế bào lympho bất thường là Reed-Sternberg được hình thành từ các tế bào B) và ung thư hạch không Hodgkin ( có một nhóm lớn các tế bào lympho bất thường và được hình thành từ tế bào B hoặc tế bào T)

- Đa u tủy (Multiple Myeloma): là ung thư bắt đầu trong các tế bào plasma Các tế bào plasma bất thường, tích tụ trong tủy xương và hình thành các khối u trong xương khắp cơ thể Đa u tủy còn được gọi là u nguyên bào plasma và bệnh Kahler - Ung thư hắc tố: bắt đầu trong các tế bào trở thành melanocytes, là những tế bào

chuyên biệt tạo ra melanin (sắc tố màu cho da)

- Ung thư hệ thần kinh: ung thư bắt nguồn từ các mô hệ thần kinh, tế bào não và tủy sống

1.3 Tình hình ung thư trên thế giới và trong nước ta

Năm 2018 theo thống kê của Globocan, trên thế giới có khoảng 18,1 triệu ca mới mắc ung thư, số ca tử vong lên đến gần 9,6 triệu ca (3), cứ trong 6 trường hợp thì có 1 trường hợp chết do ung thư (1), đây là những con số vô cùng đáng báo động Các quốc gia có số ca tử vong do ung thư cao nhất lần lượt là Trung Quốc, Mỹ, Ấn Độ, Nhật Bản, Đức Ngoài ra, Châu Á cũng là châu lục có tỷ lệ mắc ca mới và tử vong cao nhất chiếm 48,4% và 57,3% so trên toàn thế giới (3)

Hình 1.1 Tỷ lệ mắc ca mới (Incidence) và tỷ lệ tử vong (Mortality) do ung thư trên cả hai giới tính của từng châu lục trên thế giới.

Hình 1.2 Tỷ lệ ca mắc mới do các ung thư trên toàn thế giới năm 2018.

Hình 1.3 Tỷ lệ ca tử vong do các ung thư trên toàn thế giới năm 2018.

Trong khi đó, số ca ung thư mắc mới vào năm 2018 của Việt Nam cũng vô cùng cao, lên đến khoảng 164.671 ca, số ca tử vong do ung thư trong cùng năm là 114.871 ca (3) Việt Nam đang đứng trước những khó khăn to lớn và cấp thiết do ung thư gây ra bởi số ca mắc mới và tử vong do ung thư ngày càng tăng lên nhanh chóng Theo ước tính của Globocan, vào năm 2040 ở Việt Nam số ca mắc mới và tử vong do ung thư có thể lên đến con số 285.374 và 214.269 ca

Hình 1.4 Tỷ lệ các loại ung thư ở Việt Nam năm 2018.

Chú thích: Số liệu được thống kê cho tất cả các độ tuổi và không phân biệt giới

tính

2 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ VÒM HỌNG

2.1 Sơ lược về ung thư vòm họng

Ung thư biểu mô vòm họng (UTVH) là một khối u phát sinh từ các tế bào biểu mô bao phủ bề mặt và đường vào vòm họng Năm 1921, lần đầu tiên Regaud và Schmincke mô tả UTVH như một thực thể riêng biệt (5, 6) UTVH thường bắt đầu trong vùng vòm mũi họng, là phần trên cùng của hầu họng, nằm phía sau khoang mũi và gần nền sọ Các triệu chứng thường gặp bao gồm: [1] sự xuất hiện của khối u trong vòm họng gây chảy máu cam, tắt nghẽn mũi; [2] sự rối loạn chức năng của ống eustachian gây ù tai, nghe kém, điếc tai; [3] xói mòn nền sọ và liệt dây thần kinh sọ gây đau đầu, tê liệt; [4] di căn hạch ở cổ,…(4) Cũng như các ung thư khác, việc chẩn đoán, sàng lọc sớm bệnh ung thư vòm họng sẽ hứa hẹn cho việc nâng cao khả năng sống sót của bệnh nhân

Hình 1.5 Vị trí giải phẫu của ung thư vòm họng

Chú thích: UTVH nằm ở vùng vòm mũi họng, là nơi tiếp giáp với mũi, họng và chỗ đổ của ống vòi nhĩ (nơi thông giữa tai và mũi họng)

Có ba phân nhóm của UTVH được công nhận trong phân loại của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) (7):

 Loại I: ung thư biểu mô tế bào vảy sừng, thường thấy ở người lớn tuổi (Keratinising squamous-cell carcinoma)

 Loại II: ung thư biểu mô không sừng hóa (Differentiated nonkeratinising

carcinoma)

 Loại III: ung thư biểu mô không biệt hóa (Undifferentiated carcinoma)

Theo thống kê tại Bắc Mỹ, khoảng 25% bệnh nhân có khối u thuộc mô học loại I,

12% có loại II và 63% có loại III Còn ở phía nam Trung Quốc, bệnh nhân thuộc loại I là 2%, loại II là 3% và loại III là 95% (4) Năm 1991, loại II và III đã được kết hợp thành một loại ung thư biểu mô không sừng hóa (8)

UTVH thường được phát hiện trễ, hầu hết ở giai đoạn muộn do biểu hiện của những người bệnh UTVH thường không rõ ràng, dễ dàng bị người bệnh xem nhẹ, vì triệu chứng của UTVH hầu hết là các triệu chứng “mượn” từ các cơ quan lân cận khác như: tai, mũi, thần kinh… Trong khi đó, nếu được phát hiện, chẩn đoán và chữa trị vào giai đoạn đầu thì bệnh nhân mắc UTVH có thể được chữa trị và phục hồi tốt Ở Singapore, bệnh nhân thường được phát hiện mắc UTVH vào giai đoạn 2 hoặc giai đoạn 3 và phần lớn ở người lớn tuổi (9) Ở Indonesia, hơn 80% bệnh nhân phát hiện đang mắc UTVH vào giai đoạn muộn (10) Bệnh nhân phát hiện mắc UTVH giai đoạn muộn thường khó chữa trị, có nguy cơ tái phát cao và tỷ lệ sống sót giảm đáng kể Vì vậy, ngành y học vẫn luôn tích cực tìm kiếm các biện pháp tốt nhất để có thể trị liệu và cải thiện tình trạng bệnh của bệnh nhân UTVH như phương pháp phẫu thuật, hóa trị, xạ trị Tuy nhiên, các phương pháp này thường ảnh hưởng rất lớn đến cơ thể người bệnh, nhất là các bệnh nhân lớn tuổi Mặt khác, sự di căn của các khối u ác tính vẫn luôn là vấn đề nan giải của y học,

bệnh nhân ung thư bị di căn chiếm tỷ lệ 25-34% và những bệnh nhân này thường có tỷ lệ sóng sót rất thấp (11, 12)

Các nghiên cứu trước đó về UTVH cho thấy, UTVH có sự phân hóa về mặt địa lý và chủng tộc (10) UTVH có sự phân bố địa lý không đồng đều trên thế giới, chủ yếu tập trung tại khu vực Châu Á và Châu Phi (10) Theo thống kê của Globocan năm 2018, có 84,6% trường hợp mắc ung thư vòm họng xảy ra tại Châu Á và 7,4% trường hợp tại châu Phi (3) UTVH rất phổ biến tại Châu Á (đặc biệt là Trung Quốc và Đông Nam Á) (13) Ngoài ra, cũng theo thống kê này, tổng số ca UTVH trên thế giới là 129.079 ca, tổng số ca tử vong lên đến 72.987 ca Quốc gia có số ca UTVH cao nhất là Trung Quốc (60.558 ca), Indonesia (17.992 ca), Việt Nam (6.212 ca) và Ấn Độ (5.086 ca)

Một số nhóm dân tộc có nguy cơ mắc UTVH cao, ví dụ: dân tộc Bidayuh trên đảo Borneo, dân tộc Nagas ở miền Bắc Ấn Độ và dân tộc Inuits ở Bắc Cực (10) Ngoài ra, còn có một số quần thể khác có nguy cơ mắc bệnh cao bao gồm: người bản địa Đông Nam Á, người bản địa của vùng Artic, người Ả Rập ở Bắc Phi và một phần ở Trung Đông Đặc biệt, tỷ lệ mắc UTVH của người ở các tỉnh miền Nam Trung Quốc cao gấp 20 lần đến 50 lần so với các nước phương Tây (16, 17) Ngoài ra, đàn ông có khả năng mắc UTVH cao hơn gấp hai đến ba lần so với phụ nữ (14) và độ tuổi có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất là từ 50 đến 60 tuổi (15) Người cao tuổi có nguy cơ bị tái phát UTVH cao hơn và cũng có tỷ lệ sống thấp hơn Mặt khác, tỷ lệ tử vong cao nhất do UTVH đã được ghi nhận ở những người trên 85 tuổi (10)

2.2 Bệnh nguyên

Quá trình hình thành UTVH trải qua nhiều giai đoạn phát triển Đầu tiên là từ trạng thái bình thường, cá thể bắt đầu chuyển sang trạng thái rối loạn tổn thương ở mức độ thấp (Low grade dysplastic lesion), tiếp đó có sự hình thành khối u tại chỗ (Carcinoma in situ), sau đó khối u tăng sinh và chuyển sang giai đoạn xâm lấn các cơ quan khác (Invasive carcinoma) (18, 19) Tại mỗi một giai đoạn đều có các yếu tố tác động khác

nhau Tuy nhiên, có ba nguyên nhân chính gây nên ung thư vòm họng, bao gồm: [1] sự xâm nhiễm của EBV (Epstein-Barr Virus); [2] yếu tố di truyền; [3] yếu tố môi trường (20)

Nhiều nghiên cứu về UTVH trên thế giới cho thấy, UTVH có mối quan hệ đặc biệt với sự xâm nhiễm của EBV Theo nghiên cứu của Niedobitek và cộng sự (1991), Weiss và cộng sự (1989) đã chứng minh được rằng ung thư biểu mô vòm họng không biệt hóa luôn có EBV dương tính, bất kể nguồn gốc địa lý (21, 22) Wu và cộng sự (2003) đã phát hiện ra rằng các khối u UTVH dương tính với EBV tăng trưởng nhanh hơn các khối u âm tính với EBV (23) Nghiên cứu của Chou và cộng sự (2008) đã cho thấy, có khoảng 95% khối u vòm họng có liên quan tới EBV (24) EBV hiện diện ở giai đoạn đầu dưới dạng tiềm tan và gây bệnh khi chúng chuyển sang trạng thái hoạt động (dạng tan), kích

hoạt các gene như EBNA-1 (Epstein-Barr Nuclear Antigen-1) mã hóa cho protein sớm EBNA-1 và một loạt các protein khác như LMP1 (Lantent membrane protein 1), BARTs (BamHI-A Right-ward Transcripts),… giúp chúng nhân lên, xâm nhiễm vào các tế bào

và gây biến đổi mô, tế bào cơ thể để phát triển thành khối u ác tính (18) EBV chỉ biểu

hiện bệnh khi các gene virus (EBNA-1, LMPs, BARTs,…) chuyển sang trạng thái hoạt

động (dạng tan) nhằm giúp chúng nhân lên và gây nhiễm Lúc này, chúng sẽ di căn trong cơ thể, phát triển thành khối u ác tính (18, 24)

Các yếu tố di truyền có vai trò rất quan trọng trong việc hình thành và phát triển ung thư Yếu tố di truyền bao gồm: hiện tượng epigenetics (sự methyl hóa, biến đổi protein histone và miRNA), đột biến, tính đa hình (SNPs,…) (25) Những nghiên cứu về yếu tố đa hình một số gene của EBV gần đây cũng cho thấy, các biến thể ở một số gene của EBV liên quan đến khả năng phát sinh khối u vòm họng và đẩy nhanh tiến trình hình thành ung thư (26, 27)

Nhiều công trình nghiên cứu chứng minh yếu tố môi trường có vai trò trong việc hình thành ung thư vòm họng Điển hình như sự khác biệt về khu vực địa lý, thói quen sinh

hoạt, môi trường sống, điều kiện sống,… có ảnh hưởng nhất định đến mức độ người bị ung thư vòm họng tại các khu vực khác nhau trên thế giới Ví dụ, ung thư vòm họng hiếm có ở người da trắng nhưng lại rất phổ biến ở Quảng Đông (Trung Quốc), hay ở người Eskimo ở Alaska và thổ dân ở Greenland Ngoài ra, các thói quen sinh hoạt như tiêu thụ cá muối, rau củ quả không tươi, hút thuốc lá, tiếp xúc với hóa chất độc hại,… đều làm tăng nguy cơ mắc ung thư vòm họng Nhiều nghiên cứu kiểm soát trường hợp đã được thực hiện ở các quần thể khác nhau trên các khu vực khác nhau của Châu Á và Bắc Mỹ đã minh chứng được rằng cá muối kiểu Quảng Đông và các thực phẩm bảo quản khác chứa một lượng lớn Nitrosodimethyamine (NDMA), N-nitrospyrrolidene (NPYR), and N-nitrospiperidine (NPIP) có thể là yếu tố rủi ro gây ung thư vòm họng (28, 29, 30, 31, 32) Ở Tunisia, hỗn hợp gia vị “harissa” cũng đã được xác định là yếu tố có nguy cơ gây ung thư biểu mô mũi họng (33) Nghiên cứu của Yu và cộng sự (2002) đã chứng minh nếu tiếp xúc với muối ở độ tuổi sớm sẽ có nguy cơ cao mắc UTVH ở miền Nam Trung Quốc Ngoài ra, việc hút thuốc lá và nghề nghiệp có phơi nhiễm với formaldehyd và bụi gỗ cũng là những yếu tố rủi ro có thể gây UTVH (17) Điều kiện kinh tế xã hội kém cũng có liên quan đến nhiễm EBV tiên phát sớm, trong khi nhiễm EBV nguyên phát muộn được thấy ở những người có tình trạng kinh tế xã hội cao Thu nhập thấp và điều kiện gia đình đông đúc cũng đã được chứng minh làm tăng khả năng mắc EBV ở trẻ em từ các khu vực như Thái Lan (34), Thổ Nhĩ Kỳ (35), Ghana (36) và Đan Mạch (37)

2.3 Tình hình ung thư vòm họng trên thế giới và trong nước ta

Theo thống kê của Globocan (2018), Châu Á có tỷ lệ mắc UTVH cao nhất là 84,6%, Châu Phi đứng thứ hai là 7,4%, tiếp đến là Châu Âu (3,9%), Mĩ Latin và Caribbean (2,1%), Nam Mĩ (1,9%) (3) và toàn thế giới có 129.074 ca mắc mới, có 72.987 ca tử vong do UTVH Trong đó, Trung Quốc là quốc gia có số ca mắc UTVH mới cao nhất với 60.558 ca

Hình 1.6 Tỷ lệ mắc ca mới (Incidence) và tỷ lệ tử vong (Mortality) do UTVH trên

cả hai giới tính của từng châu lục trên thế giới

Hình 1.7 Tỷ lệ ca mắc mới của UTVH trên thế giới năm 2018

Hình 1.8 Tỷ lệ ca tử vong của UTVH trên thế giới năm 2018

Cũng theo thống kê của Globocan (2018), trong khu vực Đông Nam Á, tổng số ca mắc UTVH là 34.681 ca Trong đó, quốc gia có số ca mắc UTVH mới cao nhất là Indonesia (17.992 ca), tiếp đó Việt Nam đứng thứ hai trong khu vực với 6.212 ca, tiếp xuống là Philippines (2.913 ca), Thailand (2.200 ca), Malaysia (2.089 ca) Việt Nam đang phải đối mặt với số lượng khổng lồ bệnh nhân UTVH và con số này còn không ngừng tăng lên hằng năm Số ca chết do UTVH vào năm 2018 của Việt Nam cũng vô cùng cao là 4.232 ca (theo thống kê Globocan), chiếm vị trí số 2 trong khu vực Đông Nam Á (vị trí số 1 là Indonesia với 11.204 ca tử vong)

Hình 1.9 Tỷ lệ ca mắc mới (Incidence) và tỷ lệ chết (Mortality) do ung thư vòng

họng tại Việt Nam

Bảng 1.1 Thống kê Globocan số ca ung thư vòm họng mắc mới và tử vong của khu vực Đông Nam Á năm 2018

Virus Epstein-Barr (EBV) là virus khối u đầu tiên ở người được phát hiện, đem mang

lại cái nhìn sâu sắc về mầm bệnh ung thư và quá trình nhiễm kéo dài của herpesvirus (38) EBV thuộc nhóm herpesvirus type 4, họ herpesviridae, được phát hiện bởi Epstein

và Barr vào năm 1964 trong mô khối u của một bệnh nhân bị mắc ung thư hạch Burkitt

từ Châu Phi (39) Năm 1984, Baer và cộng sự EBV đã cho xuất bản bộ gene được giải trình tự hoàn toàn của EBV, đây cũng là virus herpesvirus đầu tiên có bộ gene được giải trình tự hoàn toàn, EBV này có nguồn gốc từ một bệnh nhân bị mắc bệnh bạch cầu đơn nhân nhiễm trùng (40), nghiên cứu này đã tạo được tiền đề rất lớn cho các nghiên cứu về EBV và UTVH sau này Việc nhiễm EBV là rất phổ biến, nó ảnh hưởng đến tất cả các nhóm người (41, 42), phần lớn không có triệu chứng và bị nhiễm suốt đời

EBV chứa bộ gene DNA sợi đôi, xoắn, mạch hở, có kích thước 170180 kb (46) EBV có hai dạng: dạng vòng (episome) tồn tại trong tế bào khi virus chuẩn bị bước sang giai đoạn tan và dạng mạch thẳng tồn tại trong tế bào sau khi xâm nhiễm (47) EBV tồn tại dạng khối cầu bao gồm vỏ capsid, vỏ ngoài và bộ gene virus

Trong in vitro, EBV chuyển đổi hiệu quả các tế bào B đang nghỉ ngơi thành các dòng

tế bào lymphoblastoid bị nhiễm trùng vĩnh viễn (LCL) (42, 44, 45) Các LCL được tạo

ra do nhiễm trùng tế bào lympho B in vitro mang nhiều bản sao DNA virus hình tròn,

ngoại bào (episomes) trong mỗi tế bào và biểu hiện bộ gene của virus, bao gồm 6 kháng

nguyên hạt nhân EBNAs (-1, -2, -3A, -3B, -3C, và -LP) và 3 protein màng tế bào tiềm ẩn LMPs (-1, -2A và -2B) Ngoài các protein tiềm ẩn, LCL cũng cho thấy sự biểu hiện phong phú của các RNA nhỏ mã hóa EBV không được polyadenyl hóa (EBER) là EBER1 và EBER2 và ba protein thuộc họ BARTs là RPMS1, A73, BARF0; những protein này được

thể hiện trong tất cả các dạng nhiễm EBV tiềm ẩn và chúng cũng là mục tiêu tuyệt vời để phát hiện EBV trong các khối u (42, 44, 45)

Hình 1.10 Cấu trúc hệ gene của EBV (46).

Các gene trong EBV đều có chức năng riêng và bổ trợ lẫn nhau Sáu gene mã hóa

cho protein kháng nguyên nhân EBNAs có liên quan đến quá trình xâm nhiễm và nhân

lên của EBV ở giai đoạn đầu, ngoài ra, sự phối hợp hoạt động của các kháng nguyên hạt nhân giúp kiểm soát biểu hiện gene của virus và vật chủ thông qua việc tương tác trực

tiếp với các mạch điều khiển tế bào trong nhân; ba gene mã hóa cho protein màng LMPs là mô phỏng của các protein tín hiệu tế bào chịu trách nhiệm cho việc kích hoạt và sống

sót của tế bào B, liên quan đến chu trình tăng trưởng của EBV trong tế bào B và có thể kích thích tạo khối u, góp phần khiến u lành trở thành u ác tính; hai gene không mã hóa

RNA EBER có chức năng ngăn chặn quá trình apoptosis và sản sinh IL-10 (interleukin 10) (38, 51) và ba protein thuộc họ BARTs liên quan đến đường truyền tín hiệu Notch,

điều hòa lượng Ca2+ trong tế bào (48-50)

Sau khi xâm nhiễm vào cơ thể người, EBV có 3 hướng tiến triển Hướng đầu tiên, EBV xâm nhập vào tế bào biểu mô, ở đây chúng tìm thấy các điều kiện thích ứng và bắt đầu nhân lên, tạo ra vô số vòng đời sau hoặc EBV có thể chuyển từ sơ nhiễm sang gây

nhiễm thứ cấp bằng cách nhân lên mãnh liệt trong lympho B, sau đó giải phóng virus vào nước bọt, hoặc chuyển từ sơ nhiễm sang tàng nhiễm và tiến đến ung thư Hướng thứ hai, EBV gây sơ nhiễm và xâm nhập vào tế bào lympho B, tiếp đó thực hiện sự nhân lên: EBV sơ nhiễm sẽ tìm đến tế bào lympho B vùng họng để xâm nhập và nhân lên trong tế bào này Virus sẽ được giải phóng ra hàng loạt bằng cách dung giải tế bào, chúng xâm nhiễm vào quần thể lympho B và gây nhiễm thứ cấp, kết quả là một lượng virus EBV được giải phóng và có nhiều trong nước bọt Lúc này, EBV quay lại gây nhiễm cho tế bào biểu mô Hướng thứ ba, EBV tàng nhiễm và tiến triển thành ung thư khi có điều kiện: EBV thực hiện gây nhiễm bán sinh sản và tàng nhiễm trong tế bào lympho B, thực hiện quá trình chuyển đổi lympho B và biệt hóa, khiến chúng tăng sinh và tiến triển thành ung thư (52)

Hiện nay, nghiên cứu các gene của EBV được xem là mục tiêu nhắm đến để tìm ra các phương pháp sàng lọc, chẩn đoán cho bệnh nhân UTVH bằng phương pháp sinh học phân tử Hướng nghiên cứu hướng tới đa dạng như nghiên cứu đột biến, biểu hiện gene, tính đa hình,…và nhiều dạng khác, giúp cơ sở dữ liệu về EBV ngày càng đầy đủ và làm rõ ràng hơn mối quan hệ giữa EBV và UTVH

3.2 Tính đa hình

Tính đa hình có ba dạng đặc trưng: đa hình cân bằng (balanced polymorphism), đa

hình di truyền (genetic polymorphism), đa hình đơn nucleotide (single nucleotide polymorphism- SNP)

Đa hình đơn nucleotide (single nucleotide polymorphism- SNP) là sự thay thế của một nucleotide duy nhất xảy ra tại một vị trí cụ thể trong bộ gene, trong đó mỗi biến thể có mặt ở mức độ hơn 1% trong dân số (53) Ví dụ, tại một vị trí cụ thể trong bộ gene người, hầu hết tất cả mọi người đều là ncleotide C, tuy nhiên một số ít cá nhân cũng tại vị trí này thì lại là nucleotide T, điều này thể hiện SNP ở vị trí cụ thể này

Hình 1.11 Minh họa một SNP, thay thế G-C thành A-T và ngược lại

Có hai loại SNP là SNP nằm trong khu vực không mã hóa (Non-coding region) và SNP nằm trong khu vực mã hóa (Coding region) của gene Trong đó, SNPs xảy ra thường xuyên hơn ở khu vực không mã hóa do các ảnh hưởng từ chọn lọc tự nhiên, tỷ lệ tái tổ hợp và đột biến di truyền SNPs nằm trong khu vực mã hóa không nhất thiết phải làm thay đổi trình tự amino acid của protein được tạo ra, vì sự thoái hóa của mã di truyền (54) Ngoài ra, SNPs trong khu vực mã hóa được chia làm hai loại: SNP đồng nghĩa (Synonymous) không gây ảnh hưởng tới trình tự protein và SNP không đồng nghĩa (Non-synonymous) làm thay đổi trình tự protein SNP không đồng nghĩa còn được chia thành hai phân nhóm nhỏ hơn là missense và nonsense Mặt khác, SNPs không nằm trong khu vực mã hóa protein vẫn có thể gây ảnh hưởng đến quá trình tách gene, liên kết các yếu tố phiên mã, suy thoái RNA thông tin hoặc trình tự RNA không mã hóa Biểu hiện gene bị ảnh hưởng bởi SNPs này được gọi là eSNP (SNP biểu hiện)

SNP xảy ra thường xuyên trong DNA bộ gene người Trung bình cứ 1000 nucleotide thì xảy ra một SNP, điều đó có nghĩa là có khoảng 4 đến 5 triệu SNP trong bộ gene của một người Đến nay, đã có hơn 335 triệu SNP đã được tìm thấy trên bộ gene người đến

từ nhiều quần thể (55) Thông thường, SNPs được tìm thấy trong DNA giữa các gene Chúng hoạt động như các dấu hiệu sinh học, giúp xác định vị trí các gene có liên quan đến bệnh tật Khi SNPs xảy ra trong gene hoặc trong khu vực gần gene quy định, chúng có thể đóng vai trò trực tiếp hơn trong bệnh bằng cách gây ảnh hưởng tới chức năng gene

Hầu hết SNPs không ảnh hưởng đến sức khỏe hoặc sự phát triển của vật chủ Tuy nhiên, một số SNPs đã được chứng minh là có vai trò quan trọng trong việc nghiên cứu về sức khỏe con người Ví dụ, rs6311 và rs6313 là các SNP trong gene thụ thể Serotonin 5-HT2A trên nhiễm sắc thể số 13 của người (56); một SNP trong gene F5 là nguyên nhân gây ra huyết khối yếu tố V Leiden (57); rs148649884 và rs138055828 là hai SNP trong gene FCN1 mã hóa cho M-ficolin làm tê liệt khả năng liên kết phối tử của M-ficolin tái tổ hợp (58); một SNP ở vùng không mã hóa của APOC3 (gene apolipoprotein C3) liên quan nguy cơ làm tăng triglyceride máu và xơ vữa động mạch (59);…Ngoài ra, các nhà nghiên cứu đã tìm thấy SNPs có thể giúp dự đoán một số phản ứng của cá nhân với một số loại thuốc nhất định Mặt khác, SNPs có thể bị ảnh hưởng từ các yếu tố môi trường như độc tố và nguy cơ phát triển các bệnh cụ thể SNPs cũng có thể được sử dụng để theo dõi sự di truyền của các gene bệnh trong gia đình (60) Vì vậy, nghiên cứu SNPs là hướng nghiên cứu triển vọng và mang tính chiến lược để xây dựng càng hoàn thiện cơ sở dữ liệu về bộ gene của người và sinh vật, đem lại các hướng phát triển mới cho nghiên cứu về di truyền bệnh

4 GENE LMP1

4.1 Đặc điểm cấu tạo và chức năng của gene LMP1

Latent membrane protein 1 (LMP1) là protein đầu tiên từ EBV có đặc tính gây ung

thư được chứng minh bằng thực nghiệm (61) Nó được phát hiện ở hầu hết các bệnh và khối u ác tính liên quan đến EBV, góp phần quan trọng vào sinh bệnh học và kiểu hình bệnh

LMP1 là một protein màng nguyên phân gồm 386 amino acid và có thể được chia

thành ba miền: 1) đầu N tế bào chất ngắn (amino acid 1 đến 23); 2) sáu màng xoắn alpha có tính chất kỵ nước (amino acid 24 đến 186); và 3) đuôi C tế bào chất dài (amino acid

187 đến 386), với vùng này có hoạt động báo hiệu LMP1 cao nhất Do đó, đuôi C tế bào

chất dài có hai miền chức năng riêng biệt: vùng kích hoạt đầu cuối C1 và C2 (CTAR1/ 2) (62, 63)

Hình 1.12 Sơ đồ biểu diễn sự tương tác của các phân tử và đường dẫn tín hiệu của

gene LMP1 (64)

Chú thích: LMP1 có một đầu N tế bào chất ngắn, sáu đoạn xuyên màng tạo ra sự kết tụ và oligome hóa ở màng plasma, đuôi C tế bào chất dài chứa hai miền chức năng riêng biệt là CTAR1 (aa 194-232) và CTAR2 (aa 351-386) CTAR1 rất cần thiết cho quá trình bất tử tế bào B qua trung gian EBV, nó liên kết TRAF1, TRAF2, TRAF3 và TRAF5 thông qua mô-đun P204xQ206xxD209 và kích hoạt các đường dẫn tín hiệu NF-κB và p38 CTAR2 hỗ trợ sự tăng trưởng kéo dài của các tế bào B bất tử và nhận TradD thông qua mô-đun YYD386 để kích hoạt các tín hiệu xuôi dòng, chẳng hạn như NFκB, JNK và p38 Ngoài ra, cả hai miền ở đuôi C của LMP1 cũng làm trung gian cho việc kích hoạt đường

dẫn JAK/STAT Các miền xuyên màng của LMP1 chịu trách nhiệm kích hoạt các tiểu GTPase CDC42 dẫn đến thay đổi tế bào học (64)

Gene LMP1 cho thấy tiềm năng nghiên cứu cao của nó trong ung thư vòm họng và

EBV thông qua việc phá hủy các con đường truyền tín hiệu tế bào dẫn đến sự tăng sinh tế bào đích và ức chế, lật đổ đồng thời các chương trình chết của tế bào (apoptosis ) Mặt

khác, ngoài việc biến đổi và bất tử tế bào LMP1 còn có nhiều vai trò quan trọng khác Chẳng hạn, LMP1 cảm ứng cytokine và chemokine, điều chỉnh miễn dịch, thay đổi hoàn

toàn các kiểu biểu hiện gene và microRNA để điều chỉnh sự hình thành khối u, tiếp xúc

với tế bào, di chuyển tế bào và thúc đẩy sự phát triển của tế bào khối u LMP1 biểu hiện

trên bề mặt tế bào, ở đây nó tập hợp tạo thành một thụ thể, bằng cách hoạt động như một

thụ thể kích hoạt cấu thành, LMP1 nhận các phân tử tín hiệu tế bào liên quan đến thụ thể

yếu tố hoại tử khối u như TRAF và TradD để mô phỏng các tín hiệu của thụ thể CD40

bị nhiễm trùng, điều này cho phép LMP1 gây ảnh hưởng đến tế bào thông qua tương tác với các phân tử tế bào khác nhau liên quan đến mỗi tầng tín hiệu nội bào LMP1 cũng

kích hoạt các protein kinase hoạt hóa NF-κB, mitogen (MAPK), phosphatidylinositol kinase (PI3-K), IRF7 và STAT (65) Khái quát lại toàn bộ các vấn đề trên, sự tham gia

3-của LMP1 trong cơ chế bệnh sinh 3-của UTVH (66, 67), bao gồm các yếu tố sau: 1) ức chế

apoptosis trong các tế bào bị nhiễm bằng cách điều hòa các gene Bcl-2, Mcl-1, Bfl-1, A20 và cIAPs (68-72); 2) điều biến hình thái và hoạt động của các tế bào biểu mô (73); 3) điều chỉnh giảm tác dụng của một số chất ức chế di căn (74); 4) thúc đẩy sự hình thành mạch (75); và 5) gây ra sự biểu hiện của các cytokine tiền viêm và một số các cơ chế khác (75, 76)

4.2 Đa hình LMP1

Gene LMP1 đã được chứng minh là có đa hình Trong đó, một trong những đa hình

tiêu biểu là sự xuất hiện của biến thể xóa 10 amino acid hoặc xóa 30-bp (30-bp deletion, còn gọi tắt là 30-bp del), biến thể này đã được báo cáo là chiếm ưu thế trong sinh thiết của UTVH Đa hình này đã được nghiên cứu và xác định rằng việc xóa 30-bp này xảy

ra ở gần cuối đuôi C tế bào chất, gần với chức năng miền CTAR2, điều này dẫn đến sự tăng hoạt động gây ung thư của các tế bào bị nhiễm bệnh và hình thành kiểu hình tích cực hơn cho các khối u liên quan đến EBV (77, 78) Ngoài ra, một đột biến khác được

quan sát thấy trong gene LMP1, mặc dù là đột biến điểm, xảy ra ở vị trí nucleotide từ

169423 đến 169428, dẫn đến mất một vị trí hạn chế được gọi là XhoI-loss, xuất hiện ở đầu N tế bào chất, thuộc exon 1 Tính đa hình XhoI-loss thường được tìm thấy trong các mẫu từ bệnh nhân mắc UTVH nhưng không có trong các mẫu từ người khỏe mạnh (19, 79)

Hầu hết các gene LMP1 có nguồn gốc từ sinh thiết UTVH của Trung Quốc được

đánh dấu bằng đa hình xóa mười amino acid (aa 346-355) hoặc xóa 30-bp 168,256 nt) trong đoạn cuối của đuôi carboxyl và nhiều đột biến cơ sở trong khu vực mã hóa (79-82) 30-bp del được phát hiện trong 100% trong số 48 sinh thiết UTVH ở Đài Loan (82), trong 34 trường hợp của 37 sinh thiết UTVH ở Hồng Kông (83), và 16 trường hợp của 21 sinh thiết UTVH ở Quảng Tây và Thượng Hải (84) Trong một nghiên cứu lớn hơn, 30-bp del đã được tìm thấy trong 86% của 187 trường hợp sinh thiết UTVH ở châu Á (85) Những kết quả này cho thấy sự liên kết giữa UTVH và sự hiện diện của 30-

(168,287-bp del của gene LMP1 Hơn nữa, các nghiên cứu khác tiết lộ rằng 30-(168,287-bp del có khả năng

thành lập biến đổi các nguyên bào sợi của loài gặm nhấm và bất tử các tế bào keratinocyte của con người trong ống nghiệm (77, 86) Ngoài ra, nó còn có khả năng gây miễn dịch yếu hơn cho phép các tế bào khối u thoát khỏi sự giám sát miễn dịch (87) Theo nghiên cứu của Zhang và cộng sự (2002), đa hình 30-bp del được tìm thấy ở khu vực đặc hữu UTVH là Quảng Châu và khu vực không đặc hữu UTVH là Haerbin cho kết quả tương tự nhau, điều này chứng minh được 30-bp del đại diện cho bệnh UTVH đa hình liên quan đến địa lý thay vì bệnh UTVH đa hình liên quan đến kiểu hình bệnh (88)

Đối với việc xóa 30-bp trong đầu cuối carboxyl, mối liên hệ của nó với hoạt động

gây ung thư của gene LMP1 vẫn còn gây tranh cãi Việc xóa này dẫn đến mất một đoạn

30 nucleotide, vị trí này có liên quan đến vị trí bộ chuyển đổi 2 (TES2) (codon 352 đến

386) Li và cộng sự (1996) đã báo cáo rằng việc xóa chuỗi 30-bp này của gene LMP1

trong chủng B95-8 gây chuyển đổi gene từ không gây ung thư thành gây ung thư và khi

chèn chuỗi 30-bp này vào LMP1 của chủng C1510 sẽ loại bỏ khả năng biến đổi Tuy nhiên, chimerae của gene LMP1 chủng Cao và B95-8 hoặc chimerae của gene LMP1

chủng C15 và B95-8 khi được trao đổi (trong đó gồm các tên miền carboxyl hoặc 2) lại không thể chứng minh rằng việc xóa 30-bp chịu trách nhiệm cho sự biến đổi chức

CTAR-năng trong các gene LMP1 (77) Mặc khác, đột biến xóa 30-bp đã được tìm thấy trong

bệnh Hodgkin (HD) (89), các trường hợp HD liên quan đến suy giảm miễn dịch ở người (90); Bệnh bạch huyết sau ghép gan của Malaysia và Đan Mạch (PTL) (89); u lympho T /tế bào NK (nature killer) (91); ung thư hạch Burkitt và bệnh không Hodgkin (92) Việc xóa 30-bp cũng đã được chứng minh dẫn đến một kiểu hình tích cực hơn của bệnh

lymphoproliferative liên quan đến EBV và u lympho trong in vivo (78)

XhoI-loss là đột biến thay thế xảy ra ở codon 17 làm thay đổi amino acid R (Arg) thành L (Leu) hoặc codon 18 làm thay đổi amino acid G (Gly) thành R (Arg) thuộc exon

1 của LMP1, vị trí này thường nằm ở nucleotide từ 169423 đến 169428 trên trình tự của

chủng B98-5, nhưng sự thay đổi phổ biến là ở vị trí 169425 từ G thành T (93) Các đa hình XhoI-loss có mặt trong tất cả các mẫu UTVH từ Alaska và trong một số mẫu UTVH từ người Mỹ da trắng nhưng lại vắng mặt trong mẫu UTVH của người châu Phi và người khỏe mạnh (19, 94) Trong các chủng EBV được nghiên cứu kỹ là CAO và C1510, những biến thể này được thể hiện rõ (79, 80) Có ý kiến cho rằng, những biến thể này ở cả hai chủng CAO và C1510 có liên quan đến việc tăng độc tính khối u ở SCID và chuột nude (95) Ngoài ra, các đa hình XhoI-loss đã được tìm thấy ở các chủng EBV ở HD (96), u lympho tế bào T, u mũi ngoại vi (NPTL) và bạch cầu đơn nhân nhiễm trùng (IM) (97) Sự hiện diện của biến thể XhoI-loss chiếm 97-100% trường hợp UTVH ở miền Nam Trung Quốc và Đài Loan (19, 98) Việc mất một vị trí cắt giới hạn XhoI có liên quan đến UTVH Trung Quốc được coi là một dấu ấn khối u cụ thể trong sinh thiết UTVH và mẫu

rửa họng (79, 80, 82, 99) Tuy nhiên, cho đến nay, có rất ít thông tin về hiệu quả biến đổi ác tính của biến thể này

Theo nghiên cứu của Hui Shien See và cộng sự (2008), cho thấy rằng các biến thể xóa 30-bp (30-bp deletion) và XhoI-loss được tìm thấy chủ yếu trong ung thư biểu mô không biệt hóa (loại III) so với ung thư biểu mô tế bào vảy keratin hóa (loại I) Điều này cho thấy, các biến thể có thể có một mối liên hệ quan trọng với khả năng hình thành ung thư biểu mô không biệt hóa (loại III) (93)

PHẦN II – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 VẬT LIỆU

1.1 Mẫu thí nghiệm

Các mẫu sử dụng trong nghiên cứu là mẫu sinh thiết UTVH được thu nhận từ các bệnh nhân đến khám tại phòng khám Tai – Mũi – Họng, bệnh viện Chợ Rẫy Thành phố Hồ Chí Minh Mẫu lành được thu nhận từ các tình nguyện viên được chứng nhận âm tính với UTVH là mẫu dịch phết vòm họng Các mẫu được bảo quản -20oC trong môi trường TE

Tất cả các mẫu nghiên cứu (bao gồm các mẫu sinh thiết ung thư vòm họng và mẫu lành) đều được sự đồng ý cho phép của hội đồng Y Đức- Bệnh viện Chợ Rẫy Thành phố Hồ Chí Minh: 516/BVCR-HDDD cùng sự đồng ý của bệnh nhân và các tình nguyện viên tham gia nghiên cứu

Số lượng mẫu gồm 20 mẫu sinh thiết UTVH và 20 mẫu dịch phết lành (danh sách mẫu bệnh được trình bày ở phụ lục 5)

Nghiên cứu này được thiết kế theo dạng nghiên cứu ca chứng

Cỡ mẫu nghiên cứu được tính toán dựa theo công thức tính sau:

N = Z21-α/2

Trong đó: N là cỡ mẫu nghiên cứu; Z1- α/2 là hệ số tin cậy (có giá trị là 1,96), với α bằng 0,05 (độ tin cậy 95%); d là sai số cho phép của p, được lấy là 0,1 (có nghĩa 10%);

p là tỷ lệ biến thể đa hình gene LMP1 trên bệnh nhân UTVH Đối với cỡ mẫu cho nghiên

cứu đa hình 30-bp deletion, giá trị p là 0, 97 (110), số mẫu tối thiểu tính được là 12 mẫu

Đối với cỡ mẫu cho nghiên cứu đa hình XhoI-loss, giá trị p là 0,98 (111), số mẫu tối thiểu tính được là 8 mẫu

1.2.3 Hóa chất

1.2.3.1 Hóa chất cần cho quy trình tách chiết

Tris-HCl (pH = 8) 1M, EDTA 0,5M; SDS 10%; NaCl 0,5M (đã hấp); H2O (đã hấp); Proteinase K 1 mg/ml; Phenol; Chloroform; Isoamyl acolhol; TE 1X, Ethanol 70%, Ethanol tuyệt đối; Isopropanol; NaOAc 3M

1.2.3.2 Hóa chất cần cho phản ứng PCR và điện di

Master Mix (2X), primer forward 10 μM, primer reverse 10 μM (trình tự các cặp mồi được trình bày ở bảng 2.3), H2O (đã hấp) Gel red, thang chuẩn 100bp, agarose (1,5%), TBE 1X