nhóm 4 thứ 3ca1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC TIỂU LUẬN PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN THỰC PHẨM CÓ NGUỒN GỐC TỪ NGÔ BIẾN ĐỔI GEN... Đặt vấn đề Tại V

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TIỂU LUẬN

PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN THỰC PHẨM CÓ NGUỒN GỐC TỪ NGÔ BIẾN ĐỔI GEN

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Tại Việt Nam, ngô là một trong các cây trồng chính trong cơ cấu sản xuất nông nghiệp và nước ta cũng là một trong các quốc gia canh tác ngô nhiều nhất trên thế giới, cùng với các giống ngô tự nhiên thì cũng có rất nhiều loại ngô biến đổi gen nhằm kháng sâu bệnh, tăng năng suất, chất lượng cây trồng và đặc biệt là đối phó với sự biến đổi khí hậu,…Thì các thực phẩm từ ngô sẽ có nguồn gốc tự nhiên và ngô biến đổi gen trên thị trường Người tiêu dùng chúng ta có quyền lựa chọn việc sử dụng hoặc không sử dụng thực phẩm biến đổi gen Chính vì thế chúng tôi nghiên cứu đề tài“Phương phát phát hiện thực phẩm có nguồn gốc từ ngô biến đổi gen”

1.2 Mục tiêu đề tài

Xác định được những thực phẩm có nguồn gốc từ ngô biến đổi gen

2

CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

– Thực phẩm có chứa ngô (Bốn mẫu thực phẩm có chứa ngô được cung cấp và sự hiện diện của DNA ngô bình thường hoặc chuyển gen sẽ được phát hiện: 1 Ngô nhãn hiệu A; 2 Ngô nhãn hiệu B; 3 Bột ngô BIO; 4 Hạt giống ngô) – Cối và chày nhỏ ( để nghiền thực phẩm)

– Cân phân tích – Máy ly tâm – Máy PCR

– Bộ cung cấp nguồn điện (power source) – Bồn điện di (gel box)

– Khay gel (casting tray), lược gel (combs)

2.2 Hóa chất

– Thành phần ly trích DNA: Dung dịch đồng nhất mẫu (Homogenization Buffer) gồm: EDTA 25 mM, Tris 200 mM (pH 8,0), SDS 0,5%, NaCl 250 mM Hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol (PCI, v:v:v) 25:24:1 Chloroform,

– Thành phần điện di: Dung dịch đệm điện di (TAE), Agarose, GelRed (Loading dye + sample dye)

2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Ly trích DNA

Bước 1: Nghiền mẫu ( bằng cối và chày) sao đó lấy mẫu đã nghiền tiếp tục nghiền trong tube 1,5 mL có chứa 400 μL dịch đồng nhất mẫu

Bước 2: Bổ sung vào tube 500 μL PCI và lắc nhẹ 1 phút, li tâm với vận tốc 10.000 rpm trong 5 phút, sau đó hút dịch nổi cho vào ống tube mới

Bước 3: Bổ sung 400 μL Chloroform vào, lắc nhẹ 3 phút, li tâm 10.000 rpm/5 phút, hút dịch nổi chuyển qua tube mới

Bước 4: Thêm 600 μL Ethanol 99°, lắc nhẹ 2 phút Ủ ở -20°C trong 30 phút Sau đó li tâm 12.000 rpm/5 phút, bỏ dịch nổi, thu phần tủa Phơi tube ở nhiệt độ phòng

Bước 5: Thêm vào kết tủa DNA 30 μL nước khử ion hấp khử trùng (không chứa DNase) hoặc 30 μL TE 0,5X, vortex nhẹ và bảo quản ở 4°C hoặc -20°C

2.2.2 Phản ứng PCR

Sử dụng các mồi đặc hiệu cho gen Bt Cry 1A(b) (delta-endotoxin) và gen invertase ngô ( Ivr ) được tổng hợp bởi Qiagen-Operon (Alameda, CA) Trình tự mồi là:

– Cry1Ab (5′-ACCATCAACAGCCGCTACAACGACC-3′); – Cry1As (5′-TGGGGAACAGGCTCACGATGTCCAG-3′); – Ivr1A (5′-CCGCTGTATCACAAGGGCTGGTACC-3′); – Ivr1B (5′-GGAGCCCGTGTAGAGCATGACGATC-3′)

4

Bảng 2.2 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

Bước Nhiệt độ (ºC) Thời gian Số chu kì

Tiền biến tính: Biến tính hoàn toàn DNA có trong mẫu; kích hoạt enzyme Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ sẽ được đưa lên 95°C, các liên kết hydro sẽ bị phá vỡ khiến DNA bị biến tính trở thành dạng mạch đơn

Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ được hạ xuống 60°C( tùy thuộc vào các primer), các đoạn mồi sẽ bắt cặp bổ sung vào 2 đầu trình tự mục tiêu

Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ được đưa lên 72°C( sẽ có thay đổi nếu enzyme đó không phải là Taq polymerase), Taq polymerase sẽ sử dụng dNTP để kéo dài đầu 3' của mồi và tạo ra mạch bổ sung

Hậu kéo dài: Để enzyme tham gia vào kéo dài hết những đoạn chưa được kéo dài

Sau hậu kéo dài là bước giữ mẫu (4ºC)

Lấy mẫu và bảo quản ở tủ âm (-20ºC) hoặc tủ âm sâu (-80ºC)

2.2.3 Điện di

– Cho 0,5g agarose vào 50 ml dung dịch TAE ( nồng độ 2%) – Đun sôi hỗn hợp trong khoảng 1,5 phút trong lò Viba – Để nguội ở nhiệt độ phòng

– Đổ gel vào bể điện di (đặt lược tạo giếng trước khi đổ gel)

– Để nguội cho gel cứng hoàn toàn, cẩn thận rút lược ra khỏi gel, cho dung dịch TAE 0,5X vào bể điện di sao cho ngập gel khoảng 1 đến 1,5cm

– Trộn 5µl sản phẩm PCR với 2µl loading dye 6X và cho hỗn hợp vào các giếng của gel Vận hành máy điện di trong 30 phút

Nhuộm gel và đọc kết quả

– Thuốc nhuộm GelRed có thể được trộn trực tiếp với mẫu DNA trước khi điện di hay hòa tan vào gel agarose khi chuẩn bị gel

– Tấm gel sau khi nhuộm, dưới tia UV, GelRed liên kết với DNA sẽ phát sáng

6

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ

3.1 Kết quả mong muốn

Phản ứng PCR được sử dụng dự kiến sẽ tạo ra kết quả: Phân tích gel Agarose của các sản phẩm PCR từ các loại thực phẩm có chứa ngô khác nhau

– Có thể quan sát thấy rằng thực phẩm có ngô bình thường chỉ có band 226 bp – Trong thực phẩm có ngô chuyển gen sẽ có 2 band 226 bp và 184 bp

=>Phản ứng PCR chứa 2 bộ mồi khác nhau, một bộ mồi khuếch đại một đoạn gen Ivr từ ngô sẽ có trong tất cả các mẫu và bộ mồi còn lại sẽ khuếch đại một đoạn gen

ngoại sinh của độc tố Bacillus thuririgensis cũng sẽ có mặt trong các giống chuyển gen