Đang tải... (xem toàn văn)
Trương Kim Phượng Học viên thực hiện: Nguyễn Thị Lệ Lớp: DH16YD01 Tên đề tài: Khảo sát tính chất methyl hóa bất thường và đột biến điểm trên một số gen liên quan đến bệnh ung thư vúÝ kiế
Trang 2THƯỜNG VÀ ĐỘT BIẾN ĐIỂM TRÊN MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH UNG THƯ VÚTrang 3GIẤY XÁC NHẬN Tôi tên là: Nguyễn Thị Lệ Ngày sinh: 25/07/1998 Nơi sinh:ĐăkLăk Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Y Dược Mã sinh viên: 1653010133 Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh Ký tên (Ghi rõ họ và tên) ……… Trang 4Giảng viên hướng dẫn: ThS Trương Kim Phượng Học viên thực hiện: Nguyễn Thị Lệ Lớp: DH16YD01 Tên đề tài: Khảo sát tính chất methyl hóa bất thường và đột biến điểm trên một số gen liên quan đến bệnh ung thư vúÝ kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép sinh viên được bảo vệ khóa luận trước Trang 5Trên thực tế không có sự thành công nào mà không gắn liền với những sự hỗ trợ, giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của người khác Trong suốt những năm học tại trường, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý Thầy Cô Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đối với các thầy cô khoa Công nghệ Sinh học của trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh, đặc biệt là các thầy cô chuyên ngành Công nghệ Sinh học Y dược Đặc biệt hơn nữa, em xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy và ThS Trương Kim Phượng đã hướng dẫn, dạy bảo em trong suốt thời gian vừa qua Nếu không có những lời hướng dẫn, dạy bảo của các Thầy Cô thì em nghĩ bài báo cáo này của em rất khó có thể hoàn thiện được Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn Thầy Cô đã tạo điều kiện cho em có thể học hỏi về ngành học của mình Em xin gửi lời cảm ơn đến anh (chị), bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ, chia sẻ nhiều kinh nghiệm cho em Cuối cùng, con xin cảm ơn Ba Mẹ đã sinh con ra, nuôi dưỡng, dạy bảo và cho con nhiều động lực để con có được ngày hôm nay Em xin chân thành cảm ơn! Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2020 Sinh viên Nguyễn Thị Lệ Trang 6DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT BSP ApoB CDKN2A Bisulfite sequencing-PCR Apolipopretein B Cyclin-Dependent Kinase inhibitor 2A Cis CCND2 Confidence intervals Cyclin D2 CpG Cytosine phosphate Guanine DCIS Ductal carcinoma in situ DNMTs DNA RNA DNA methyltransferases Ribonucleic acid Deoxyribonucleic acid Ribonucleic acid IDC Infiltrating ductal carcinoma LCIS LOVD Lobular carcinoma in situ Leiden Open Variation Database MSP Methylation-specific PCR NCBI NCI National Center for Biotechnology Information National Cancer Institute Nested-MSP Nested Methylation – specific PCR MTHFR Methylenetetrahydrofolate reductase OR Odds Ratio PCR Polymerase Chain Reaction QMSP Quantiative Methylation specific Polymerase chain reation RR Relative Risk RT-PCR Real time _ Polymerase Chain Reaction SAM SAH S-adenyl methionine S-adenosylhomocysteine SNP Single nucleotide polymorphism WHO ILC HER2 World Health Organization Invasive Lobular Carcinoma Human Epidermal growth factor Receptor 2 Trang 75Mc MS-HRM MS-MLPA 5-methylcytosine Methylation-sensitive high-resolution melting Methylation-specific multiplex ligation dependent probe amplification Trang 8DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR với bộ mồi Nested - MSP nhằm xác định tính chất methyl hóa trên gen mục tiêu 33 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR với bộ mồi F,R nhằm xác định tính chất đột biến điểm trên gen mục tiêu 34 Bảng 3.1 Bộ dữ liệu khoa học phân tích tính chất methyl hóa đối với bệnh ung thu vú 37 Bảng 3.2 Tỷ lệ methyl hóa các gen trên bộ mẫu ung thư vú và bộ mẫu hứng 39 Bảng 3.3 Đặc điểm của bộ dữ liệu 17 nghiên cứu ca - chứng về tính chất Methyl hóa vượt mức vùng promoter gen CCND2 40 Bảng 3.4.Chỉ số OR phản ánh mức độ methyl hóa vượt mức vùng promoter gen CCND2 thuộc 17 nghiên cứu ca - chứng 42 Bảng 3.5 Chỉ số OR phản ánh mức độ methyl hóa vượt mức vùng promoter gen CCND2 thuộc 14 nghiên cứu ca - chứng 43 Bảng 3.6 Đặc điểm của bộ dữ liệu 14 nghiên cứu ca - chứng về sự methyl hóa vượt mức vùng promoter gen CDKN2A 45 Bảng 3.7 Chỉ số OR phản ánh mức độ methyl hóa vượt mức vùng promoter gen CDKN2A thuộc 14 nghiên cứu ca - chứng 46 Bảng 3.8 Chỉ số OR phản ánh mức độ methyl hóa vượt mức vùng promoter gen CDKN2A thuộc 14 nghiên cứu ca - chứng 48 Bảng 3.9 Tính chất methyl hóa vượt mức vùng promoter gen CCND2 trên bệnh ung thư vú, thuộc 17 nghiên cứu ca - chứng 50 Bảng 3.10 Tính chất methyl hóa vượt mức vùng promoter gen CDKN2A trên bệnh ung thư vú, thuộc 14 nghiên cứu ca - chứng 51 Trang 9Bảng 3.11 Bộ dữ liệu khoa học phân tích tính chất đột biến điểm trên exon 26 gen ApoB và exon 8 gen MTHFR 56 Bảng 3.12 Đặc điểm của 23 nghiên cứu ca – chứng về tính chất biến thể A1298C trên gen MTHFR 57 Bảng 3.13 Tỷ lệ xuất hiện biến thể A1298C trên exon 8 gen MTHFR trong bộ mẫu ung thư vú 60 Bảng 3.14 Tỷ lệ xuất hiện biến thể A1298C trên exon 8 gen MTHFR trong bộ mẫu chứng 61 Bảng 3.15 Chỉ số OR về sự xuất hiện biến thể A1298C gen MTHFR trên bộ mẫu bệnh phẩm so với bộ mẫu chứng, thuộc 23 công bố ca - chứng 62 Bảng 3.16 Thông tin đảo CpG trên vùng trình tự promoter gen mục tiêu 64 Bảng 3.17 Thông tin bộ mồi, vị trí bắt cặp của bộ mồi Nested - MSP xác định tính chất methyl hóa trên trình tự promoter gen mục tiêu 69 Bảng 3.18 Thông số vật lý của bộ mồi đặc hiệu trênvùng promoter gen mục tiêu 70 Bảng 3.19 Thông tin bộ mồi, vị trí bắt cặp của bộ mồi PCR xác định tính chất đột biến điểm trên gen mục tiêu 73 Bảng 3.20 Thông số vật lý của bộ mồi đặc hiệu trên vùng promoter gen mục tiêu 74 Bảng 3.21 Tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen CCND2 trên các mẫu sinh thiết mô ung thư vú 78 Bảng 3.22 Phân tích tính chất methyl hóa vùng promoter gen CCND2 thuộc các mẫu sinh thiết mô ung thư vú 79 Bảng 3.23 Tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen CDKN2A thuộc các mẫu sinh thiết mô ung thư vú 82 Bảng 3.24 Phân tích tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen CDKN2A thuộc các mẫu sinh thiết mô ung thư vú 83 Trang 10Bảng 3.25 Đặc điểm biến thể xuất hiện trên exon 26 gen ApoB, thuộc các mẫu sinh thiết mô ung thư vú 86 Bảng 3.26 Đặc điểm biến thể xuất hiện trên exon 8 gen MTHFR, thuộc các mẫu sinh thiết mô ung thư vú 89 Bảng 3.27 Tổng hợp kết quả nghiên cứu thuộc các mẫu sinh thiết mô ung thư vú 91 Trang 11DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Tình hình ung thư trên thế giới 4 Hình 1.2 Sự methyl hóa DNA 7 Hình 1.3 Sự methyl hóa DNA và sự biểu hiện gen 8 Hình 1.4 Đột biến đồng hoán – dị hoán 9 Hình 1.5 Đột biến thêm/mất cặp base 10 Hình 1.6 Dạng biến thể - SNP: thay thế G-C thành A – T 10 Hình 1.7 Định vị gen CCND2 trên nhiễm sắc thể số 12 11 Hình 1.8 Định vị gen CDKN2A trên nhiễm sắc thể số 9 12 Hình 1.9 Con đường truyền tín hiệu cyclin D - CDK4/6 - INK4 – Rb 14 Hình 1.10 Định vị gen ApoB trên nhiễm sắc thể 2 15 Hình 1.11 Định vị gen MTHFR trên nhiễm sắc thể số 1 17 Hình 2.1 Quy trình chọn lọc bài báo trong phân tích tổng hợp 28 Hình 2.2 Quy trình khảo sát thực nghiệm 30 Hình 2.3 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng Nested – MSP 34 Hình 2.4 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng PCR 35 Hình 3.1 Đồ thị “Forest plot” về chỉ số OR phản ánh mức độ methyl hóa vượt mức vùng promoter gen CCND2 thuộc 17 nghiên cứu ca- chứng 42 Hình 3.2 Đồ thị “Funnel plot” đánh giá tính thiên vị chỉ số OR phản ánh mức độ methyl hóa vượt mức vùng promoter gen CCND2 thuộc 17 nghiên cứu ca - chứng 43 Hình 3.3 Đồ thị “Forest plot” về chỉ số OR phản ánh mức độ methyl hóa vượt mức vùng promoter gen CCND2 thuộc 10 nghiên cứu ca- chứng 44 Hình 3.4 Đồ thị “Funnel plot” đánh giá tính thiên vị chỉ số OR phản ánh mức độ methyl hóa vượt mức vùng promoter gen CCND2 thuộc 10 nghiên cứu ca - chứng 44 Trang 12Hình 3.5 Đồ thị “Forest plot” về chỉ số OR phản ánh mức độ methyl hóa vượt mức vùng promoter gen CDKN2A thuộc 14 nghiên cứu ca - chứng 46 Hình 3.6 Đồ thị “Funnel plot” đánh giá tính thiên vị chỉ số OR phản ánh mức độ methyl hóa vượt mức vùng promoter gen CDKN2A thuộc 14 nghiên cứu ca- chứng 47 Hình 3.7 Đồ thị “Forest plot” về chỉ số OR phản ánh mức độ methyl hóa vượt mức vùng promoter gen CDKN2A thuộc 8 nghiên cứu ca- chứng 48 Hình 3.8 Đồ thị “Funnel plot” đánh giá tính thiên vị chỉ số OR phản ánh mức độ methyl hóa vượt mức vùng promoter gen CDKN2A thuộc 8 nghiên cứu ca- chứng 49 Hình 3.9 Định vị vùng promoter trên gen CCND2 66 Hình 3.10 Vị trí hoạt động của cặp mồi Nested - MSP trên gen CCND2 66 Hình 3.11 Định vị vùng promoter trên gen CDKN2A 67 Hình 3.12 Vị trí hoạt động của cặp mồi Nested - MSP trên gen CDKN2A 67 Hình 3.13 Vị trí đảo CpG trên vùng promoter gen CCND2 68 Hình 3.14 Vị trí đảo CpG trên vùng promoter gen CDKN2A 68 Hình 3.15 Định vị exon 26 gen ApoB trên nhiễm sắc thể số 2 72 Hình 3.16 Định vị exon 8 gen MTHFR trên nhiễm sắc thể số 1 72 Hình 3.17 Kết quả phân tích sự bắt cặp của cặp mồi ApoB_F&ApoB_R với trình tự exon 26 gen ApoB bằng phần mềm Annhyb 75 Hình 3.18 Kết quả phân tích sự bắt cặp của cặp mồi MTHFR_F&MTHFR_R với trình tự exon 8 gen MTHFR bằng phần mềm Annhyb 75 Hình 3.19 Vị trí hoạt động của cặp mồi ApoB_F&ApoB_R trên exon 26 gen ApoB 76 Hình 3.20 Vị trí hoạt động của cặp mồi MTHFR_F&MTHFR_R trên exon 8 gen MTHFR 76 Hình 3.21 Kết quả điện di sản phẩm Nested – MSP trên gen CCND2 thuộc các mẫu sinh thiết mô ung thư vú đại diện 78 Hình 3.22 Kết quả điện di sản phẩm Nested – MSP trên gen CDKN2A thuộc các mẫu sinh thiết mô ung thư vú đại diện 82 Trang 13Hình 3.23 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại exon 26 gen ApoB thuộc các mẫu sinh thiết mô ung thư vú đại diện 85 Hình 3.24 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại exon 8 gen MTHFR thuộc các mẫu sinh thiết mô ung thư vú đại diện 86 Hình 3.25 Dạng đột biến c.10497T>A xuất hiện trên mẫu T1 88 Hình 3.26 Dạng đột biến c.10514 T>A xuất hiện trên mẫu T1 88 Hình 3.27 Dạng đột biến c.1286 A>C xuất hiện trên mẫu T7 90 Hình 3.28 Dạng đột biến c.1305 C>T xuất hiện trên mẫu T7 91 Trang 141.2 Phân loại ung thư vú 5 1.3 Nguyên nhân và các yếu tố nguy cơ 6 1.8 Dấu chứng sinh học (Biomarker) 11 1.9 Tổng quan về các gen mục tiêu 11 1.9.1 Nhóm gen ức chế khối u 11 1.9.2 Nhóm gen ApoB và MTHFR 14 1.10 Tình hình nghiên cứu các gen mục tiêu trên bệnh ung thư vú 18 1.10.1 Nghiên cứu trên gen CCND2 và CDKN2A 18 1.10.2 Nghiên cứu trên các gen ApoB và MTHFR 18 1.11 Phương pháp phân tích tổng hợp (Meta-analysis) 20 1.12 Phương pháp phân tích tính chất methyl hóa DNA 22 1.12.1 Phương pháp BSP (Bisulfite sequencing - PCR) 22 1.12.3 Phương pháp Nested - MSP 23 1.13 Phương pháp xác định tính chất đột biến điểm 23 PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 4 2.1 Vật liệu nghiên cứu 25 2.1.1 Công cụ tin sinh học 25 2.1.2 Mẫu thí nghiệm 25 2.1.3 Dụng cụ - thiết bị - hóa chất 25 Trang 152.2 Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Khai thác dữ liệu (Data mining) 26 2.2.2 Phân tích tổng hợp (Meta - analysis) 27 2.3 Khảo sát trên máy tính (In insilico) gen mục tiêu 29 2.4 Khảo sát thực nghiệm 30 2.4.1 Tách chiết DNA bộ gen 30 2.4.2 Kiểm tra chất lượng DNA bộ gen bằng phương pháp đo quang phổ 32 2.4.3 Biến đổi DNA bằng sodium bisulfite với bộ kit EZ DNA Methylation – GoldTM 32 PHẦN 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Phân tích tổng hợp về tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen CCND2 và CDKN2A, đối với bệnh ung thư vú 37 3.1.1 Tỷ lệ methyl hóa gen mục tiêu trong bộ mẫu ung thư vú và bộ mẫu chứng 38 3.1.2 Chỉ số OR về khả năng xuất hiện tính chất methyl hóa trên gen mục tiêu trong bộ mẫu ung thư vú và bộ mẫu chứng 39 3.1.3 Chỉ số OR về khả năng xuất hiện tính chất methyl hóa trên gen mục tiêu trên một số phân hạng trong bộ mẫu ung thư vú và bộ mẫu chứng 49 3.2 Phân tích tổng hợp về tính chất đột biến điểm trên gen ApoB (exon 26) và gen MTHFR (exon 8), đối với bệnh ung thư vú 55 3.3 Kết quả khảo sát trên máy tính 63 Trang 161 ĐẶT VẤN ĐỀ Theo số liệu thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization - WHO, 2018), ung thư vú đứng vị trí thứ hai trong nhóm bệnh lý ung thư thường gặp và gây tử vong cao trên thế giới [1] Theo công bố mới nhất của WHO (2018), tổng số ca mắc ung thu vú là 2,1 triệu ca và tổng số ca tử vong tương đương với 626.679 ca (30%) Ở Việt Nam, tổng số ca ung thư vú tăng lên, có khoảng 15.229 ca trong năm 2018 Việc tiên đoán, chẩn đoán sớm các bệnh lý ung thư, điển hình là bệnh ung thư vú dựa vào các yếu tố nguy cơ - dấu chứng sinh học tiềm năng là rất cần thiết trong tầm soát ung thư trên thế giới [2] Do đó, các nhà khoa học trên thế giới đã và đang triển khai hướng nghiên cứu về dấu chứng sinh học tiềm năng ứng dụng trong hướng hỗ trợ chẩn đoán sớm, tiên đoán, dự báo các bệnh lý ung thư: ung thư vú, ung thư cổ tử cung, ung thư vòm họng, … [3, 4] Trong đó, hướng nghiên cứu về tính chất methyl hóa vượt mức trên các gen có chức năng kiểm soát sự sinh học đã được triển khai, cụ thể là trên gen CCND2 và CDKN2A Bên cạnh đó, một số dạng rối loạn di truyền (đột biến điểm hoặc tính đa hình đơn nucleotide) được xem là dạng yếu tố nguy cơ thứ hai dẫn đến các bệnh ung thư, điển hình là các dạng đột biến điểm trên một số gen chức năng được tìm thấy trong khoảng 5% - 30% các ca ung thư vú [5] Cùng với tính chất methyl hóa cao bất thường trên các gen kiểm soát sự sinh ung, các dạng biến thể (đột biến điểm) xuất hiện trên một số gen có chức năng chuyển hóa nội bào - gen ApoB và gen MTHFR đang được các nhà khoa học quan tâm, khảo sát để xác định dấu chứng sinh học tiềm năng để hỗ trợ chẩn đoán sớm, tiên đoán ung thư vú [6, 7] Gen CCND2 (Cyclin D2) mã hóa protein cyclin D2 tham gia vào cơ chế kiểm soát chu trình tế bào tại giai đoạn chuyển pha từ G1 đến pha S [8] CCND2 liên kết với CDK4 hoặc CDK6 tạo thành phức hợp xúc tác dẫn đến sự phosphoryl hóa protein ức chế khối u Rb [8] Công trình nghiên cứu của Truong và cộng sự (2015) xác định tỷ lệ methyl hóa gen CCND2 là 62% trên tổng số 95 mẫu bệnh phẩm ung thư vú của người Việt Nam [9] Gen CDKN2A (Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A, p16INK4a) Trang 172 mã hóa protein p16INK4a tham gia vào cơ chế kiểm soát chu trình tế bào, tại giai đoạn chuyển từ pha G1 đến pha S [10] CDKN2Aliên kết với CDK4/6, tạo thành phức hợp xúc tác dẫn đến sự phosphoryl hóa protein retinoblastoma (pRb) và dẫn đến bất hoạt chức năng pRb [10, 11] Công bố khoa học của Wu và cộng sự (2016) xác định tỷ lệ methyl hóa gen CDKN2A là 40% trên tổng số 70 mẫu bệnh phẩm ung thư vú của người Trung Quốc [12] Gen ApoB (Apolipopretein B) mã hóa glycoprotein có chức năng chính trong quá trình chuyển hóa lipoprotein ở người [13] Sự liên quan của Apolipoprotein (APO) trong bệnh tim mạch đã được chứng minh trên nhiều nghiên cứu, nhưng đối với bệnh ung thư chỉ được ghi nhận trong một vài nghiên cứu gần đây [6, 14] Tuy nhiên, công bố khoa học của Liu và cộng sự (2013) đã chỉ ra rằng thể đa hình nucleotide đơn (SNP) của rs1042031 (exon 29) và rs693 (exon 26) thuộc gen ApoB có khả năng xuất hiện trong mẫu ung thư vú cao hơn đáng kể so với các mẫu chứng, điều này cho thấy các biến thể này làm tăng nguy cơ ung thư vú ở người Trung Quốc [6] Gen MTHFR (Methylenetetrahydrofolate reductase) mã hóa enzyme MTHFR, đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa, tổng hợp nucleotide, homocyteine và methyl hóa nội bào [15, 16] Một số nghiên cứu đã tìm thấy mối liên quan giữa đa hình C677T và A1298C trên gen MTHFR với sự gia tăng nguy cơ sinh ung ở một số bộ phận khác nhau trong cơ thể: tuyến tụy, thực quản, dạ dày, đại tràng, phổi và vú [16, 17, 18, 19, 20] Tiếp nối hướng nghiên cứu về dấu chứng sinh học tiềm năng trong tiên lượng, chẩn đoán sớm một số bệnh ung thư, cụ thể là bệnh ung thư vú và với định hướng khảo sát tính chất methyl hóa và tính chất đột biến điểm trên một số gen liên quan đến bệnh ung thư vú, chuyên đề khóa luận tốt nghiệp được thực hiện: “Khảo sát tính chất methyl hóa bất thường và đột biến điểm trên một số gen liên quan đến bệnh ung thư vú” Trang 183 Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát tính chất methyl hóa bất thường (vượt mức) trên vùng promoter gen kiểm soát sự sinh ung: CCND2, CDKN2A và tính chất đột biến điểm trên gen ApoB (exon 26) và gen MTHFR (exon 8) đối với bệnh ung thư vú trên thế giới và Việt Nam Nội dung nghiên cứu − Phân tích tổng hợp: (1) Xác định chỉ số tỷ suất chênh (Odds Ratio, OR) và Proportion về khả năng xuất hiện tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen CCND2 và CDKN2A trong bộ mẫu ung thư vú và bộ mẫu chứng (không phải ung thư vú hoặc của người khỏe mạnh) dựa trên các công bố ca – chứng (case – control study) trên thế giới và Việt Nam, cập nhật dữ liệu đến tháng 07/2020 (2) Xác định chỉ số tỷ suất chênh (Odds Ratio, OR) và Proportion về khả năng xuất hiện đột biến điểm trên gen MTHFR trong bộ mẫu ung thư vú và bộ mẫu chứng (không phải ung thư vú hoặc của người khỏe mạnh) dựa trên các công bố ca – chứng (case – control study) trên thế giới và Việt Nam, cập nhật dữ liệu đến tháng 07/2020 − Khảo sát trên máy tính: cập nhật thông tin bộ dữ liệu, khảo sát các bộ mồi phù hợp với (1) Quy trình Nested – MSP xác định tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen CCND2 và CDKN2A (2) PCR - kết hợp giải trình tự xác định tính chất đột biến điểm trên exon 26 gen ApoB và exon 8 gen MTHFR − Khảo sát thực nghiệm: (1) Thực hiện quy trình Nested – MSP để xác định tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen CCND2 và CDKN2A đối với một số mẫu bệnh phẩm (mẫu mô vú) của người Việt Nam (2) Thực hiện phản ứng PCR kết hợp giải trình tự để xác định tính chất đột biến điểm trên gen ApoB và MTHFR đối với một số mẫu bệnh phẩm (mẫu mô vú) của người Việt Nam Trang 20PHẦN 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Khái quát 1.1.1 Tình hình bệnh ung thư vú Theo báo cáo của WHO, ung thư là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới Theo thống kê của Globocan năm 2018, số ca ung thư mắc mới trên thế giới ước tính có khoảng 18 triệu ca, trong đó tổng số ca tử vong khoảng 9,6 triệu ca (hình 1.1) [1] Hình 1.1 Tình hình ung thư trên thế giới Theo số liệu thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization – WHO, 2018), ung thư vú xếp vị trí thứ hai trong nhóm bệnh lý ung thư thường gặp và gây tử vong cao trên thế giới [1] Theo công bố của WHO (2018), tổng số trường hợp mắc ung thư vú là 2,1 triệu người trong đó số ca tử vong là 626.679 ca (30%) Ở Việt Nam, số ca mắc ung thư mới đã tăng lên 165.000 ca trong đó có khoảng 15.229 ca mắc ung thư vú mới được phát hiện (WHO, 2018) 1.1.2 Ung thư vú Theo WHO (2018), ung thư là thuật ngữ chung đề cập đến nhóm bệnh lý liên quan đến sự phân chia tế bào một cách bất thường và mất kiểm soát Các tế bào ung thư có khả năng di chuyển, xâm lấn đến các cơ quan khác dựa vào cơ chế sinh mạch (hệ bạch huyết và mạch máu), tiến trình này gọi là di căn [21] Ung thư vú là tình trạng tăng trưởng thất thường và tăng sinh của các tế bào có nguồn gốc từ mô vú, khởi phát Trang 21từ sự tăng trưởng mất kiểm soát của tế bào biểu mô thuộc ống dẫn sữa hoặc các thùy tuyến vú [22] 1.2 Phân loại ung thư vú Các dạng ung thư vú hiện nay bao gồm: ung thư vú không xâm lấn (Non - Invasive Breast Cancer) trong đó có ung thư biểu mô tiểu thùy tại chỗ (Lobular carcinoma in situ - LCIS) và ung thư biểu mô ống tại chỗ (Ductal carcinoma in situ - DCIS); ung thư vú xâm lấn (Invasive Breast Cancer); ung thư biểu mô tiểu thùy xâm lấn (Invasive Lobular Carcinoma - ILC); ung thư biểu mô ống xâm lấn (Infiltrating ductal carcinoma - IDC) [22] Ngoài ra, một số dạng ung thư hiếm gặp như là ung thư biểu mô tủy (Medullary carcinoma), ung thư biểu mô đột biến (Mutinous carcinoma), ung thư biểu mô ống (Tubular carcinoma), ung thư vú dạng viêm (Inflammatory breast cancer), bệnh Paget của núm vú (Paget’s disease of the nipple), bướu diệp thể vú (Phyllodes tumor) [22] Trong các dạng ung thư kể trên, ung thư biểu mô ống tại chỗ (Ductal carcinoma in situ - DCIS) và ung thư biểu mô tiểu thùy tại chỗ (Lobular carcinoma in situ - LCIS) là các dạng ung thư vú thường gặp [22, 23] Các yếu tố tiên lượng bệnh thường được xét đến khi đánh giá loại ung thư này là độ tuổi, tình trạng di căn hạch bạch huyết, kích thước khối u, đặc tính mô học, tình trạng thụ thể hormon và tình trạng HER2 (Human Epidermal growth factor Receptor 2) [23, 24] Do một số hạn chế của các công cụ phân loại ung thư vú hiện có, trong hơn một thập kỉ qua các nhà khoa học đã và đang tiếp cận hướng nghiên cứu phát triển công cụ phát hiện, chẩn đoán, đánh giá tình trạng bệnh, phân loại bệnh [23, 25] Điển hình là hướng phát triển công cụ sinh học phân tử trên nền tảng về mức độ biểu hiện gen [23, 25] Năm 2011, tại hội nghị quốc tế “St Gallen” về ung thư vú, các chuyên gia đã đưa ra quyết định phân loại ung thư vú theo phương pháp phân loại phân tử dựa trên biểu hiện gen, ung thư vú được chia thành các nhóm: nhóm Luminal A với dấu hiệu lâm sàng là ER+ và/hoặc PR+, HER2-, mức độ biểu hiện Ki67 thấp (<14%); nhóm Luminal B với dấu hiệu lâm sàng là ER+ và/hoặc PR+, HER2-, mức độ biểu hiện Ki67 cao (>14%) và ER+ và/hoặc PR+, HER2+, bất kể mức độ biểu hiện Ki67 như Trang 22thế nào; nhóm HER2 biểu hiện quá mức với dấu hiệu lâm sàng ER- và PR-, HER2+; nhóm Basal-like với dấu hiệu lâm sàng ER- và PR-, HER2- [23, 26] 1.3 Nguyên nhân và các yếu tố nguy cơ Nhiều yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thư vú đã được ghi nhận: những biến đổi bất thường về di truyền, rối loạn về nội tiết tố, yếu tố môi trường hoặc do các thói quen sống và chế độ ăn uống không lành mạnh: lối sống ít vận động, chế độ ăn uống mất cân bằng dinh dưỡng, sử dụng thực phẩm nhiều chất béo, đồ uống có cồn [22, 27, 28] Sự thay đổi trong di truyền đóng một vai trò quan trọng trong sự khởi đầu và tiến triển của bệnh ung thư [29] Các yếu tố di truyền gồm: epigenetics, đột biến và tính đa hình nucleotide đơn (SNP) [29] 1.4 Epigenetics Epigenetics là thuật ngữ chỉ những biến đổi trong cơ chế di truyền, liên quan đến sự biểu hiện gen mà không làm thay đổi trình tự DNA của bộ gen và dẫn đến sự sửa đổi có thể được truyền đến các thế hệ tế bào con [30] Epigenetics gồm các cơ chế sinh học như sau: methyl hóa DNA (DNA methylation), biến đổi histone, sắp xếp lại/tái cấu trúc nucleosome và RNA không mã hóa cụ thể là microRNA [31, 32] Các cơ chế này tương tác với nhau và tuân theo sự phối hợp phân tử chính xác để duy trì hoặc thay đổi các dấu hiệu epigenetics trong bộ gen Đây là mấu chốt để duy trì sự biệt hóa, tăng trưởng và cân bằng tế bào [33] Các cơ chế này liên quan đến sự bất hoạt hoặc kích hoạt sự phiên mã gen chức năng hoặc phóng bế sự sinh tổng hợp protein, [34] Hiện nay, đã có một số dẫn chứng khoa học về mối liên kết giữa epigegetics và một loạt các loại bệnh lý ở người: ung thư, các bệnh về hô hấp, tim mạch, sinh sản, tự miễn và bệnh thần kinh [30] Nguyên nhân được biết đến hoặc nghi ngờ (ẩn đằng sau) sự rối loạn hoạt động của gen, cụ thể là các dạng rối loạn epigenetics bao gồm: kim loại nặng, thuốc trừ sâu, khí thải diesel, khói thuốc lá, hydrocacrbon thơm đa vòng, hormone, phóng xạ, virus, vi khuẩn, [30] Trang 231.5 Sự methyl hóa DNA (DNA methylation) 1.5.1 Định nghĩa Hình 1.2 Sự methyl hóa DNA [35] Sự methyl hóa DNA là một cơ chế thuộc quá trình biến đổi epigenetics, thường xảy ra trên đảo CpG thuộc vùng promoter các gen trong bộ nhiễm sắc thể tế bào Eukaryote [36, 37] Sự methyl hóa DNA là phản ứng hóa học bổ sung một nhóm methyl (CH3) vào vị trí C5 của cytosine để tạo thành 5-methylcytosine (5Mc) [35, 36] Sự methyl hóa DNA được xúc tác bởi enzyme DNA methltransferases (DNMTs) bao gồm DNMT1, DNMT2, DNMT3A, DNMT3B, giúp chuyển nhóm methyl từ S-adenyl methionine (SAM) thành S-adenosylhomocysteine (SAH) [35, 36] 1.5.2 Vai trò của sự methyl hóa trong tế bào bình thường Sự methyl hóa DNA giữ vai trò kiểm soát sự biểu hiện gen và cấu trúc nhiễm sắc thể trong các tế bào Eukaryote [37] Trong các mô bình thường, sự methyl hóa các đảo CpG ở vùng promoter dẫn đến hai cơ chế điều hòa biểu hiện gene: (1) ức chế các yếu tố điều hòa biểu hiện gene gắn vào vùng khởi động do gốc CH3 gắn vào Cytosin (2) sự gắn đặc hiệu các protein vào các vị trí CpG bị methyl hóa dẫn đến biến đổi histon (mất acetyl) và làm cấu trúc sợi chromatin co lại, cuối cùng dẫn đến các yếu tố phiên mã không gắn được vào vùng đó của DNA [38] Ngoài ra, quá trình methyl hóa DNA còn liên quan đến các quá trình sinh lý khác nhau, chẳng hạn như biệt hóa tế bào, bất hoạt nhiễm sắc thể X, in dấu gen và ổn định gen [38] Trang 241.5.3 Sự methyl hóa bất thường Sự methyl hóa DNA bất thường là nguyên nhân gây cản trở sự phiên mã của các gen giữ chức năng quan trọng, điển hình là các gen ức chế khối u trong một số bệnh lý ung thư [39, 40, 41] Sự methyl hóa vượt mức tại các vùng promoter trên các gen đặc biệt là chìa khóa mở ra con đường sinh ung trong việc hình thành và tiến triển của bệnh ung thư vú [42] Tính chất methyl hóa bất thường gồm có dạng cao vượt mức (Hypermethylation) và giảm (hoặc còn được gọi là giải) methyl hóa (Hypomerthylation) [41, 42, 43] Tính chất methyl hóa cao vượt mức liên quan đến sự rối loạn cơ chế điều hòa biểu hiện các gen ức chế khối u, gây nên sự bất hoạt các gen này Tính chất giải methyl liên quan đến cơ chế kích hoạt các gen tiền sinh ung (proto oncogene) biến đổi thành các gen sinh ung (oncogene), tạo thành các oncoprotein gây nên hiện tượng “mở” con đường sinh ung [44] Công bố khoa học của Huang và cộng sự (1990), Duffy và cộng sự (2009), Jin và cộng sự (2011) xác định tình trạng methyl hóa bất thường trên vùng promoter của các gen chức năng (điều hòa chu trình tế bào, kiểm soát sự phân bào, ) là nhóm dấu chứng sinh học tiềm năng trong tiên lượng, chẩn đoán sớm và dự đoán đáp ứng điều trị các bệnh lý ung thư, trong đó có ung thư vú xảy ra trải dài trên toàn bộ nhiễm sắc thể hoặc chỉ xuất hiện cục bộ trên vùng đảo CpG (CpG island) [41, 42, 43] Hình 1.3 Sự methyl hóa DNA và sự biểu hiện gen [35] 1.6 Đảo CpG Đảo CpG là chuỗi DNA có chiều dài từ 300 bp đến 3000 bp Đảo CpG có tỷ lệ dinucleotide CpG lớn hơn 50% và tỷ lệ cặp dinucleotide CpG/GpC ≥ 0,6 [45, 46] Trang 25Các cặp CpG được hình thành bởi liên kết phosphodiester giữa cytosine và guanine [45, 46] Trên bộ gen người, ước tính có khoảng 29.000 đảo CpG và phân bố không đều, thường tập trung trên vùng promoter gen giữ nhà (Housekeeping gene) hoặc một số gen giữ vai trò điều hòa hoạt động tế bào [47, 48] Sự methyl hóa DNA diễn ra trên đảo CpG thuộc vùng promoter các gen đè nén ung, dẫn đến bất hoạt gen, thúc đẩy cơ chế sinh ung [49] 1.7 Đột biến điểm – Tính đa hình gen 1.7.1 Đột biến điểm Theo Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute - NIH), đột biến điểm là những biến đổi rất nhỏ trên một đoạn phân tử DNA thường liên quan đến một nucleotide hay một cặp nucleotide Xét về mức độ phân tử DNA, đột biến điểm gồm có dạng: đột biến thay thế cặp base (Base substitution) và đột biến thêm hoặc bớt cặp base (Base-pair insertition/deletion) - Đột biến thay thế cặp base gồm hai dạng + Đột biến đồng hoán (Transition mutation): là sự thay thế purine này bằng một purine khác, một pyrimidine này bằng một pyridine khác + Đột biến dị hoán (Transversion mutation): là sự thay thế purine này bằng một pyrimidine khác hoặc thay thế một pyrimide này bằng một purine khác Hình 1.4 Đột biến đồng hoán – dị hoán - Đột biến thêm/bớt cặp base là dạng đột biến liên quan đến sự thêm vào/mất đi một hay một vài cặp base trên đoạn phân tử DNA hay còn được gọi là đột biến thêm/mất một vài cặp nucleotide Trang 26Hình 1.5 Đột biến thêm/mất cặp base 1.7.2 Tính đa hình gen Tính đa hình là sự xuất hiện hai hay nhiều biến thể hoặc các hình thức khác nhau được gọi là kiểu hình thay thế trong một quần thể loài [106] Có 3 dạng: đa hình cân bằng (balanced polymorphism), đa hình di truyền (genetic polymorphism), đa hình đơn nucleotide (single nucleotide polymorphism – SNP [106] Theo Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NIH), SNP là sự thay đổi của một nucleotide ở một vị trí xác định trên trình tự bộ gene SNP là loại biến thể di truyền phổ biến nhất ở người Mỗi SNP đại diện cho một sự khác biệt trong từng cấu tử của DNA, được gọi là nucleotide Trong một quần thể, số cá thể mang biến thể này lớn hơn 1% tổng số cá thể Hình 1.6 Dạng biến thể - SNP: thay thế G-C thành A-T Theo Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NIH), SNP được ứng dụng trong y học hiện đại nhằm xác định mức độ tương đồng hoặc khác nhau giữa các vùng gen thuộc hệ gen giữa nhóm người bệnh và nhóm người lành Các nghiên cứu phân tích biến thể Trang 27(SNP, đột biến điểm) có ý nghĩa khoa học thực tiễn trong hướng y học cá thể, nhằm xác định một số đặc điểm phân tử gắn chặt nguy cơ dẫn đến các bệnh lý ung thư của từng bệnh nhân 1.8 Dấu chứng sinh học (Biomarker) Dấu chứng sinh học là các yếu tố thuộc cấp độ tế bào, phân tử hoặc các quá trình sinh hóa [50, 51] Dấu chứng sinh học được tìm thấy trong máu, thể dịch trong các cơ thể khác nhau hoặc các mô, được sử dụng để nhận diện hoặc theo dõi trạng thái sinh học (bình thường/bất thường) [50, 51] Có rất nhiều loại dấu ấn sinh học bao gồm: protein, axit nucleic, kháng thể, peptide, hoặc cũng có thể là một tập hợp các thay đổi chẳng hạn như biểu hiện gen, [50, 51] Dấu chứng sinh học có thể được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng nhằm: tiên đoán nguy cơ mắc bệnh, sàng lọc ung thư nguyên phát, phân biệt u lành tính với u ác tính, tiên lượng và dự đoán ca mắc mới hoặc tái phát, xác định đáp ứng điều trị hoặc tiến triển với trị liệu [50] 1.9 Tổng quan về các gen mục tiêu cyclin D2, có chức năng điều tiết các kinase CDK [8] Protein CCND2 liên kết với CDK4 hoặc CDK6 tạo thành một phức hợp và hoạt động như một tiểu đơn vị điều tiết của phức hợp, có hoạt động cần thiết cho quá trình chuyển đổi G1/S của chu trình tế bào [8] Protein này đã được chứng minh là tương tác và tham gia vào quá trình phosphoryl hóa protein ức chế khối u RB Trang 28(Retinoblastoma protein) [8] Hình 1.8 Định vị gen CDKN2A trên nhiễm sắc thể số 9 (https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=CDKN2A&keywords=CDKN2A) Gen CDKN2A (Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A, p16INK4a) là gen ức chế khối u, nằm trên nhiễm sắc thể 9p21.3, gồm 8 exon, có chiều dài 27.572 bp (GeneCards, NCBI) Gen CDKN2A mã hóa protein p16INK4a tham gia vào cơ chế kiểm soát chu trình tế bào tại giai đoạn chuyển pha G1 đến pha S [10] CDKN2A liên kết với CDK4 hoặc CDK6 tạo thành phức hợp xúc tác dẫn đến sự phosphoryl hóa RB và dẫn đến bất hoạt chức năng RB [10] 1.9.1.3 Con đường truyền tín hiệu cyclin D - CDK4/6 - INK4 - Rb Chu kỳ tế bào quan trọng thiết yếu cho sự tăng sinh, tăng trưởng và phân chia tế bào [52, 53] Chu kỳ tế bào chia thành 4 pha: G1, S, G2 và M [52, 53] Để thông tin di truyền được truyền đi chính xác thì thứ tự và thời gian của chu kỳ tế bào rất quan trọng, do đó, các con đường tín hiệu diễn ra trong các giai đoạn chuyển tiếp giữa pha G1 – S, G2 – M, , nhằm đảm bảo, duy trì sự ổn định của bộ gen, lưu trữ và cũng như biểu hiện chính xác thông tin được mã hóa [52, 53] “Checkpoint” là thuật ngữ đề cập đến việc dừng, kiểm soát chu kỳ tế bào tại các thời điểm chuyển tiếp giữa các pha [52] Trong hầu hết các mô trưởng thành, các tế bào biệt hóa luôn được duy trì trong pha G0, các tế bào này được cho là không hoạt động và chờ đợi để vào chu kỳ tế bào [53] Các yếu tố tăng trưởng và kích thích tố có thể kích hoạt chu kỳ tế bào và gây ra sự chuyển pha từ G0/G1 sang pha S [52, 53] Cyclin loại D và kinase phụ thuộc cyclin (CDK 4/6) đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ tế bào CDK4 và CDK6 là serine/threonine kinase, và là protein CDK điển hình được kích hoạt khi có liên kết với cyclin Cyclin là một họ protein rất đa dạng, có kích thước từ khoảng 35 đến 90 Trang 29kDa [52, 53] Khi các tế bào đã sẵn sàng để bắt đầu tổng hợp DNA (pha S) trong các tế bào động vật có vú, phức hợp CDK4/6 liên kết với các cyclin loại D (cyclin D1, cyclin D2 và cyclin D3) và điều hòa, thúc đẩy chu kỳ tế bào vượt qua pha G1 để đến pha S [52, 53] Hoạt tính kinase của CDK4/6 được quy định chặt chẽ bởi rất nhiều chất ức chế CDK (CDKi), có tác dụng ức chế sự phát triển của chu kỳ tế bào trong điều kiện bất lợi [52, 53] Các thành viên của gia đình INK4: p16INK4a (CDKN2A), p15INK4b(CDKN2B), p18INK4c (CDKN2C) và p19INK4d (CDKN2D), các protein này hoạt động trên “phân tử đích” là CDK4 và CKD6 [52, 53] Các protein INK4 làm suy yếu sự liên kết của các cyclin loại D với CDK4/6 và tương tác với miền xúc tác của CDK4/6 để ngăn chặn mạnh mẽ hoạt động kinase [52, 53] Trong số 4 protein INK4, p16INK4Adường như đóng vai trò quan trọng trong sự lão hóa và ức chế khối u trong tế bào người [52, 53] Ngược lại các thành viên gia đình Cip/Kip: p21Cip1 (CDKN1A), p27Kip1 (CDKN1B) và p57Kip2 (CDKN1C) làm bất hoạt các phức hợp cyclin B, CDK2, cyclin A và CDK1 [52, 53] Phân tích cấu trúc/chức năng của protein p21 và p27 cho thấy N-termini của chúng chứa 2 miền chính, một miền cần cho liên kết cyclin và một miền khác được yêu cầu để liên kết với tiểu đơn vị CDK [52, 53] Khi các tế bào vượt qua pha G1, cyclin D - CDK4/6 là phức hợp đầu tiên hoạt động trong pha G1, dẫn đến sự phosphoryl hóa mục tiêu hạ lưu của chúng là protein liên quan đến Retinoblastoma (pRb) [52, 53] Rb là một chất ức chế khối u điều chỉnh nhiều hoạt động quan trọng của tế bào, bao gồm điểm hạn chế pha G1 muộn, điểm kiểm tra phản ứng hủy hoại DNA, thoát khỏi chu kỳ tế bào và biệt hóa [52, 53] Họ retinoblastoma bao gồm ba thành viên (Rb/p105, p107 và Rb2/p130), Rb ức chế sự biểu hiện của nhiều gen liên quan đến kiểm soát chu kỳ tế bào, tiến trình phân bào và sinh tổng hợp Dntp [52, 53] Sự tăng phospho của Rb làm giảm ái lực với E2F, do đó có thể kích hoạt và phiên mã các gen mục tiêu của E2F cần thiết cho sự phân chia tế bào [52, 53] Khi tế bào thực hiện bước chuyển đổi từ pha G1 sang pha S, cyclin E/CDK2 phosphoryl hóa các dư lượng còn lại trên các protein thuộc họ Rb để kích hoạt E2F, hệ quả là E2F và các nhân tố phiên mã khác cho phép tế bào chuyển sang Trang 30pha S và bắt đầu sao chép DNA trong giai đoạn cuối pha G1 [52, 53] E2F và các nhân tố phiên mã khác cho phép tế bào thực hiện phiên mã các gen có chức năng trong quá trình sao chép DNA [52, 53] Trong các cơ chế này hoạt động của phức hợp Cyclin A/CDK2 thúc đẩy tế bào vượt đến pha G2, trước khi cấu thành phức hợp cylin B/CDK1 và bắt đầu quá trình nguyên phân [52, 53] Con đường cyclin D - CDK4/6 - INK4 - Rb bị rối loạn được ghi nhận trong nhiều loại ung thư ở người như: sarcoma, u thần kinh đệm, u vú, u lympho, ung thư bạch cầu, ung thư vú và u ác tính [53] Hình 1.9 Con đường truyền tín hiệu cyclin D - CDK4/6 - INK4 – Rb [53] 1.9.2 Nhóm gen ApoB và MTHFR 1.9.2.1.Gen ApoB (Apolipoprotein B) Gen ApoB (Apolipoprotein B) định vị trên nhiễm sắc thể người tại 2p24.1, thuộc vị Trang 31Protein ApoB đóng một vai trò đặc biệt quan trọng trong việc vận chuyển lipoprotein, là thành phần cấu trúc thiết yếu của các hạt lipoprotein giàu TGs (triglyceride) và đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cân bằng nội mô cholesterol [6] Một số báo cáo khoa học đã chỉ ra rằng ApoB có liên quan đến viêm, nhiễm virus, phát triển khối u và di căn [55, 56, 57, 58, 59] ApoB huyết thanh đã hoạt động như một dấu hiệu tiềm năng để chẩn đoán và tiên lượng bệnh ung thư buồng trứng, túi mật và ung thư vú [60, 61] ⮚ Apolipoprotein Protein Apo liên kết với lipid để tạo thành lipoprotein bằng cách hoạt động như chất mang lipid, Apo đóng vai trò là phối tử cho các thụ thể màng tế bào, đồng yếu tố của enzyme và các thành phần cấu trúc của lipoprotein [62] Apo có vai trò trong cơ chế chuyển hóa lipid, cholesterol trong máu [62] Họ gen Apo trên bộ gen người bao gồm 22 thành viên: ApoA1, ApoA2, ApoA4, ApoA5, ApoB 48, ApoB-100, ApoC1, ApoC2, ApoC3, ApoC4, ApoD, ApoE, ApoH, ApoL1, ApoL2, ApoL3, ApoL4, ApoL5, ApoL6, ApoM, ApoO và ApoJ [63] Các APO khác nhau liên kết lipid để tạo thành lipoprotein có mật độ khác nhau và lipoprotein có thể được chia thành nhiều loại theo mật độ của chúng: chylomicron (CM), lipoprotein mật độ rất thấp (VLDL), lipoprotein mật độ thấp (LDL), lipoprotein mật độ trung gian (IDL) và lipoprotein mật độ cao (HDL) [64] Apo chủ yếu được tổng hợp ở gan và ruột [65] Ở gan, sự tổng hợp Apo bị ảnh hưởng bởi việc sử dụng các chất: rượu, thuốc hạ lipid, niacin và chế độ dinh dưỡng, đồng thời chịu ảnh hưởng bởi lượng estrogen, androgen, insulin, glucagon và thyroxin [65] Trong ruột, sự tổng hợp apolipoprotein chủ yếu được kiểm soát bởi hàm lượng lipid trong chế độ ăn uống [65] Trang 32⮚ Mối liên quan giữa rối loạn chuyển hóa lipid và các bệnh lý ở người Lipid máu và protein từ rất lâu đã được quan tâm vì mối quan hệ chặt chẽ với các bệnh tim mạch, tuy nhiên nhiều nghiên cứu dịch tễ học gần đây đã chỉ ra mối liên hệ giữa bệnh béo phì và ung thư vú [13, 66, 67] Chuyển hóa lipid được cho là có vai trò trong sự phát triển của ung thư vú [13, 66, 67] Một số thí nghiệm trên động vật đã chứng minh rằng apolipoprotein có ảnh hướng đến sự phát triển của khối u thông qua điều tiết chức năng miễn dịch tế bào [68] Sự tổng hợp axit béo xuất hiện sớm trong quá trình sinh ung mở rộng khi các tế bào trở nên ác tính, thúc đẩy quá trình chuyển từ nguy cơ cao sang ung thư xâm lấn và có thể chiếm >90% triglyceride (TGs) trong các tế bào khối u [13] Đã có những nghiên cứu đưa ra bằng chứng cho mối liên quan giữa các TGs và nguy cơ ung thư vú [69, 70] Nồng độ lipid lưu hành của một người có thể bị ảnh hưởng bởi đặc điểm di truyền của chính người bệnh đó Một số đa hình đơn nucleotide (SNP) liên quan đến nồng độ lipid trong máu đã được ghi nhận trong các nghiên cứu phân tích đặc điểm tổng thể của bộ gen người (Genome – wide association study, GWAS) [71, 72] SNP rs1042031 (G12699A, trong exon 29), thay đổi trình tự axit amin của protein ApoB bằng cách thay thế axit glutamic thành lysine và được biết đến rất quan trọng để điều chỉnh sự gắn kết của apolipoprotein B với thụ thể cholesterol lipoprotein mật độ thấp (LDL) [73] SNP rs693 ( C7673T, trong exon 26), nằm trong vùng mã hóa của gen APOB , được liên kết với mức LDL-C và TGs trong các mô hình di truyền khác nhau [74] Các dạng biến thể rs1042031 và rs693 trong gen APOB đóng vai trò kiểm soát âm và nghịch đảo về mức độ cholesterol và ApoB, và có liên quan đến nguy cơ ung thư túi mật, hẹp động mạch chủ và đột quỵ do thiếu máu cục bộ [75, 76, 77] 1.9.2.2 Gen MTHFR (Methylenetetrahydrofolate reductase) Gen MTHFR (Methylenetetrahydrofolate reductase) định vị trên nhiễm sắc thể người tại 1p36.22, thuộc vị trí 11.785.723 – 11.806.103 (GRCh38/hg38), 11.845.787 – 11.866.160 (GRCh37/hg19) có chiều dài 20.381 bp, gồm 12 exon Gen MTHFR mã Trang 33hóa enzyme MTHFR với trọng lượng khoảng 70 kDa và 656 amino acid (GeneCards, NCBI) Hình 1.11 Định vị gen MTHFR trên nhiễm sắc thể số 1 (https://www.genecards.org/cgibin/carddisp.pl?gene=MTHFR&keywords=MTHFR) MTHFR là một enzyme quan trọng trong con đường chuyển hóa folate và điều chỉnh nhóm folate nội bào để tổng hợp và methyl hóa DNA [78, 79] Folate tham gia vào quá trình methyl hóa, tổng hợp và sửa chữa DNA, lượng folate thấp có thể làm tăng nguy cơ mắc một số bệnh ung thư, bao gồm ung thư vú [80, 81] Enzyme MTHFR đóng vai trò quan trọng trong các quá trình chuyển hóa nội bào: tổng hợp nucleotide, homocysteine, methyl hóa nội bào, bằng cách xúc tác chuyển đổi 5,10 – methylenetetrahydrofolate thành 5 – methyltetrahydrofolate sử dụng cho việc tái tạo vitamin B, vitamin D12 - homocysteine thành methionine, tham gia quá trình sinh tổng hợp purine, DNA và RNA [7, 82] Hai dạng SNP đã được mô tả trong gen MTHFR là C677T (rs1801133) và A1298C (rs1801131), đây là các dạng biến thể có liên quan đến việc giảm hoạt động của enzyme và tăng mức homocysteine huyết tương [7] Trong gen MTHFR, đa hình C677T xảy ra ở exon 4, liên quan đến sự thay thế C thành T ở vị trí 677, hậu quả của việc chuyển đổi từ alanine thành valine tại codon 222 trong miền xúc tác N-terminal [7] Dạng đa hình A1298C, xảy ra tại exon 8 dẫn đến sự thay đổi từ axit glutamic thành alanine tại codon 429 trong miền điều hòa đầu C của protein và làm giảm hoạt động của enzyme, gồm dạng A1298A (AA) là thể đồng hợp tử hoang dại, A1298C (AC) là dạng biến thể/đột biến ở thể dị hợp tử và C1298C (CC) là dạng biến thể/đột biến ở thể đồng hợp tử [7] Người mang gen dị hợp tử (AC) và đồng hợp tử (CC) có mức giảm hoạt động enzyme lần lượt là 15% và 30% [7] Trang 34Sự giảm hoạt động của enzyme MTHFR được xác định là có liên quan đến bệnh tim mạch, suy thận, nhiễm sắc thể bất thường, sẩy thai và các bệnh ung thư [16, 17, 83, 84, 85] Một số nghiên cứu đã tìm thấy mối liên quan giữa đa hình C677T và A1298C và sự gia tăng nguy cơ mắc các loại ung thư khác nhau như tuyến tụy, thực quản, dạ dày, đại tràng, phổi và ung thư vú [16, 17, 18, 19, 20] 1.10 Tình hình nghiên cứu các gen mục tiêu trên bệnh ung thư vú 1.10.1 Nghiên cứu trên gen CCND2 và CDKN2A Cho đến nay, có rất ít nghiên cứu về tính chất methyl hóa trên gen CCND2, CDKN2A ở Việt Nam Công trình nghiên cứu của Truong và cộng sự (2015), nghiên cứu về sự methyl hóa trên gen CCND2 trên mẫu bệnh phẩm ung thư vú của người Việt Nam dựa vào phương pháp MSP, xác định tỷ lệ methyl hóa bất thường trên gen CCND2 là 62% trên tổng số 95 mẫu bệnh phẩm và 10% trên 20 mẫu chứng [9] Tiếp đến năm 2018, Salta và cộng sự dựa vào phương pháp QMSP xác định tính chất methyl hóa vượt mức gen CCND2 trên 137 mẫu bệnh phẩm ung thư vú và 28 mẫu chứng của người Bồ Đào Nha [86] Salta và cộng sự ghi nhận tỷ lệ methyl hóa vượt mức trên gen CCND2 là 72% trên tổng số 137 mẫu bệnh phẩm ung thư vú và 7% trên tổng số 28 mẫu chứng Công trình nghiên cứu của Vallian và cộng sự (2008), nghiên cứu về sự methyl hóa trên gen CDKN2A trên mẫu bệnh phẩm ung thư vú của người Iran dựa vào phương pháp MSP, xác định tỷ lệ methyl hóa bất thường trên gen CDKN2A là 36% trên tổng số 70 mẫu bệnh phẩm và 0% trên 70 mẫu chứng [87] Tiếp đến, năm 2016 Wu và cộng sự dựa vào phương pháp MSP xác định tính chất methyl hóa vượt mức gen CDKN2A trên 70 mẫu bệnh phẩm ung thư vú và 20 mẫu chứng của người Trung Quốc [12] Wu và cộng sự ghi nhận tỷ lệ methyl hóa vượt mức trên gen CDKN2A là 40% trên tổng số 70 mẫu bệnh phẩm ung thư vú và 20% trên tổng số 20 mẫu chứng 1.10.2 Nghiên cứu trên các gen ApoB và MTHFR Hệ thống tổng hợp dữ liệu biến thể (đột biến) trên gen ApoB và gen MTHFR chưa được thiết lập đối với bệnh lý ung thư vú Việc nghiên cứu tính chất đột biến điểm của gen ApoB và MTHFR là một hướng đi mới trong việc phân tích tính chất đột biến Trang 35điểm trên bộ gen người Tới nay, vẫn chưa có công trình nào công bố về tính chất đột biến điểm trên gen ApoB và MTHFR tại Việt Nam Vì vậy, hướng nghiên cứu tính chất đột biến điểm trên gen ApoB và MTHFR mở ra tầm nhìn về sự đa dạng của toàn bộ gene người Các công trình nghiên cứu về tính đa hình trên gen ApoB còn hạn chế Tính đa hình trên gen ApoB lần đầu tiên được đề cập trong nghiên cứu của Liu và cộng sự (2013) [6] Trong nghiên cứu này Liu và cộng sự đã sử dụng phương pháp RFLP – PCR, nhóm tác giả đã phát hiện được hai vị trí SNP trên gen ApoB tại locus 12669 (G → A) và 7673 (C → T) được xác định có mối tương quan đáng kể với nguy cơ ung thư vú cao trên 675 mẫu ung thư vú và 712 mẫu chứng của người Trung Quốc [6] Kết quả nghiên cứu biểu thị tần số xuất hiện tính biến thể G12669A trên gen ApoB là 53,8% ở mẫu ung thư vú và 29,8% ở mẫu lành; tần số xuất hiện tính biến thể C7673T trên gen ApoB là 63% ở mẫu ung thư vú và 44% ở mẫu chứng [6] Tính đa hình của gen MTHFR lần đầu tiên được đề cập trong nghiên cứu của Sharp và cộng sự (2002) [88] Trong nghiên cứu này, Sharp và cộng sự đã sử dụng phương pháp PCR-RFLP; nhóm tác giả đã phát hiện được hai vị trí SNPs trên gen MTHFR tại locus 1298 (A → C) và 677 (C → T) được xác định có mối tương quan đáng kể với nguy cơ ung thư vú cao trên 55 mẫu ung thư vú và 60 mẫu chứng của người Anh [88] Trong nghiên cứu về tính đa hình gen MTHFR trên 919 trường hợp (315 mẫu bệnh và 604 mẫu chứng) của Akilzhanova và cộng sự (2013), biến thể SNP A1298C đã được phát hiện [89] Ngoài ra, nhóm tác giả đã so sánh kiểu gene và sự phân bố tần số alen giữa nhóm bệnh và chứng, cho thấy tần số alen C trong nhóm bệnh cao hơn đáng kể so với nhóm chứng (33,7% so với 27,3%) [89] Tần số của kiểu gen CC trong nhóm bệnh so với nhóm chứng là cao hơn và khác biệt đáng kể (11,1% so với 7,3%) [89] Tuy nhiên, các đặc điểm phân tử (biến thể, SNP, đột biến điểm) trên gen ApoB và MTHFR có liên quan như thế nào đến sự hình thành và phát triển của ung thư vú cần được làm rõ trên người bệnh ung thư vú cũng như người lành ở nhiều nước khác nhau, trong đó có Việt Nam Trên cơ sở khoa học này, đề tài nghiên cứu này được thực hiện Trang 36để bước đầu phản ánh đặc điểm phân tử trên gen ApoB và MTHFR, tập trung ở một số exon có các biến thể nổi trội liên quan đến bệnh lý ung thư vú 1.11 Phương pháp phân tích tổng hợp (Meta-analysis) Phân tích tổng hợp là một công cụ định lượng và thống kê, được sử dụng để tổng hợp các kết quả, kết luận của các nghiên cứu độc lập nhằm mục đích đánh giá, xác định hiệu quả điều trị tạo cơ sở cho việc phát triển các phác đồ điều trị hoặc đánh giá một cách có hệ thống các kết quả nghiên cứu trước đó để đưa ra các kết luận về bản chất của nghiên cứu [90, 91] Phân tích tổng hợp là phương pháp quan trọng để khai thác các tài liệu có sẵn, đóng vai trò trung tâm trong y học thực chứng [90, 91] Trong phân tích tổng hợp, bước trích xuất dữ liệu trên các tiêu chuẩn, điều kiện định sẵn là bước tiên quyết, phải đảm bảo kết quả chính xác với độ tin cậy cao (confidence intervals-Cis: 95%) [91] Phân tích tổng hợp được sử dụng nhằm: giải quyết các vấn đề đang tranh cãi hoặc mâu thuẫn về kết quả của các nghiên cứu hoặc chưa có câu trả lời dứt khoát; xác định giả thuyết mới cho các vấn đề đã và đang được nghiên cứu rộng rãi hoặc chưa đủ/thiếu bằng chứng/minh chứng thích hợp [92] Phân tích tổng hợp theo phương pháp thống kê trên mô hình phân tích tổng hợp ảnh hưởng bất biến (Fixed effects meta analysis - F) hoặc mô hình phân tích tổng hợp ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects meta analysis - R) cho một tiêu chí nhị phân với khoảng tin cậy 95% (CI) [107] Tiêu chí lựa chọn mô hình phân tích tổng hợp dựa vào chỉ số I2 phản ánh tính bất đồng nhất về biến số khảo sát trong bộ dữ liệu [107]: - Khi I2 < 50% và P ≥ 0,1: phân tích tổng hợp hướng theo mô hình ảnh hưởng bất biến (Fixed-effects models) - Khi I2 > 50% và P < 0,1: phân tích tổng hợp hướng theo phân tích tổng hợp ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects models) Trang 37hợp (dựa theo PICO (Participant-Intervention-Comparator-Outcomes); - P (Participant): độ tuổi, giới tính, chủng tộc, quốc tịch, - I (Intervention): ước số cần phân tích - C (Comparator): phương pháp nghiên cứu, - O (Outcomes): hướng tiếp cận giải quyết để xuất kết quả Bước 2: Tìm kiếm công bố khoa học dựa trên các cơ sở dữ liệu: Pubmed/Medline, Google Scholar, NCBI, ; Bước 3: Chọn lọc dữ liệu để phân tích tổng hợp bằng cách đọc tóm tắt và tiêu đề của các công bố khoa học; Trước hết, thiết lập một sơ đồ quyết định cho việc chọn và bỏ các bài viết để thực hiện phù hợp cho việc phân tích tổng hợp Thiết lập một sơ đồ gồm có: - Dữ liệu (báo cáo khoa học) có/không liên quan đến câu hỏi nghiên cứu - Dữ liệu có/không có đối tượng/quần thể liên quan - Dữ liệu có/không có sự liên quan đến nghiên cứu - Dữ liệu có/không có nhóm so sánh, thuộc nhóm nghiên cứu ca chứng/đoàn hệ, - Dữ liệu có/không thảo luận về kết quả của nghiên cứu - Dữ liệu có/không được xuất bản ở định dạng chuẩn và phù hợp để trích xuất dữ liệu - Dữ liệu được xuất bản bằng ngôn ngữ gì, có phù hợp để trích xuất dữ liệu? - Dữ liệu có/không có tính trùng lặp (cùng một ấn phẩm được xuất bản hai lần) Bước 4: Chọn lọc và trích xuất dữ liệu của các công bố khoa học dựa trên nội dung toàn văn; - Tên tác giả, năm bài báo được xuất bản - Cỡ mẫu/Loại mẫu, quần thể người bệnh, được thực hiện nghiên cứu - Loại nghiên cứu, đối tượng nghiên cứu, phương pháp nghiên cứu, kết quả là gì và được xác định bằng phương pháp gì, kết quả như thế nào? - Tổng mẫu khảo sát, tổng mẫu đối chứng Trang 38- Kết quả nghiên cứu theo thang đo liên tục hoặc thang đo nhị phân Bước 5: Đánh giá biến số dựa vào phương pháp thống kê với chỉ số tỷ suất chênh Odds ratio (OR), sử dụng mô hình ảnh hưởng bất biến “Fixed effects model” hoặc mô hình ảnh hưởng ngẫu nhiên “Random effects model” và xây dựng đồ thị “Forest plot”; Bước 6: Xác định tính thiên vị của bộ dữ liệu đưa vào phân tích tổng hợp thông qua đồ thị “Funnel plot”; Bước 7: Tiến hành chia nhóm phân tích và kiểm tra kết quả phân tích tổng hợp 1.12 Phương pháp phân tích tính chất methyl hóa DNA 1.12.1 Phương pháp BSP (Bisulfite sequencing - PCR) Bisulfite sequencing - PCR (BSP) được thiết lập đầu tiên bởi Frommer và cộng sự (1992) Đối với phương pháp BSP, đầu tiên DNA phải được biến đổi bisulfite để chuyển đổi tất cả Cytosine thành Uracil ngoại trừ các Cytosine đã bị methyl hóa, sau đó thực hiện PCR để tiến hành khuếch đại DNA đã biến đổi bisulfite [94] Trong phương pháp BSP, một cặp mồi đặc hiệu được sử dụng để khuếch đại vùng gen khảo sát, đặc điểm quan trọng trong việc thiết kế cặp mồi này là không chứa bất kì vị trí CpG nào trên trình tự của chúng để có thể khuếch đại cả allele methyl và allele unmethyl trên DNA đã biến đổi bisulfite và sau đó tiến hành giải trình tự để kiểm tra tính đặc hiệu của quy trình, xác định vị trí CpG bị methyl hóa thuộc các gene mục tiêu [94] 1.12.2 Phương pháp MSP (Methylation-Specific PCR) Phương pháp MSP (Methylation-Specific PCR) được Herman và cộng sự xây dựng vào năm 1996, MSP là phương pháp đơn giản với độ nhạy cao và độ đặc hiệu giúp xác định tình trạng methyl hóa ở hầu hết các đảo CpG thuộc vùng promoter [95] Bản chất của MSP là phương pháp PCR khuếch đại vùng gen mục tiêu sau khi đã được biến đổi bằng sodium bisulfite [95] Thành phần phản ứng gồm có: DNA polymerase, trình tự DNA đã được biến đổi bisulfite và bộ mồi đặc hiệu với trạng thái allele methyl hóa và trạng thái allele không methyl hóa [95] Trang 39Tiếp theo, phương pháp MSP gồm hai phản ứng PCR riêng biệt: - Phản ứng thứ nhất với cặp mồi đặc hiệu với trạng thái allele methyl hóa - Phản ứng thứ hai với cặp mồi đặc hiệu với trạng thái allele không methyl hóa 1.12.3 Phương pháp Nested - MSP Phương pháp Nested - MSP được Divine và cộng sự thiết lập vào năm 2006 Thực chất Nested - MSP là phương pháp MSP cải tiến và cũng được thực hiện trên DNA bộ gen đã được biển đổi bisulfite Nested - MSP là phương pháp cho phép phát hiện tình trạng methyl hóa chính xác và có độ nhạy cao hơn hẳn so với phương pháp MSP truyền thống [96] Một quy trình Nested - MSP gồm ba phản ứng PCR riêng biệt [97]: - Phản ứng thứ nhất sử dụng một cặp mồi thứ nhất có tính phổ quát trên vùng trình tự mục tiêu Sản phẩm PCR lần thứ nhất là mạch khuôn cho hai phản ứng PCR riêng biệt, diễn ra song song - Phản ứng thứ hai với cặp mồi đặc hiệu với trạng thái allele methyl hóa - Phản ứng thứ ba với cặp mồi đặc hiệu với trạng thái allele không methyl hóa 1.13 Phương pháp xác định tính chất đột biến điểm Theo công bố khoa học của Van der Put và cộng sự (1998), Gaughan và cộng sự (2001) có nhiều phương pháp sinh học phân tử phù hợp để xác định trình tự nucleotide, gồm có: PCR kết hợp giải trình tự (PCR - Sequencing), Retriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), Multiplex PCR, Nested PCR, Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) [98, 99] Trong đó, phương pháp PCR kết hợp giải trình tự (PCR - Sequencing) là phương pháp cho phép phân tích chính xác trình tự nucleotide trên gen mục tiêu, giúp phát hiện và xác định bản chất các dạng đột biến điểm - là nguyên nhân dẫn đến một số bệnh di truyền thuộc nhóm rối loạn chuyển hóa [100] PCR (Polymerase Chain Reaction) được phát triển bởi Kary Mullis năm 1984 [101] Nguyên tắc của phương pháp PCR là khuếch đại lượng lớn bản sao từ các chuỗi DNA khuôn, dựa trên sự hoạt động của DNA polymerase để tổng hợp các chuỗi bản sao theo nguyên tắc bán bảo tồn và bắt cặp bổ sung [102] Enzyme DNA polymerase xúc Trang 40tác phản ứng tổng hợp mạch DNA mới từ mạch khuôn với sự hiện diện của mồi chuyên biệt Đó là đoạn oligonucleotide ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với DNA mạch khuôn PCR là phản ứng chuỗi bao gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba bước: - Bước 1: biến tính ở nhiệt độ khoảng 90 - 95℃ Trong quá trình biến tính, mạch đôi DNA trở thành mạch đơn và toàn bộ phản ứng enzyme dừng lại - Bước 2: bắt cặp ở nhiệt độ trong khoản 40 - 70℃, thấp hơn nhiệt độ Tm của mồi - Bước 3: tổng hợp ở nhiệt độ 72℃, là nhiệt độ hoạt động tối ưu của DNA polymerase chịu nhiệt, thực hiện quá trình tổng hợp mạch DNA mới theo nguyên tắc bổ sung với trình tự mạch đích Phương pháp giải trình tự cho phép xác định trình tự nucleic acid đã được xử lý hóa học để làm biến đổi đặc hiệu một hoặc hai loại base của nucleotide trên đoạn DNA, thường dựa vào phương pháp của Frederick Sanger và cộng sự (1977) Đây là phương pháp được Sanger sử dụng để xác định trình tự DNA ty thể (16.569 bp) và bộ gen của thực khuẩn thể pha (48.502 bp) Nguyên tắc của phương pháp Sanger là sử dụng các dideoxyribonucleotide triphosphate (ddNTP) để dừng phản ứng kéo dài mạch của DNA polymerase vì ddNTP không chứa nhóm 3’- OH dùng để tạo liên kết với nucleotide kế tiếp [103] Phản ứng khuếch đại DNA mạch đôi, gồm có các thành phần: DNA polymerase, trình tự DNA mạch khuôn (ở trạng thái mạch đơn), bốn loại dNTP thông thường và một lượng nhất định ddNTP được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ hoặc chất phát màu huỳnh quang khác nhau [103].