Đang tải... (xem toàn văn)
Ảnh hưởng của bảo quản lạnh đối với cấu trúc đầu tinh trùng, hoạt động của enzyme, khả năng vận động và khả năng sinh sản của tinh trùng bò, cừu và dê. 1. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU So sánh sự khác biệt về cấu trúc đầu tinh trùng, hoạt tính enzyme, khả năng vận động của tinh trùng và khả năng thụ tinh của tinh trùng bò, cừu và dê trước và sau khi bảo quản lạnh, cung cấp nền tảng lý thuyết để cải thiện hơn nữa chất lượng tinh trùng đông lạnh ở những loài này (W. Sun et al., 2021) 2. PHƯƠNG PHÁP ĐƯỢC ĐỀ CẬP TRONG BÀI BÁO Phương pháp bảo quản lạnh tinh trùng Các mẫu tinh trùng được pha loãng với chất kéo dài glycerol lòng đỏ trứng bằng axit Tris-citric (TCEYG, pH 6,8) bao gồm Tris (hydroxymethyl) aminomethane (3,53% w/v, Fluka, Buchs, Thụy Sĩ), axit xitric (1,72% w/v, Fluka ), lòng đỏ trứng (20,00% v/v), fructose (1,26% w/v, Merck, Darmstadt, Đức), glycerol (10,00% v/v, Merck) và kháng sinh (benzyl penicillin 1000 IU/mL, Sigma) và streptomycin sulfat (100 μg/mL, Sigma). Nồng độ cuối cùng của tinh trùng đông lạnh là 2,0 × 109 tế bào tinh trùng/mL. Tinh trùng đã pha loãng được làm lạnh đến 4°C trong 90 phút và được đóng gói thành ống hút 0,25 mL. Ống hút tinh trùng được đông lạnh theo quy trình thông thường (sử dụng tủ đông có tốc độ kiểm soát) trên giá đỡ trong hơi nitơ lỏng tĩnh. Sau một ngày trong nitơ lỏng, các mẫu được làm tan băng trong bể nước tuần hoàn ở 37°C trong 1 phút. Tinh trùng đã rã đông được chuyển vào ống ly tâm 1,5 mL và được giữ trong bể nước ở 37°C trong suốt toàn bộ quá trình thí nghiệm (W. Sun et al., 2021).
Trang 1TÓM TẮT BÀI BÁO SỐ 8 MÔN SINH LÝ SINH SẢN NÂNG CAO HỌC VIÊN: LÂM ÁNH TUYẾT
LỚP: CHTY22
Ảnh hưởng của bảo quản lạnh đối với cấu trúc đầu tinh trùng, hoạt động của enzyme, khả năng vận động và khả năng sinh sản của tinh trùng bò, cừu và dê
1 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
So sánh sự khác biệt về cấu trúc đầu tinh trùng, hoạt tính enzyme, khả năng vận động của tinh trùng và khả năng thụ tinh của tinh trùng bò, cừu và dê trước và sau khi bảo quản lạnh, cung cấp nền tảng lý thuyết để cải thiện hơn nữa chất lượng tinh trùng đông lạnh ở những loài này (W Sun et al., 2021)
2 PHƯƠNG PHÁP ĐƯỢC ĐỀ CẬP TRONG BÀI BÁO Phương pháp bảo quản lạnh tinh trùng
Các mẫu tinh trùng được pha loãng với chất kéo dài glycerol lòng đỏ trứng bằng axit Tris-citric (TCEYG, pH 6,8) bao gồm Tris (hydroxymethyl) aminomethane (3,53% w/v, Fluka, Buchs, Thụy Sĩ), axit xitric (1,72% w/v, Fluka ), lòng đỏ trứng (20,00% v/v), fructose (1,26% w/v, Merck, Darmstadt, Đức), glycerol (10,00% v/v, Merck) và kháng sinh (benzyl penicillin 1000 IU/mL, Sigma) và streptomycin sulfat (100 μg/mL, Sigma) Nồng độ cuối cùng của tinh trùng đông lạnh là 2,0 × 109 tế bào tinh trùng/mL Tinh trùng đã pha loãng được làm lạnh đến 4°C trong 90 phút và được đóng gói thành ống hút 0,25 mL Ống hút tinh trùng được đông lạnh theo quy trình thông thường (sử dụng tủ đông có tốc độ kiểm soát) trên giá đỡ trong hơi nitơ lỏng tĩnh Sau một ngày trong nitơ lỏng, các mẫu được làm tan băng trong bể nước tuần hoàn ở 37°C trong 1 phút Tinh trùng đã rã đông được chuyển vào ống ly tâm 1,5 mL và được giữ trong bể nước ở 37°C trong suốt toàn bộ quá trình thí nghiệm (W Sun et al., 2021)
3 MỤC ĐÍCH SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP NÀY
Bảo tồn khả năng sinh sản là chiến lược được thực hiện nhằm đảm bảo sức khỏe sinh sản của con người, bảo tồn đa dạng sinh học thông qua việc bảo tồn bảo vệ bộ gen và tính đa dạng di truyền Công nghệ bảo quản lạnh là một trong những phương pháp hiệu quả đáp ứng được mục tiêu của chiến lược này (Comizzoli, Wildt, Comizzoli, & Wildt, 2014)
Ghi nhận đầu tiên về bảo quản lạnh tinh dịch có từ khoảng 200 năm trước, khi Lazaro Spallanzani (1776) cố gắng bảo quản tinh trùng bằng cách làm lạnh tinh dịch trong tuyết (Royere, Barthelemy, Hamamah, & Lansac, 1996)
Tuy nhiên, những cải thiện như vậy vẫn chưa đạt được mức mong muốn vì nhiều tinh trùng vẫn mất khả năng sống sót sau khi bảo quản lạnh (Hezavehei et al., 2018), đồng thời có sự khác biệt về sự thay đổi của tinh trùng giữa các loài sau bảo quản lạnh (Purdy, 2006)
4 PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA TỶ LỆ NGUYÊN VẸN ACROSOME TINH TRÙNG, HOẠT TÍNH HYD VÀ ACE:
a TÍNH NGUYÊN VẸN ACROSOME TINH TRÙNG:
Tiến hành đánh giá dưới kính hiển vi, mỗi lam kiểm tra 200 tinh trùng và lặp lại 3 lần b HOẠT TÍNH HYD:
Phát hiện hoạt tính HYD bằng màng natri hyaluronate-gelatin biến tính c HOẠT TÍNH ACE:
Phát hiện hoạt tính ACE bằng phương pháp BNPNA d KHẢ NĂNG VẬN ĐỘNG CỦA TINH TRÙNG:
Trang 2Khả năng vận động của tinh trùng được đánh giá bằng cách quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (quang học) (Nikon Corporation, Eclipse 80i, Japan) và hệ thống CASA ở 38°C
e KHẢ NĂNG THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM CỦA TINH TRÙNG: Chuẩn bị mẫu noãn (bò, cừu, dê)
Buồng trứng bò, cừu và dê được lấy từ một lò mổ địa phương và vận chuyển đến phòng thí nghiệm ở 35°C trong NaCl 0,9% chứa 70 mg/mL kanamycin Phức hợp noãn bào và các lớp tế bào hạt bao quanh (COC) được hút từ các nang trứng cỡ trung bình (đường kính khoảng 5 mm) bằng ống tiêm dùng một lần 10 mL Chỉ các COC được bao quanh bởi khối tích nhỏ gọn với tế bào chất dạng hạt đều mới được thu hoạch, và sau đó được rửa ba lần trong môi trường trưởng thành bao gồm Môi trường nuôi cấy mô 199 (IVM-M199) với muối Earle, L-glutamine, natri bicacbonat 26,19 mmol/L, và 25 mmol/L HEPES cộng với 10% (v:v) huyết thanh bào thai bò (Hyclone, Logan, UT, USA), 1% kháng sinh/kháng nấm (Gibco, Grand Island, NY, USA), 0,8% BSA,0,33 mmol/ L pyruvate, 3,3 mmol/L lactate, 1 mmol/L glutamine, 1×MEM axit amin thiết yếu, 1× axit amin không thiết yếu và 50 mg/mL gentamicin Khoảng 60 đến 80 COC được chuyển vào từng giếng của đĩa Nunc 4 giếng chứa 500 μL môi trường trưởng thành cân bằng trước, trước đó được phủ bằng dầu khoáng ấm Các COC được nuôi cấy trong 22 giờ ở 38,5°C trong 5% CO2 và độ ẩm cao
Chuẩn bị tinh trùng: Dùng môi trường BO cho tinh trùng bò, SOF cho tinh trùng dê cừu Thụ tinh
Đánh giá
5 TÓM TẮT KẾT QUẢ:
a TÍNH NGUYÊN VẸN ACROSOME TINH TRÙNG:
Phân tích siêu cấu trúc và nhuộm Giemsa của tinh trùng được xử lý cho thấy tỷ lệ nguyên vẹn của acrosome tinh trùng giảm đáng kể (P <0,01) sau khi bảo quản lạnh Không có sự khác biệt đáng kể về tỷ lệ toàn vẹn acrosome của tinh trùng ở bò, cừu và dê trước khi bảo quản lạnh (P > 0,05) Tính toàn vẹn của acrosome của tinh trùng bò cao hơn đáng kể (P <0,01) so với tinh trùng của cừu và dê sau khi bảo quản lạnh
b HOẠT TÍNH HYD và ACE:
Tỷ lệ tinh trùng có hoạt tính HYD ở bò và cừu cao hơn (P < 0,01) so với ở dê Hoạt tính ACE của tinh trùng bò cao hơn (P < 0,01) so với của cừu (57,88 ± 9,58 μIU/106) hoặc dê (50,30 ± 6,17 μIU/106) Nhìn chung, hoạt tính HYD và ACE của tinh trùng bò cao hơn đáng kể so với tinh trùng của cả dê và cừu
c KHẢ NĂNG VẬN ĐỘNG CỦA TINH TRÙNG:
Tốc độ di động của tinh trùng sau bảo quản lạnh lần lượt giảm rõ rệt ở cả 3 loài (P<0,01) Do đó, dữ liệu chứng minh rằng tỷ lệ di động của tinh trùng bò và dê cao hơn đáng kể so với tinh trùng của cừu trước khi bảo quản lạnh (P <0,01), thay vào đó, sau khi bảo quản lạnh, tỷ lệ di động của tinh trùng bò cao hơn đáng kể so với tinh trùng của cả tinh trùng cừu và tinh trùng dê (P < 0,01) d KHẢ NĂNG THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM CỦA TINH TRÙNG:
Bảo quản lạnh không ảnh hưởng đáng kể đến tỷ lệ phân cắt của tinh bò (P > 0,05); tuy nhiên, tỷ lệ phân cắt của trứng được thụ tinh với tinh trùng của dê và dê được bảo quản lạnh giảm đáng kể (P <0,01) Tỷ lệ phân cắt của trứng được thụ tinh bằng tinh bò tươi cao hơn đáng kể so với tinh trùng cừu tươi (P < 0,05) và tinh dê tươi (P < 0,01) Tỷ lệ phân cắt của trứng được thụ tinh bằng tinh trùng bò bảo quản lạnh cao hơn đáng kể so với tinh trùng cừu và dê bảo quản lạnh (P < 0,01) Kết quả cho thấy tỷ lệ phân cắt của trứng được thụ tinh bằng tinh bò tươi cao hơn rõ rệt so với tinh trùng của cừu và dê
Trang 3e MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA TỐC ĐỘ DI ĐỘNG, TÍNH TOÀN VẸN CỦA ACROSOME VÀ TỶ LỆ TINH TRÙNG CÓ HOẠT TÍNH HYD VÀ ACE CỦA TINH TRÙNG BÒ, CỪU VÀ DÊ TƯƠI VÀ ĐÔNG LẠNH
Một mối tương quan tích cực đáng kể đã được tìm thấy giữa tốc độ di chuyển của tinh trùng bò, cừu và dê tươi và đông lạnh, và hoạt động của HYD và ACE (P < 0,01)
Tỷ lệ tinh trùng có hoạt tính HYD ở tinh trùng bò và tinh trùng cừu cao hơn đáng kể so với tinh trùng dê trước và sau khi bảo quản lạnh (P < 0,01) Ngoài ra, hoạt tính ACE của tinh trùng bò cao hơn đáng kể so với tinh trùng của trứng hoặc tinh trùng dê (P < 0,01), trong đó làm nổi bật sự khác biệt giữa các loài về tỷ lệ tinh trùng có hoạt tính HYD và ACE trong tinh trùng bò, cừu và dê tươi Sau khi bảo quản lạnh, tỷ lệ tinh trùng có hoạt tính HYD và ACE trong tinh trùng bò, cừu và dê giảm đáng kể, với hoạt tính thấp nhất ở tinh trùng dê và hoạt tính cao nhất ở tinh trùng bò Kết hợp với nhau, hoạt động của HYD và ACE rất hiệu quả để đánh giá hoạt động của tinh trùng
6 ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN LẠNH NHƯỢC ĐIỂM:
- Tỷ lệ nguyên vẹn của acrosome tinh trùng, hoạt tính của HYD, hoạt tính của ACE giảm đáng kể sau khi bảo quản lạnh (cả 3 loài bò, dê, cừu)
- Tốc độ di động của tinh trùng giảm rõ rệt sau bảo quản lạnh Việc giảm khả năng vận động của tinh trùng trong nghiên cứu này có thể do màng sinh chất và acrosome bị tổn thương do tổn thương thực thể, kích thích lạnh và oxy hóa sau bảo quản lạnh, đồng thời suy giảm chuyển hóa ty thể và chuyển hóa năng lượng
- Tỉ lệ phân chia của trứng khi thụ tinh với tinh trùng dê, cừu giảm rõ rệt sau bảo quản lạnh - Làm giảm khả năng sinh sản in vivo của tinh dịch bằng cách rút ngắn tuổi thọ chức năng
của tinh trùng, vì màng tinh trùng có khả năng bị suy giảm nhanh chóng (Hezavehei et al., 2018)
- Tinh trùng trải qua căng thẳng về nhiệt độ (lạnh sốc) và chủ yếu là stress oxy hóa trong toàn bộ quá trình bảo quản lạnh, dẫn đến cấu trúc và chức năng tổn thương tinh trùng (Royere et al., 1996)
ƯU ĐIỂM:
- Khả năng thụ tinh của tinh trùng sau đông lạnh vẫn tương đương với khả năng thụ tinh của tinh trùng tươi
- Chỉ cần một vài con đực để đảm bảo lưu trữ chủng, giúp cắt giảm đáng kể chi phí bảo quản Việc phục hồi các chủng có thể đạt được bằng cách thụ tinh nhân tạo hoặc thụ tinh trong ống nghiệm Trong một số trường hợp nhất định, các chủng đã giảm mức sinh sản có thể được bảo tồn và nghiên cứu (Marschall & Hrabé de Angelis, 1999)
7 THẢO LUẬN:
Số lượng acrosome còn nguyên vẹn trong tinh trùng bò sau khi bảo quản lạnh cao hơn đáng kể so với tinh trùng của cừu và dê Thay đổi thành phần lipid là một bước quan trọng trong khả năng của tinh trùng, tinh trùng bò có nhiều loại màng lipid (Lafleur et al., 2010) Do đó, kết quả có thể nghĩ đến là cấu trúc màng lipid của tinh trùng bò có thể chống lại stress lạnh tốt hơn so với cừu và dê Bổ sung cholesterol vào màng tế bào dưới dạng CLC Căng thẳng oxy hóa có thể được giảm thiểu bằng cách trung hòa ROS thông qua enzym, không enzym, dựa trên chất chống oxy hóa hoặc chất khử; hoặc bằng cách giảm thiểu mức độ các nguồn như tiếp xúc với bức xạ, bạch cầu, tinh trùng bị lỗi, dẫn đến sản xuất ROS trong quá trình bảo quản lạnh tinh dịch Một cách tiếp cận mới lạ của giảm thiểu căng thẳng oxy hóa là khử oxy một phần của kéo dài tinh dịch để giảm căng thẳng oxy trong môi trường vi mô tinh trùng Đó là quá trình loại bỏ một phần oxy được thực hiện thông qua
Trang 4quy trình đông lạnh nhanh bằng cách sử dụng quy trình sủi bọt/khí LN2, N2 hoặc áp dụng áp suất âm cho chất pha loãng bằng cách sử dụng một sửa đổi bơm chân không (Kumar, Prasad, Srivastava, & Ghosh, 2019)
Nghiên cứu chỉ dừng lại ở việc đánh giá các chỉ tiêu đã đặt ra trong phần mục tiêu cũng như so sánh giữa bò, dê và cừu nên nhược điểm của phương pháp trữ đông chưa được tác giả đề cập (chỉ nêu trong phần kết quả đánh giá) Có thể tiếp tục nghiên cứu tiếp theo để đánh giá một cách khách quan hơn khi xét nghiệm thêm tình trạng hư hại DNA của tinh trùng
Comizzoli, P., Wildt, D E., Comizzoli, P., & Wildt, D E (2014) Mammalian fertility preservation through cryobiology: Value of classical comparative studies and the need for
new preservation options Reproduction, Fertility and Development, 26(1), 91–98
https://doi.org/10.1071/RD13259
Cryopreservation of spermatozoa: A 1996 review | Human Reproduction Update | Oxford
https://academic.oup.com/humupd/article/2/6/553/708107
Cui, Y H., Zhao, R L., Wang, Q., & Zhang, Z Y (2000) Determination of sperm acrosin activity
for evaluation of male fertility Asian Journal of Andrology, 2(3), 229–232
Hezavehei, M., Sharafi, M., Kouchesfahani, H M., Henkel, R., Agarwal, A., Esmaeili, V., & Shahverdi, A (2018) Sperm cryopreservation: A review on current molecular cryobiology
and advanced approaches Reproductive BioMedicine Online, 37(3), 327–339
https://doi.org/10.1016/j.rbmo.2018.05.012
Howes, L., & Jones, R (2002) Interactions between zona pellucida glycoproteins and sperm
proacrosin/acrosin during fertilization Journal of Reproductive Immunology, 53(1), 181–
192 https://doi.org/10.1016/S0165-0378(01)00101-2
Kumar, A., Prasad, J K., Srivastava, N., & Ghosh, S K (2019) Strategies to Minimize Various Stress-Related Freeze-Thaw Damages During Conventional Cryopreservation of
Mammalian Spermatozoa Biopreservation and Biobanking, 17(6), 603–612
https://doi.org/10.1089/bio.2019.0037
Trang 5Lafleur, M., Courtemanche, L., Karlsson, G., Edwards, K., Schwartz, J.-L., & Manjunath, P (2010) Bovine binder-of-sperm protein BSP1 promotes protrusion and nanotube formation
from liposomes Biochemical and Biophysical Research Communications, 399(3), 406–
411 https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2010.07.088
Marschall, S., & Hrabé de Angelis, M (1999) Cryopreservation of mouse spermatozoa: Double
your mouse space Trends in Genetics, 15(4), 128–131
https://doi.org/10.1016/S0168-9525(99)01715-1
Purdy, P H (2006) A review on goat sperm cryopreservation Small Ruminant Research, 63(3),
215–225 https://doi.org/10.1016/j.smallrumres.2005.02.015
Royere, D., Barthelemy, C., Hamamah, S., & Lansac, J (1996) Cryopreservation of spermatozoa: A 1996 review Human Reproduction Update, 2(6), 553–559 https://doi.org/10.1093/humupd/2.6.553
Stival, C., Puga Molina, L del C., Paudel, B., Buffone, M G., Visconti, P E., & Krapf, D (2016) Sperm Capacitation and Acrosome Reaction in Mammalian Sperm In M G Buffone (Ed.),
Sperm Acrosome Biogenesis and Function During Fertilization (pp 93–106) Cham:
Springer International Publishing https://doi.org/10.1007/978-3-319-30567-7_5
Sun, T.-C., Wang, J.-H., Wang, X.-X., Liu, X.-M., Zhang, C.-L., Hao, C.-F., … Liu, Y.-X (2019)
Effects of sperm proteins on fertilization in the female reproductive tract Frontiers in
Bioscience (Landmark Edition), 24(4), 735–749 https://doi.org/10.2741/4747
Sun, W., Jiang, S., Su, J., Zhang, J., Bao, X., Ding, R., … Li, X (2021) The effects of cryopreservation on the acrosome structure, enzyme activity, motility, and fertility of
bovine, ovine, and goat sperm Animal Reproduction, 17
https://doi.org/10.1590/1984-3143-ar2020-0219
Trang 6Zoppino, F C M., Halón, N D., Bustos, M A., Pavarotti, M A., & Mayorga, L S (2012)
Recording and sorting live human sperm undergoing acrosome reaction Fertility and
Sterility, 97(6), 1309–1315 https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2012.03.002