luận án tiến sĩ nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương glycine max l merr

Phát sinh phôi soma trong tái sinh in vitro cây đậu tương .... Nghiên cứu chuyển gen Atore1 vào cây đậu tương thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .... Luận án nghiên cāu có t nh

BÞ GIÁO DĀC VÀ ĐÀO T¾O BÞ NÔNG NGHIÈP VÀ PTNT VIÈN KHOA HâC NÔNG NGHIÈP VIÈT NAM

-

NGHIÊN CĄU CHUYÄN GEN THEO H£àNG NÂNG CAO NNG SUÂT H¾T ä CÂY ĐÀU T£¡NG

(GLYCINE MAX (L.) Merr.)

LUÀN ÁN TIÀN S) NÔNG NGHIÈP

Hà Nßi - 2023

BÞ GIÁO DĀC VÀ ĐÀO T¾O BÞ NÔNG NGHIÈP VÀ PTNT VIÈN KHOA HâC NÔNG NGHIÈP VIÈT NAM

-

NGUYÆN TRàNH HOÀNG ANH

NGHIÊN CĄU CHUYÄN GEN THEO H£àNG NÂNG CAO NNG SUÂT H¾T ä CÂY ĐÀU T£¡NG

(GLYCINE MAX (L.) Merr.)

Chuyên ngành : Công nghÉ sinh hãc

LâI CAM ĐOAN

Tôi xin cam oan, ây là công trình nghiên cāu cÿa cá nhân tôi, các số liệu và kết qu¿ trong luận án là trung thực và ch°a từng °ợc sử dụng ể b¿o vệ một học vị nào hoặc ch°a từng °ợc ai công bố trong bÁt kỳ một công trình nghiên cāu nào

Tôi xin cam oan r ng, mọi sự gi p  , hợp tác cho việc thực hiện luận án này  °ợc c¿m n và các thông tin tr ch d n trong luận án này  u °ợc ch d n

LâI CÀM ¡N

ể hoàn thành luận án này, tôi  nhận °ợc sự quan tâm, gi p  nhiệt tình cÿa các Th y, ô giáo, các tập thể, cá nhân, gia ình c ng b n b  ng nghiệp

Tôi xin bày tỏ lòng biết n sâu sắc ến PGS.TS KhuÁt Hữu Trung, GS.TS Ngô Xuân Bình - là th y giáo h°ớng d n khoa học,  tận tình gi p  , truy n t¿i kiến thāc và kinh nghiệm trong suốt quá trình thực hiện  tài và hoàn thành luận án

Tôi xin trân trọng c¿m n Ban l nh  o Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam; tập thể cán bộ Ban Thông tin và ào t o; tập thể L nh  o và cán bộ viên chāc Trung Tâm chuyển giao công nghệ và khuyến nông  giúp  , hỗ trợ tận tình cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện  tài

Tôi xin chân thành c¿m n Khoa ông nghệ sinh học và ông nghệ thực phẩm, Tr°ßng i học Nông Lâm, i học Thái Nguyên là n i tôi triển khai thực hiện  tài,  t o mọi i u kiện thuận lợi v tài liệu khoa học, c sá vật chÁt, thiết bị phục vụ nghiên cāu ể tôi hoàn thành luận án ặc biệt, tôi xin bày tỏ sự biết n ến PGS.TS Nguyễn Tiến Dũng, Khoa ông nghệ sinh học và ông nghệ thực phẩm  chia sẻ kiến thāc và kinh nghiệm chuyên môn ể tôi hoàn thành nghiên cāu trong thßi gian sớm nhÁt

uối cùng, tôi xin chân thành c¿m n b n b ,  ng nghiệp trong và ngoài c quan và ng°ßi thân trong gia ình luôn hết lòng ộng viên, kh ch lệ và gi p  tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành công trình trình nghiên cāu này

Tôi xin chân thành c¿m n!

1 Tính cÃp thiÁt căa đà tài 1

2 Māc tiêu nghiên cąu 3

4 Đái t¤ÿng và ph¿m vi nghiên cąu 4

4.1 Đối tượng nghiên cứu 4

4.2 Phạm vi, thời gian nghiên cứu 4

5 Nhāng đóng góp mái căa luÁn án 4

CH£¡NG I TàNG QUAN TÀI LIÈU VÀ C¡ Sä KHOA HâC CĂA Đ TÀI 6

1.1 Tình hình sÁn xuÃt đÁu t¤¢ng trên thÁ giái và ViÉt Nam 6

1.1.1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới 6

1.1.2 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam 8

1.2 Táng quan và nghiên cąu chuyÅn gen å cây đÁu t¤¢ng trên thÁ giái 9 1.2.1 Nghiên cứu về tái sinh in vitro ở cây đậu tương 9

1.2.1.1 Vật liệu sử dụng trong t i sinh in vitro á cây đậu tương 9

1.2.1.2 Phát sinh phôi soma trong tái sinh in vitro cây đậu tương 10

1.2.1.3 Ph t sinh cơ quan thông qua mô sẹo trong t i sinh in vitro cây đậu tương 12

1.2.1.4 Ph t sinh cơ quan trực tiếp từ mẫu nuôi cây (không qua việc hình th nh mô sẹo) 13

1.2.1.5 Ành hưáng của môi trưßng nuôi cấy v điều kiện nuôi cấy đến khÁ năng t i sinh đậu tương 14

1.2.2 Kết quả nghiên cứu chuyển gen ở đậu tương trên thế giới 15

1.2.2.1 Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium 15

1.2.2.2 Nghiên cứu chuyển gen bằng súng bắn gen 18

1.2.2.3 Nghiên cứu chuyển gen bằng xung điện 19

1.2.2.4 Nghiên cứu chuyển gen qua ống phấn 19

1.2.3 Các tính trạng được cải thiện thông qua chuyển gen ở cây đậu tương 20 1.2.3.1 Đặc tính kh ng thuốc diệt cỏ 21

1.2.3.2 Đặc tính kh ng côn trùng 21

1.2.3.3 Chuyển gen nâng cao h m lượng dầu 25

1.2.3.4 Chuyển gen nâng cao tính chống chịu điều kiện ngo¿i cÁnh 25

1.2.3.5 Chuyển gen nâng cao năng suất 26

1.2.3.6 Chuyển gen t¿o cây trồng đa tính tr¿ng 26

1.2.4 Thành tựu về cây trồng chuyển gen trên thế giới 27

1.3 Táng quan tình hình nghiên cąu trong n¤ác 31

1.3.1 Chọn tạo giống thông qua tuyển chọn vật liệu nhập nội và địa phương 31 1.3.2 Chọn tạo giống đậu tương mới bằng lai hữu tính 32

1.3.3 Chọn tạo giống mới bằng phương pháp xử lý đột biến 32

1.3.4 Nghiên cứu chuyển gen á cây đậu tương á Việt Nam 33

1.3.4.1 Nghiên cứu t i sinh cây in vitro phục vụ chuyển gen á cây đậu tương 33

1.3.4.2 Nghiên cứu chuyển gen á đậu tương 34

1.4 Táng quan tình hình nghiên cąu và tính tr¿ng gen có khÁ nng nâng cao nng suÃt h¿t å cây đÁu t¤¢ng 35

1.4.1 Nghiên cứu về vai trò của gen kìm hãm già hóa bộ lá 35

1.4.2 Nghiên cứu gen điều khiển quá trình tăng cường kích thước hạt ở cây đậu tương 38

1.5 Mßt sá nhÁn xét rút ra từ táng quan tài liÉu 40

CH£¡NG II VÀT LIÈU, NÞI DUNG VÀ PH£¡NG PHÁP NGHIÊN

2.2 Nßi dung nghiên cąu 43

2.3 Đáa điÅm và thãi gian nghiên cąu 44

2.4 Ph¤¢ng pháp nghiên cąu 44

2.4.1 Nội dung 1: Nghiên cứu khả năng tái sinh bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro và khả năng tiếp nhận gen của một số giống đậu tương để chọn lọc nguồn vật liệu phục vụ cho chuyển gen 44

2.4.1.1 Nghiên cứu khÁ năng t i sinh bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro của c c giống đậu tương 44

2.4.1.2 Đ nh gi khÁ năng tiếp nhận gen của c c giống đậu tương 48

2.4.2 Nội dung 2: Tách dòng và thiết kế vector chuyển gen mang gen kìm hãm già hóa lá Ore1 và đánh giá biểu hiện trên cây Arabidopsis 50

2.4.2.1 Nghiên cứu tách dòng gen kìm hãm già hóa lá Atore1 50 2.4.2.2 Thiết kế vector chuyển gen mang gen kìm hãm gi hóa l Atore1 51 2.4.2.3 Đ nh gi khÁ năng biểu hiện của gen kìm hãm gi hóa l Atore1 trên cây mô hình Arabidopsis thaliana 52

và đánh giá các dòng chuyển gen 55

2.4.3.1 Nghiên cứu chuyển gen Atore1 v o cây đậu tương thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 55

2.4.3.2 Chọn lọc v đ nh gi biểu hiện gen Atore1 trên cây đậu tương chuyển gen 57 2.4.3.3 Chọn lọc dòng đậu tương đồng hợp tử mang gen Atore1 v đ nh gi biểu hiện gen 58 2.4.3.4 Đ nh gi khÁ năng sinh trưáng, ph t triển của c c dòng đậu tương chuyển gen 59

2.5 Ph¤¢ng pháp xÿ lý sá liÉu 60 CH£¡NG III KÀT QUÀ NGHIÊN CĄU VÀ THÀO LUÀN 61 3.1 KÁt quÁ nghiên cąu khÁ nng tái sinh bằng kỹ thuÁt nuôi cÃy in vitro và khÁ nng tiÁp nhÁn gen căa mßt sá giáng đÁu t¤¢ng đÅ chãn lãc ngußn vÁt liÉu phāc vā cho chuyÅn gen 61

của các giống đậu tương 61

3.1.1.1 Nghiên cứu t¿o vật liệu vô trùng 61 3.1.1.2 Ành hưáng của BAP đến khÁ năng t i sinh chồi từ nốt l mầm 62

3.1.1.3 Ành hưáng của kinetin đến khÁ năng t i sinh chồi từ nốt lá mầm 68 3.1.1.4 Kết quÁ Ánh hưáng của h m lượng GA3 đến khÁ năng kéo d i chồi của m t số giống đậu tương 76 3.1.1.5 T i sinh rễ t¿o cây ho n chỉnh 77

3.1.2 Đánh giá khả năng tiếp nhận gen của các giống đậu tương 79

3.2 KÁt quÁ tách dòng và thiÁt kÁ vector chuyÅn gen mang gen kìm hãm già hóa lá Ore1 và đánh giá biÅu hiÉn trên cây Arabidopsis 86

3.2.1 Tách dòng gen kìm hãm già hóa Atore1 86

3.2.2.1 Gắn gen Atore1 vào vector chuyển gen 90 3.2.2.2 T¿o chủng vi khuẩn E.coli v Agrobacterium tumefaciens mang gen Atore1 92

cây mô hình Arabidopsis thaliana 92

3.2.3.1 Chuyển gen Atore1 v o cây mô hình Arabidopsis 92 3.2.3.2 Chọn lọc cây Arabidopsis chuyển gen T1 mang gen Atore1 93

3.2.3.3 Đ nh gi cây Arabidopsis chuyển gen Atore1 bằng PCR á thế hệ T1 94

3.2.3.4 Đ nh gi biểu hiện gen thông qua hình th i của cây Arabidopsis chuyển gen Atore1 thế hệ T1 95

3.2.3.5 Đ nh gi cây Arabidopsis chuyển gen Atore1 bằng PCR á thế hệ T2 96

3.2.3.6 Đ nh gi biểu hiện gen thông qua hình th i l á cây Arabidopsis chuyển gen Atore1 thế hệ T2 97

3.3 KÁt quÁ chuyÅn gen kìm hãm già hóa lá Atore1 vào cây đÁu t¤¢ng và đánh giá các dòng chuyÅn gen 100

3.3.1 Nghiên cứu chuyển gen Atore1 vào cây đậu tương thông qua vi

khuẩn Agrobacterium tumefaciens 100

3.3.1.1 Nuôi cấy h¿t đậu tương nÁy mầm chuẩn bị để biến n¿p gen 100

3.3.1.2 T¿o dung dịch vi khuẩn biến n¿p gen Atore1 101

3.3.1.3 Ành hưáng của nồng đ vi khuẩn đến khÁ năng biến n¿p 102

3.3.1.4 Ành hưáng của thßi gian đồng nuôi cấy đến khÁ năng biến n¿p gen 105 3.3.1.5 Ành hưáng của nồng đ Acetosyringon (AS) đến khÁ năng biến n¿p gen 106

3.3.1.6 Ành hưáng của kh ng sinh chọn lọc đến khÁ năng chọn lọc sau chuyển gen á cây đậu tương 108

3.3.1.7 T i sinh v chọn lọc chồi chuyển gen Atore1 trên môi trưßng kháng sinh 110

3.3.1.8 T¿o cây đậu tương chuyển gen Atore1 ho n chỉnh 111

3.3.1.9 Kết quÁ đưa cây đậu tương chuyển gen trồng trong vưßn thí nghiệm 112 3.3.2 Chọn lọc và đánh giá biểu hiện gen Atore1 trên cây đậu tương

3.3.3 Chọn lọc dòng đậu tương đồng hợp tử mang gen Atore1 và đánh giá biểu hiện gen 126

3.3.3.1 Chọn lọc dòng đậu tương đồng hợp tử mang gen Atore1 126

3.3.3.2 Đ nh gi biểu hiện gen của dòng đậu tương mang gen Atore1 đồng

hợp tử thông qua hình thái 129

3.3.3.3 Kết quÁ phân tích sự có mặt của gen chuyển á c c dòng đậu tương chuyển gen Atore1 đồng hợp tử bằng Southern blot 131

3.3.4 Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của các dòng đậu tương

DANH MĀC CHĀ VIÀT TÂT

AtBBX32 The Arabidopsis thaliana BBX32 Atore1 Arabidopsis thaliana Ore1

Bt Bacillus thuringiensis

CBF C-repeat/dehydration responsive element bingding factor CBF1 C-repeat/DRE binding factor 1

ELISA Enzym-linked Immuno Sorbent Assay

FAOSTAT Tổ chāc L° ng thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (Food and Agriculture Organization)

GMO Sinh vật biến ổi gen (Genetically Modified Organism)

GUS Beta-Glucuronidase reporter gene

ISAAA Tổ chāc Dịch vụ quốc tế v āng dụng công nghệ sinh học nông nghiệp (International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications)

LSD Least Significant Difference Test

mRNA Messenger Ribonucleic acid

NN&PTNT Nông nghiệp và phát triển nông thôn

PCR Ph¿n āng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction)

RM Root Medium

SAAT Sonicate Assisted Agrobacterium - media Transformation Ph° ng pháp biến n p gen á ậu t° ng

DANH MĀC BÀNG

1.1 Tình hình s¿n xuÁt ậu t° ng trên thế giới những năm g n ây 6

1.2 Tình hình s¿n xuÁt ậu t° ng cÿa một số n°ớc āng  u trên thế giới trong những năm g n ây s¿n l°ợng trên 1 triệu tÁn) 7

1.3 Tình hình s¿n xuÁt ậu t° ng Việt Nam giai o n 2012-2021 8

1.4 Tình hình nhập khẩu ậu t° ng cÿa Việt 2020-2022) 9

1.5 Một số môi tr°ßng tái sinh cây ậu t° ng in vitro 14

1.6 Diện t ch cây tr ng NSH toàn c u năm 2019 theo quốc gia 27

1.7 ác giống ậu t° ng tuyển chọn từ ngu n nhập nội 31

2.1 Danh sách các giống ậu t° ng sử dụng trong nghiên cāu 41

2.2 Trình tự m i sử dụng tách dòng gen Atore1 42

2.3 ông thāc ¿nh h°áng cÿa B P ến kh¿ năng t o ch i 45

2.4 ông thāc ¿nh h°áng cÿa Kinetin ến kh¿ năng t o ch i 45

2.5 ông thāc ¿nh h°áng cÿa G 3 ến kh¿ năng kéo dài ch i 45

2.6 ông thāc ¿nh h°áng cÿa IB ến kh¿ năng ra rễ 46

2.7 Trình tự m i sử dụng trong nghiên cāu tách dòng gen Atore1 50

2.8 Danh sách m i sử dụng ể nhân gen Atore1 54

2.9 Thành ph n ph¿n āng P R nhân dòng gen Atore1 54

2.10 Thành ph n các môi tr°ßng d ng cho chuyển gen á cây ậu t° ng thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 56

2.11 Danh sách m i sử dụng ể nhân gen Atore1 58

3.1 ¾nh h°áng cÿa Na lO ến kh¿ năng vô tr ng m u nuôi cÁy 61

3.2 ¾nh h°áng cÿa B P ến tái sinh ch i từ nốt lá m m cÿa các giống ậu t° ng sau 14 ngày nuôi cÁy 62

3.3 ¾nh h°áng cÿa kinetin ến tái sinh ch i từ nốt lá m m sau 14 ngày nuôi cÁy 69 3.4 ¾nh h°áng cÿa hàm l°ợng G 3 ến kh¿ năng kéo dài ch i cÿa một số giống ậu t° ng sau 30 ngày nuôi cÁy 76

3.5 ¾nh h°áng cÿa hàm l°ợng IB ến kh¿ năng ra rễ cÿa một số giống ậu

t° ng sau 30 ngày nuôi cÁy 78

3.6 Biểu hiện nhuộm GUS cÿa m u lây nhiễm Agrobacterium 82

3.7 Kết qu¿ chuyển gen Atore1 vào cây Arabidopsis thông qua vi khuẩn A.tumefaciens 93 3.8 Kết qu¿ chọn lọc cây Arabidopsis chuyển gen Atore1 93

3.9 ặc iểm hình thái và sinh tr°áng á cây Arabidopsis chuyển gen Atore1 thế hệ T1 95

3.10 Hình thái lá cÿa cây Arabidopsis chuyển gen Atore1 thế hệ T2 97

3.11 Kết qu¿ nuôi cÁy t o vật liệu biến n p gen 100

3.12 ¾nh h°áng cÿa mật ộ vi khuẩn ến kh¿ năng biến n p gen 105

3.13 ¾nh h°áng cÿa thßi gian  ng nuôi cÁy ến kh¿ năng biến n p gen 106

3.14 ¾nh h°áng cÿa n ng ộ S ến kh¿ năng biến n p gen 107

3.15 ¾nh h°áng cÿa PPT ến kh¿ năng chọn lọc ch i chuyển gen á cây ậu t° ng 108 3.16 Kết qu¿ chuyển gen tore1 á cây ậu t° ng thông qua vi khuẩn A.tumefaciens 109 3.17 Kết qu¿ chọn lọc và tái sinh cây ậu t° ng chuyển gen Atore1 110

3.18 Kết qu¿ tái sinh cây ậu t° ng chuyển gen hoàn ch nh 111

3.19 Kết qu¿ °a cây ậu t° ng chuyển gen T0ra tr ng 112

3.20 Kết qu¿ sàng lọc cây ậu t° ng chuyển gen T0ngoài  ng ruộng 114

3.21 Kết qu¿ ánh giá s bộ cây ậu t° ng chuyển gen thế hệ T0 115

3.22 ánh giá biểu hiện gen á cây ậu t° ng chuyển gen T0b ng P R 115

3.23 Kết qu¿ chọn lọc các cây ậu t° ng chuyển gen tore1 thế hệ T1b ng thuốc diệt cỏ Basta 116

3.24 Kết qu¿ phân t ch biểu hiện gen b ng P R á T1 118

3.25 ặc iểm sinh tr°áng bộ lá cÿa các dòng cây ậu t° ng chuyển gen Atore1 thế hệ T1 119

3.26 Hàm l°ợng diệp lục cÿa các cây ậu t° ng chuyển gen Atore1 thế hệ T1 120

3.27 Kết qu¿ chọn lọc các cây ậu t° ng chuyển gen Atore1 thế hệ T2b ng thuốc diệt cỏ Basta 122

3.28 ặc iểm sinh tr°áng bộ lá cÿa các dòng cây chuyển gen Atore1 thế hệ T2 123 3.29 Hàm l°ợng diệp lục cÿa các cây ậu t° ng chuyển gen Atore1 thế hệ T2 124

3.30 Kết qu¿ sàng lọc dòng ậu t° ng chuyển gen Atore1  ng hợp tử á thế hệ T2 127 3.31 Kết qu¿ sàng lọc dòng ậu t° ng chuyển gen Atore1  ng hợp tử á thế hệ T3 128 3.32 ặc iểm sinh tr°áng bộ lá cÿa các dòng cây ậu t° ng chuyển gen Atore1

 ng hợp tử T3 130 3.33 Hàm l°ợng diệp lục cÿa các cây ậu t° ng chuyển gen Atore1  ng hợp tử T3 130 3.34 Kết qu¿ tách chiết DN tổng số 131 3.35 ặc iểm sinh tr°áng cÿa dòng ậu t° ng chuyển gen Atore1  ng hợp tử 133

3.36 Một số yếu tố cÁu thành năng suÁt cÿa dòng ậu t° ng chuyển gen Atore1  ng hợp tử 134 3.37 Hiện tr ng hoóc-môn á các dòng ậu t° ng chuyển gen ột biến Atore1 136

DANH MĀC HÌNH

1.1 Một số vật liệu nuôi cÁy trong nuôi cÁy mô ậu t° ng 10

1.2 Diện t ch cây tr ng NSH toàn c u năm 2019 [10] 29

1.3 Kiểu hình cÿa cây chuyển gen kìm h m già hóa lá ore1 và cây ối chāng wild type sau 50 ngày n¿y m m 37

1.4 Dòng ậu t° ng chuyển gen GmBS1 tăng k ch th°ớc h t 39

2.1 S  quy trình tái sinh cây ậu t° ng từ nốt lá m m 48

2.2 Vùng T-DN cÿa vector p MBI 3301 mang gen Bar và GUS, i u khiển bái promoter 35S 49

2.3 S  tổng quát mô t¿ quá trình chuyển gen trên cây Arabidopsis thaliana 54

3.1 Một số hình ¿nh thực hiện các b°ớc tiến hành th nghiệm 75

3.2 Nuôi cÁy t o a ch i á một số giống ậu t° ng nghiên cāu 75

3.3 ¾nh h°áng cÿa IB 1,0mg/l ến kh¿ năng ra rễ á giống T26 sau 3 tu n nuôi cÁy 79

3.4 Biểu hiện gen GUS và tái sinh cây chuyển gen 80

3.5 Hình vẽ mô phỏng cÁu tr c vector pBS nhân dòng gen Atore1 88

3.6 Kết qu¿ kiểm tra khuẩn l c mang gen Atore1 b ng P R và enzyme cắt giới h n 88 3.7 Kết qu¿ gi¿i trình tự gen tách dòng Atore1 và so sánh với trình từ gen At5g39610 b ng ph n m m BioEdit Vị tr mũi tên trên hình ch o n ch n thêm cÿa gen Atore1 trên v ng m hóa cÿa gen At5g39610 89

3.8 Hình vẽ cÁu tr c vector chuyển gen Atore1 91

3.9 Kết qu¿ kiểm tra khuẩn l c mang gen Atore1 b ng P R và enzyme cắt giới h n 91 3.10 Kết qu¿ iện di s¿n phẩm P R kiểm tra sự có mặt cÿa gen Atore1 á cây Arabidopsis chuyển gen thế hệ T1 94

3.11 Hình thái lá cÿa cây Arabidopsis chuyển gen Atore1 thế hệ T1 96

3.12 Kết qu¿ iện di s¿n phẩm P R kiểm tra sự có mặt cÿa gen Atore1 á cây Arabidopsis chuyển gen thế hệ T2 96

3.13 Biểu  so sánh hàm l°ợng diệp lục chlorophyll giữa cây Arabidopsis chuyển gen Atore1 và cây Arabidopsis ối chāng ol-wt á giai o n thu ho ch 98 3.14 H t ậu t° ng n¿y m m và m u biến n p 101 3.15 Vi khuẩn mang gen °ợc nuôi tr¿i trên môi tr°ßng LB sau ó °ợc chuyển sang môi tr°ßng LB lỏng ể thu tế bào Tế bào vi khuẩn °ợc hòa tan b ng môi tr°ßng M lỏng B ể sử dụng cho biến n p gen 102 3.16 họn lọc ch i chuyển gen sau 14 ngày trên môi tr°ßng SIM PPT 10mg/l 109 3.17 Một số hình ¿nh m u biến n p gen sau 5 ngày trên môi tr°ßng  ng nuôi cÁy

CCM 110 3.18 Một số hình ¿nh cây ậu t° ng chuyển gen tái sinh trên môi tr°ßng SEM chāa

kháng sinh 10mg/l PPT 111 3.19 Hình ¿nh cây ậu t° ng chuyển gen trên môi tr°ßng ra rễ RM 112 3.20 ây ậu t° ng chuyển gen Atore1 thế hệ T0 giai o n c¿m āng trong phòng

nuôi 113 3.21 Hình ¿nh sàng lọc cây ậu t° ng chuyển gen sau 3 ngày b ng thuốc diệt cỏ

Basta 114 3.22 Kết qu¿ phân t ch P R cây ậu t° ng chuyển gen tore1 thế hệ T0 116 3.23 Kết qu¿ chọn lọc ậu t° ng chuyển gen T1 b ng thuốc diệt cỏ Basta 117 3.24 Kết qu¿ phân t ch biểu hiện cÿa gen chọn lọc Bar b ng P R cÿa các cây ậu

t° ng chuyển gen T1 117 3.25 Kết qu¿ phân t ch biểu hiện gen Atore1 cÿa các cây ậu t° ng chuyển gen T1 118 3.26 Kết qu¿ lai Southern cÿa các dòng ậu t° ng mang gen Atore1 thế hệ T1 121 3.27 Biểu hiện kết qu¿ chọn lọc cây ậu t° ng chuyển gen T2 b ng thuốc diệt cỏ

Basta 122 3.28 Kết qu¿ phân t ch P R các cây ậu t° ng chuyển gen Atore1 thế hệ T2 125 3.29 Kết qu¿ lai Southern cÿa các dòng ậu t° ng mang gen Atore1 và thế hệ T2 126 3.30 Hình ¿nh sàng lọc các dòng ậu t° ng chuyển gen Atore1 thế hệ T2b ng thuốc

diệt cỏ Basta 127 3.31 Kết qu¿ sàng lọc dòng ậu t° ng chuyển gen Atore1  ng hợp tử á thế hệ T3

b ng thuốc diệt cỏ Basta 129 3.32 Hình thái cây ậu t° ng mang gen Atore1  ng hợp tử giai o n thu ho ch so

với cây ậu t° ng không chuyển gen /c 130 3.33 Kết qu¿ phân t ch biểu hiện cÿa gen chọn lọc Bar b ng P R cÿa các cây ậu

t° ng chuyển gen T3 131 3.34 Hình thái cây ậu t° ng mang gen Atore1  ng hợp tử giai o n thu ho ch so

với cây ậu t° ng không chuyển gen /c 132 3.35 Kết qu¿ lai Southern cÿa các dòng ậu t° ng mang gen Atore1  ng hợp tử 132 3.36 Kiểu hình tuổi thọ cÿa lá á các dòng ậu t° ng Atore1 á giai o n thu ho ch R8 141

3.37 Năng suÁt h t cÿa dòng ậu t° ng biểu hiện Atore1 ột biến 142

Mä ĐÄU

1 Tính cÃp thiÁt căa đà tài

ậu t° ng [Glycine max (L.) Merrill] °ợc xếp vào cây tr ng nông nghiệp

quan trọng nhÁt H t ậu t° ng °ợc xếp trong 8 lo i h t có d u có giá trị kinh tế và nhu c u sử dụng cao, °ợc s¿n xuÁt và giao dịch phổ biến trên thj tr°ßng quốc tế [10], [46] à Việt Nam, ậu t° ng °ợc xếp vào nhóm cây tr ng quan trọng thā ba sau l a và ngô ng thßi Việt Nam có ngu n gen ậu t° ng rÁt phong ph , riêng t i v ng mi n n i ph a Bắc, n i s¿n xuÁt ậu t° ng lớn cÿa c¿ n°ớc chiếm kho¿ng h n 65% diện t ch , hiện có nhi u ngu n gen b¿n ịa quý nh° giống ậu t° ng Sông M , c Hà Bắc, ọc h m ao B ng, Vàng M°ßng Kh° ng, ậu t° ng Hữu Lũng, ậu t° ng h t vàng L ng S n… ác giống này có kh¿ năng chống chịu tốt với i u kiện ngo i c¿nh, nh°ng năng suÁt thÁp [2], [3]

Một thực tế á Việt Nam hiện nay là: trong khi nhu c u sử dụng h t ậu t° ng ngày càng cao thì diện t ch tr ng ậu t° ng cÿa Việt Nam ngày cang gi¿m Theo báo cÿa Bộ NN&PTNT diện t ch và s¿n l°ợng ậu t° ng cÿa Việt Nam liên tục gi¿m d n qua các năm: năm 2010, diện t ch tr ng ậu t° ng là 197.800 ha, ến năm 2021 ch còn kho¿ng 37.000 ha, diện t ch gi¿m h n 75% và s¿n l°ợng gi¿m trên 70% so với năm 2010 Nguyên nhân cÿa việc gi¿m nhanh v diện tich s¿n xuÁt là do cây ậu t° ng bị sâu bệnh phá ho i nặng, việc áp dụng tiến bộ kỹ thuật chậm h n so v i các cây tr ng khác, vì vậy năng suÁt ậu t° ng rÁt thÁp ch  t kho¿ng 1,5 tÁn/ha b ng 50% năng suÁt cÿa thế giới Thực tr ng ó d n ến việc Việt Nam thiếu hụt 3,5 - 5,0 triệu tÁn ậu t° ng/năm, trá thành n°ớc nhập khẩu ậu t° ng rÁtlớn với kim ng ch 2 - 3 t USD/năm, g n t° ng v i giá trị xuÁt khẩu l a g o cÿa Việt Nam hiện nay Thực tế trên cho thÁy, ể phát triển s¿n xuÁt ậu t° ng, Việt Nam c n  u t° ẩy m nh nghiên cāu t o các giống ậu t° ng có năng suÁt và chÁt l°ợng cao phổ biến cho s¿n xuÁt [2], [3], [46]

Āng dụng công nghệ sinh học trong công tác chọn t o giống cây tr ng nói chung và cây ậu t° ng nói riêng là h°ớng mới và hiệu qu¿ á các quốc gia nông nghiệp trên thế giới Trong ó, chọn t o giống b ng công nghệ chuyển gen ể t o

ra s¿n phẩm cây tr ng chuyển gen °ợc āng dụng phổ biến và rộng r i, t o ra các giống cây tr ng có năng suÁt cao, chống chịu tốt với i u kiện biến ổi kh hậu gi p mang l i lợi ch nhi u mặt v kinh tế, môi tr°ßng, x hội và xóa ói gi¿m ngh o T nh ến năm 2019, diện t ch cây tr ng chuyển gen  lên ến 190,4 triệu ha á 29 quốc gia, s¿n l°ợng tăng 94 l n so với năm 1996 là năm  u tiên cây tr ng chuyển gen °ợc th° ng m i hóa trá thành ngành công nghệ phát triển nhanh nhÁt trong lịch sử thế giới hiện  i ây ậu t° ng là cây tr ng chuyển gen °ợc tr ng á nhi u quốc gia, ến năm 2021 diện t ch ậu t° ng chuyển gen lên ến g n 100 triệu ha, chiếm 50% tổng diện t ch cây tr ng chuyển gen trên thế giới, chiếm 78% diện t ch canh tác ậu t° ng toàn c u ác t nh tr ng phổ biến á cây ậu t° ng chuyển gen là: kháng sâu, kháng, bệnh, kháng thuốc diệt cỏ, nâng cao hàm l°ợng d u [10]

Xu h°ớng hiện nay chuyển gen á cây ậu t° ng nói riêng và cây tr ng nói chung ó là tiếp tục c¿i biến di truy n với các t nh tr ng chống chịu và nhÁt là các t nh tr ng nâng cao năng suÁt, chÁt l°ợng cây tr ng Một trong những h°ớng chọn t o giống cho năng suÁt cao những năm g n ây °ợc nhi u nhà chọn giống quan tâm ó là kéo dài thßi gian sinh tr°áng cÿa bộ lá b ng cách °a gen xác ịnh t nh tr ng <trẻ lâu= juvenile trait vào các giống ch n sớm thông qua lai t o hoặc c¿i biến di truy n b ng chuyển gen/ch nh sửa gen [48], [51]

Năm 1996, tác gi¿ Oh và cs  sàng lọc h n 25.000 dòng ột biến cây

Arabidopsisvà phát hiện 5 dòng gen ột biến cÿa gen ORE1 l n l°ợt °ợc ặt tên là:

ore 1, 2, 3, 9 và 11 có biểu hiện kéo dài tuổi thọ cÿa bộ lá [105] ác nghiên cāu tiếp

theo cho thÁy: dòng Arabidopsis ột biến ore1 có hàm l°ợng diệp lục cao h n 30% so với ối chāng, kết qu¿ là bộ lá dòng ore1 có tuổi thọ dài h n so với, các cây ối

chāng là 15 - 30 ngày [71], [123] Năm 2015, tr°ßng i học Dong Hàn Quốc

 thành công trong việc chuyển gen Ore1 vào cây l a, kết qu¿ là làm tăng tuổi thọ

cÿa bộ lá nhÁt là bộ lá òng, lá giữ °ợc màu xanh ngay c¿ khi h t  ch n, vì thế  làm tăng năng suÁt l a 15 - 25%

Trên c sá những kiến thāc hiểu biết tr°ớc ó, ch ng tôi  xác ịnh h°ớng

nghiên cāu chuyển gen ore1 vào cây ậu t° ng và tiến hành thực hiện luận án

<Nghiên cứu chuyển gen theo hướng nâng cao năng suất hạt ở cây đậu tương

(Glycine max (L.) Merr.)” Kết qu¿ cÿa  tài có ý nghĩa quan trọng, góp ph n

phát triển kỹ thuật c¿i biến di truyển t o ra các giống ậu t° ng có năng suÁt cao

phục vụ s¿n xuÁt

2 Māc tiêu nghiên cąu

2.1 Mục tiêu tổng quát

Nghiên cāu chuyển gen t o các dòng ậu t° ng mang gen kìm hãm già hoá

cÿa bộ lá (gen Atore1) theo h°ớng nâng cao năng suÁt h t trên giống ậu t° ng cÿa

Việt Nam

2.2 Mục tiêu cụ thể

- ánh giá °ợc kh¿ năng tái sinh và kh¿ năng tiếp nhận gen cÿa các giống ậu t° ng Việt Nam phục công tác chuyển gen

- Thiết kế thành công vector chuyển gen mang gen  ch gen Atore1 có kh¿

năng nâng cao năng suÁt h t thông qua việc kéo dài tuổi thọ cÿa bộ lá á cây ậu t° ng

- T o °ợc các dòng ậu t° ng chuyển gen mang gen  ch Atore1 và b°ớc

 u ánh giá °ợc biểu hiện cÿa gen á các dòng ậu t° ng chuyển gen

3 Ý ngh*a khoa hãc và thăc tiÇn căa luÁn án

3.1 Ý nghĩa khoa học

- Kết qu¿ cÿa luận án là ti n  cho việc āng dụng kỹ thuật di truy n hiện  i chuyển gen, ch nh sửa gen nh m t o ra các giống ậu t° ng có năng suÁt cao h n, có kh¿ năng chống chịu tốt h n

- Kết qu¿ nghiên cāu cÿa luận án là c sá khoa học và thực tiễn cho việc hoàn thiện kỹ thuật tái sinh các giống ậu t° ng cho chuyển gen, thiết kế vector chuyển gen, chuyển gen, sàng lọc ánh giá cây chuyển gen; xây dựng c sá ph° ng pháp luận ánh giá chọn lọc dòng chuyển gen  ng hợp tử có kiểu gen ổn ịnh ể chọn lọc giống ậu t° ng chuyển gen á Việt Nam

- Kết qu¿ nghiên cāu cÿa luận án có giá trị làm t° liệu, tài liệu cho gi¿ng d y, nghiên cāu sâu h n v chuyển gen á cây ậu t° ng nói riêng và á cây tr ng nói chung

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

T o °ợc các dòng ậu t° ng chuyển gen thế hệ T0, T1, T2, t o °ợc một số

dòng chuyển gen Atore1  ng hợp tử thế hệ T3 có tuổi thọ cÿa bộ lá kéo dài h n và cho năng suÁt cao h n giống ối chāng không chuyển gen

4 Đái t¤ÿng và ph¿m vi nghiên cąu

4.1 Đối tượng nghiên cứu

Cây mô hình Arabidopsis thaliana

30 giống ậu t° ng cÿa Việt Nam (bao g m các giống tr ng canh tác và các giống ịa ph° ng), 02 giống ậu t° ng mô hình là Kwangan KW và William82

4.2 Phạm vi, thời gian nghiên cứu

ác th nghiệm °ợc tiến hành trong i u kiện phòng th nghiệm, nhà k nh nhà l°ới t i Khoa ông nghệ sinh học và ông nghệ thực phẩm, tr°ßng i học Nông lâm, i học Thái Nguyên trong thßi gian từ năm 2019 - 2022

5 Nhāng đóng góp mái căa luÁn án

- Luận án là công trình  u tiên nghiên cāu v chuyển gen nâng cao năng suÁt á cây ậu t° ng thông qua việc kéo dài tuổi thọ cÿa bộ lá á Việt Nam Luận án nghiên cāu có t nh hệ thống v ặc iểm tái sinh phục vụ chuyển gen, thiết kế vector, t o các dòng ậu t° ng chuyển gen và ánh giá biểu hiện cÿa gen

- Kết qu¿ nghiên cāu cÿa luận án là c sá khoa học ể xây dựng c sá dữ liệu và ph° ng pháp luận v ngu n vật liệu phục vụ cho chuyển gen á cây ậu

t° ng Trong ó, tối °u hóa °ợc các iểu kiện tái sinh in vitro và lựa chọn °ợc

các giống ậu t° ng th ch hợp cho tái sinh là: T22, VX93, VN11, VN9, VN6, VN5, VN10, T26

- Nhân dòng thành công gen Atore1, thiết kế thành công cÁu tr c vector

chuyển gen pER8-Atore1 mang gen kìm h m già hóa bộ lá Atore1, thử nghiệm trên cây mô hình Arabidosis co thế vector và gen ho t ộng tốt, sẵn sàng cho việc

chuyển gen vào cây ậu t° ng Kết qu¿ thiết kế vector là c sá lý luận ể thiết kế hệ thống vector chuyển gen cho ối t°ợng thực vật nh m nâng cao việc āng dụng kỹ thuật di truy n hiện t i và t° ng l i

- Thành công trong việc t o °ợc cây ậu t° ng chuyển gen thế hệ T0, T1, T2 và T3, sử dụng chÁt ch thị, phân t ch P R, phân t ch biểu hiện hình thái, phân t ch Southern ể sàng lọc cây chuyển gen qua các thế hệ NhÁt là  thành công trong việc chọn lọc °ợc 02 dòng chuyển gen  ng hợp tử thế hệ T3, ổn ịnh v kiểu gen, có tuổi thọ cÿa bộ lá dài h n từ 17 - 22 ngày so với ối chāng, và có năng suÁt cao h n ối chāng không chuyển trên trên 18% Việc thành công trong chọn lọc °ợc dòng  ng hợp tử á thế hệ thā 3 T3 là c sá khoa học có t nh thuyết phục cao trong việc h° ng ến chọn thành giống ậu t° ng chuyển gen

CH£¡NG I

TàNG QUAN TÀI LIÈU VÀ C¡ Sä KHOA HâC CĂA ĐÂ TÀI

1.1 Tình hình sÁn xuÃt đÁu t¤¢ng trên thÁ giái và ViÉt Nam

1.1.1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới

Do có kh¿ năng th ch āng rộng nên cây ậu t° ng °ợc tr ng khắp các châu lục, nh°ng tập trung nhi u nhÁt á hâu Mỹ và chiếm tỷ lệ tới 87,4 %, tiếp ến là hâu Á với 8,5 % tổng diện t ch ậu t° ng trên thế giới từ năm 2012 - 2021 [46] Trong những năm g n ây, diện t ch tr ng, s¿n l°ợng và năng suÁt ậu t° ng  u có những biến ộng nhÁt ịnh ụ thể, giai o n 2012 - 2021 diện t ch ậu t° ng tăng  u từ 105,35 triệu ha ến 129,06 triệu ha S¿n l°ợng cũng tăng  u từ 241,18 triệu tÁn ến 364,06 triệu tÁn kéo theo sự tăng năng suÁt từ 22,89 t /ha ến 28,21 t /ha Năm 2020 và 2021, năng suÁt và diện t ch ậu t° ng tiếp tục tăng nhẹ,  t s¿n l° ng cao nhÁt năm 2021 là 364,06 triệu tÁn [46] Số liệu °ợc thu thập và trình bày

S¿n xuÁt ậu t° ng tập trung á các quốc gia có °u thế v s¿n xuÁt nông nghiệp, 12 quốc gia āng  u trên thế giới có s¿n l°ợng hàng năm trên 1 triệu tÁn āng  u là Brazil trên 121 triệu tÁn năm 2021 , tiếp ó là Mỹ và rgentina và Trung Quốc Trong số 12 quốc gia āng  u thế thế giới v s¿n xuÁt ậu t° ng có 4 quốc gia là Brazil, Mỹ, Trung Quốc, Paraguay và Nga có s¿n l°ợng ổn ịnh và liên tục tăng trong 5 năm trá l i ây B¿ng 1.2 [46]

BÁng 1.2 Tình hình sÁn xuÃt đÁu t¤¢ng căa mßt sá n¤ác đąng đÅu trên thÁ giái trong nhāng nm gÅn đây (sÁn l¤ÿng trên 1 triÉu tÃn)

1.1.2 Tình hình sÁn xuÃt đÁu t¤¢ng å ViÉt Nam

T i Việt Nam, ậu t° ng là cây tr ng quan trọng thā ba sau cây l a và ngô Vậy nh°ng diện t ch gieo tr ng ngày càng gi¿m, không áp āng °ợc nhu c u cÿa ngành công nghiệp thực phẩm, thāc ăn chăn nuôi, thāc ăn thÿy s¿n và công nghệ ép d u do giống b¿n ịa năng suÁt thÁp, giống nhập ngo i năng suÁt cao nh°ng l i không có những ặc t nh nổi trội cÿa giống b¿n ịa, giá bán l i không cao so với các cây công nghiệp khác Nhìn chung, diện t ch ậu t° ng Việt Nam không ổn ịnh, s¿n xuÁt nội ịa mới ch ÿ cung cÁp cho kho¿ng 8 - 10% nhu c u T nh ến năm 2021, diện t ch tr ng trên c¿ n°ớc gi¿m m nh ch còn 37,3 nghìn ha, gi¿m h n 3 l n

Qua B¿ng 1.3 cho thÁy, diện t ch và s¿n l°ợng ậu t° ng cÿa n°ớc ta có chi u h°ớng gi¿m d n, ặc biệt trong 05 năm g n ây Năm 2012, diện t ch  t 119,6 nghìn ha, s¿n l°ợng  t 173,5 nghìn tÁn, ến năm 2021 diện t ch ch  t 37,3 nghìn ha và s¿n l°ợng gi¿m còn 60,2 nghìn tÁn Tuy nhiên, từ b¿ng số liệu thống kê cũng cho thÁy năng suÁt hàng năm cÿa cây ậu t° ng t° ng ối ổn ịnh và có chi u

h°ớng tăng nhẹ từ 14,5 t /ha năm 2012 lên 15,7 t /ha năm 2020) và 16,1 t /ha năm 2021 song so với thế giới Việt Nam v n là n°ớc có năng suÁt thÁp ch b ng 65% năng suÁt trung bình cÿa thế giới [2]

BÁng 1.4 Tình hình nhÁp khẩu đÁu t¤¢ng căa ViÉt (2020 - 2022)

SÁn l¤ÿng nghìn tÁn 3.545,2 4.988.6 4.751,1

Nguồn: B Công thương

Dựa trên số liệu B¿ng 1.4 cho thÁy, nhu c u tiêu thụ ậu t° ng t i Việt Nam t° ng ối cao, trong khi ó s¿n xuÁt trong n°ớc mới áp āng °ợc một ph n nhỏ nhu c u nội ịa chÿ yếu ể chế biến sữa ậu nành và một số lo i thực phẩm khác, có ến 90% là nhập khẩu ể phục vụ s¿n xuÁt d u ăn và chế biến thāc ăn chăn nuôi Năm 2014, c¿ n°ớc nhập h n 1,5 triệu tÁn ậu t° ng, ến năm 2022 n°ớc ta v n ph¿i nhập h n 4,9 triệu tÁn với chi ph h n 2,7 tỷ USD ể phục vụ cho công nghiệp chế biến, s¿n xuÁt d u ăn và thāc ăn chăn nuôi h nh vì vậy việc tăng năng suÁt và s¿n l°ợng ậu t° ng là rÁt c n thiết Tuy nhiên, thực tế s¿n xuÁt ậu t° ng á n°ớc ta còn gặp nhi u khó khăn, bên c nh tình hình giá phân bón, thuốc trừ sâu tăng cao và sâu bệnh diễn biến phāc t p còn thiếu ngu n giống tốt cho s¿n xuÁt [3]

1.2 Táng quan và nghiên cąu chuyÅn gen å cây đÁu t¤¢ng trên thÁ giái

1.2.1 Nghiên cứu về tái sinh in vitro ở cây đậu tương

1.2.1.1 Vật liệu sử dụng trong t i sinh in vitro á cây đậu tương

ác kết qu¿ nghiên cāu tái sinh cây ậu t° ng in vitro cho thÁy, vật liệu

°ợc sử dụng khá a d ng và phong ph bao g m trụ d°ới lá m m - hypocotyl [80], lá m m - cotyledon, nốt lá m m cotyledon node [80], [112], trụ trên lá m m (epicotyl) [73], [80], sử dụng một nửa lá m m half-seed , ch i ngọn shoot tip) (Hình 1.1) [29], [56] T y vào i u kiện, môi tr°ßng nuôi cÁy và ặc iểm giống ể

có thể sử dụng các m u nuôi cÁy khác nhau cho tái sinh in vitro cây ậu t° ng Hiện

nay, tái sinh ậu t° ng cho chuyển gen, các nhà nghiên cāu chÿ yếu sử dụng m u nửa lá m m, trụ d°ới hoặc trụ tên cÿa lá m m

Hình 1.1 Mßt sá vÁt liÉu nuôi cÃy trong nuôi cÃy mô đÁu t¤¢ng

A Trụ trên lá m m á m m Trụ dưới lá m m hồi ngọn Nốt lá m m [56]

1.2.1.2 Phát sinh phôi soma trong tái sinh in vitro cây đậu tương

Phát sinh phôi soma là một kỹ thuật quan trọng trong nuôi cÁy mô thực vật ¯u iểm ch nh cÿa ph° ng pháp này là sự phát triển cÿa phôi soma bắt ch°ớc phôi hợp tử và nếu °ợc bao bọc, sẽ giống nh° h t giống h t nhân t o Tuy nhiên, một

số loài có các tế bào ti n phôi °ợc xác ịnh, nên dễ phát triển phôi in vitro, một số loài v n ch°a có ph° ng pháp hình thành phôi soma in vitro Các nghiên cāu cho

thÁy ậu t° ng ph¿n āng thuận lợi ối với việc t o phôi soma thông qua m u cÁy lá m m và có thể °ợc khai thác một cách th ch hợp cho quá trình t o phôi à các giống ậu t° ng khác nhau, sự hình thành phôi soma có khác nhau v yêu c u môi tr°ßng với từng kiểu gen Chao Yang và cs cho r ng các kiểu gen ậu t° ng khác nhau yêu c u n ng ộ °ßng sucrose khác nhau môi tr°ßng MS biến ổi với vitamin B5 ể phát triển phôi soma hiệu qu¿ [31] T° ng tự, các giống ậu t° ng

tr ng á các ịa iểm khác nhau ph¿n āng khác nhau ối với in vitro ể phát triển

phôi soma thông qua nuôi cÁy m m h t Do ó, sự phát triển cÿa phôi soma thay ổi theo các kiểu gen khác nhau và các dòng khác nhau ph¿i °ợc sàng lọc ể phát triển phôi soma hiệu qu¿ Mặc d quá trình t o phôi soma cung cÁp một số āng dụng, nh°ng khó khăn trong việc sử dụng phôi soma là tỷ lệ thành công không cao Thông th°ßng, ch có một số phôi soma phát triển thành cây con hoàn ch nh Nguyên nhân là do t° ng tác giữa kiểu gen và môi tr°ßng nuôi cÁy trong quá trình phát triển phôi Tác gi¿ Birch và Collinson  ch ra r ng nếu phôi soma ậu t° ng °ợc xử lý b ng một l°ợng axit abscicic th ch hợp thì sẽ d n ến c¿i thiện sự phát triển và tr°áng thành cÿa phôi xit abscisic ho t ộng nh° một hormone chống stress, gi p phôi v°ợt qua các i u kiện bÁt lợi và ¿m b¿o sự hình thành cây con tốt h n khi i u kiện th ch hợp [26], [37], [72],

Phôi soma có kh¿ năng phát sinh c¿ ch i, rễ và hình thành cây hoàn ch nh khi tái sinh Mặc d quá trình phát sinh phôi vô t nh  °ợc báo cáo á một số phòng th nghiệm nh°ng h u hết các quy trình này khi tiến hành các thử nghiệm chuyển gen ban  u  không thành công [31, [34], [77], [113] Năm 1988, Finer J.J  xây dựng thành công một hệ thống phát sinh phôi soma từ nốt lá m m còn non á cây ậu t° ng khi ông nuôi cÁy m u trên môi tr°ßng có chāa n ng ộ 2,4D cao 40mg/l Phôi vô t nh °ợc nhân lên khi nuôi cÁy trên môi tr°ßng ặc hoặc môi tr°ßng d ng lỏng huy n ph có n ng ộ 2,4D thÁp h n [50] Phân tích hình thái và quan sát sự sinh tr°áng cÿa phôi cho thÁy h u hết những phôi soma mới  u °ợc sinh ra từ b mặt phôi ban  u hoặc c nh ó có d ng hình c u, màu xanh sáng [49], [50] Khi cÁy chuyển những phôi này sang môi tr°ßng MS Murashige and Koog không có chÁt k ch th ch sinh tr°áng thu °ợc cây con tái sinh hoàn ch nh Với hệ thống này, phôi mới sinh ra °ợc sử dụng là mô th ch hợp

cho chuyển gen [48] Việc phát sinh phôi soma trong tái sinh in vitro cây ậu t° ng

cũng °ợc āng dụng trong b¿o t n, lữu giữ và āng dụng các kỹ thuật di truy n á cây ậu t° ng

1.2.1.3 Ph t sinh cơ quan thông qua mô sẹo trong t i sinh in vitro cây đậu tương

Phát sinh c quan ch i/rễ từ m u cÁy thông qua giai o n mô sẹo callus Trong ph° ng pháp này, m u cÁy  u tiên °ợc k ch th ch ể t o ra callus, sau ó °ợc ịnh h°ớng ể t o thành c quan biệt hóa ch i, rễ và °ợc phát triển thành cây con hoàn ch nh

Lợi ch cÿa ph° ng pháp này bao g m việc nhân nhanh giống cây tr ng và phát triển các giống mới b ng các biến dị dòng soma ác biến dị này là do i u

kiện nuôi cÁy in vitro cung cÁp cho các tế bào ch°a biệt hóa, t o ra các biến dị di

truy n trong các mô tái sinh Giống °ợc phát triển nh° vậy cũng dễ dàng °ợc chÁp nhận vì nó không liên quan ến thao tác gen ngo i lai ối với cây ậu t° ng, một số nghiên cāu  °ợc thực hiện ể s¿n xuÁt cây con qua trung gian mô sẹo Nhóm tác gi¿ Liu và cs  nghiên cāu hiệu qu¿ cÿa h t từ phôi trên cây tái sinh từ mô sẹo và t o phôi trên môi tr°ßng MS có chāa B P, N và cho r ng bên c nh việc āng dụng chÁt i u tiết sinh tr°áng ngo i sinh, hàm l°ợng I và polyamine nội sinh trong m u ậu t° ng rÁt quan trọng trong việc xác ịnh hiệu qu¿ cÿa c¿m

āng mô sẹo và sự phát triển trong in vitro [82] Bên c nh m u cÁy non, lá m m và

phôi tr°áng thành cũng  °ợc sử dụng ể tái sinh mô sẹo á ậu t° ng [81] Nuôi cÁy lá ậu t° ng cũng  °ợc d ng ể phát triển các giống ậu t° ng chịu mặn thông qua nuôi cÁy mô sẹo trung gian Wada và cs  t o ra các giống ậu t° ng chịu mặn trên môi tr°ßng °ợc bổ sung tới 0,1% Na l, họ cũng ch ra r ng stress do muối có thể °ợc gi¿m bớt b ng cách bổ sung a l2 trong môi tr°ßng nuôi cÁy [79] Nghiên cāu thử nghiệm này có thể hữu ch trong việc t o ra các giống ậu t° ng chịu mặn và có thể °ợc thử nghiệm thêm trên  ng ruộng v năng suÁt trong i u kiện tự nhiên Lá °ợc coi là m u cÁy th ch hợp vì có thể cung cÁp các tế bào  ng nhÁt ể phân hóa và nhân giống Wright và cs  thiết lập quy trình t o cây ậu t° ng hoàn ch nh có thể °ợc phát triển từ các o n lá nhỏ cÿa cây mẹ, trong ó sử dụng tu n tự môi tr°ßng MS và môi tr°ßng B5 có bổ sung các chÁt i u hòa sinh tr°áng thực vật khác nhau [130]

1.2.1.4 Ph t sinh cơ quan trực tiếp từ mẫu nuôi cây (không qua việc hình th nh mô sẹo)

Phát sinh c quan trực tiếp là sự phát sinh c quan ch i/rễ từ m u cÁy không qua mô sẹo ác ốt thân °ợc sử dụng phổ biến nhÁt ể t o m u cÁy ch i không có mô sẹo và phát triển thành các cây con là dòng vô t nh cÿa cây mẹ [81] Trong ph° ng pháp này, các ch i nách °ợc k ch th ch hình thành từ các o n có ốt thân và °ợc nhân lên thành các b¿n sao giống hệt nhau v mặt di truy n cÿa cây mẹ Tác gi¿ Hitoshi và cs  nhân giống hàng lo t cây ậu t° ng b ng cách sử dụng các o n ốt thân Họ  sử dụng dung dịch natri hypochlorite ể khử tr ng b mặt m u và môi tr°ßng MS, B P và IB ể k ch th ch sự hình thành nhi u ch i Tuy nhiên, các m u cÁy c n °ợc thu thập từ các cây mẹ khỏe m nh và cÁy m u ngay sau khi xử lý vào môi tr°ßng nuôi cÁy, việc phát sinh c quan trực tiếp không qua mô sẹo phụ thuộc rÁt nhi u vào kiểu gen t y từng giống mà môi tr°ßng nuôi cÁy [126]

Việc hình thành các bộ phận c quan trực tiếp không qua mô sẹo, quan trọng nhÁt là quá trình phát hình thành và phát triển ch i h i hình thành từ một khối mô khác nhau °ợc tách ra ể t o rễ và hình thành cây mới ể biến n p, gen ngo i lai c n °ợc chuyển vào mô phân sinh ch i hoặc các khối mô có kh¿ năng tái sinh ch i Phát sinh hình thái ch i á ậu t° ng, l n  u tiên °ợc Wright và cs báo cáo năm 1986, sử dụng nốt lá m m cÿa cây m m làm m u cÁy; Barwale và cs 1986 sử dụng nốt lá m m cÿa h t non Khi nuôi cÁy trên môi tr°ßng có chāa B P ch i °ợc hình thành từ lớp mô biểu bì d°ới subepidermal tissue ¯u iểm ch nh cÿa ph° ng pháp này là ch i °ợc nhân lên và có thể hình thành rễ d°ới 3 tháng Trong khi ó, ph° ng pháp phôi vô t nh ph¿i mÁt 4 tháng hoặc h n nữa Trụ d°ới hypocotyl và trụ trên epicotyl lá m m cÿa cây ậu t° ng cũng °ợc sử dụng ể tái sinh trực tiếp thành cây hoàn ch nh [47], [125], t o phôi vô t nh [81] và t o cây chuyển gen [61], [100]

1.2.1.5 Ành hưáng của môi trưßng nuôi cấy v điều kiện nuôi cấy đến khÁ năng t i sinh đậu tương

Môi tr°ßng nuôi cÁy có ¿nh h°áng quan trọng ến kh¿ năng tái sinh ậu t° ng, tuy nhiên, māc ph¿n āng với i u kiện môi tr°ßng còn t y thuộc kiểu gen và ngu n vật liệu Do ó, c n nghiên cāu i u kiện môi tr°ßng nuôi cÁy cho ậu t° ng ph hợp với từng giống và từng giai o n

BÁng 1.5 Mßt sá môi tr¤ãng tái sinh cây đÁu t¤¢ng in vitro

1 Nuôi cÃy h¿t/phôi

Môi tr°ßng MS Shan và cs (2005); Vural (2010); Phat và cs

Trong nuôi cÁy mô ậu t° ng, pH môi tr°ßng th°ßng sử dụng là 5,8, môi tr°ßng th ch hợp cho giai o n gieo h t là môi tr°ßng MS bổ sung B ác tác gi¿  nghiên cāu ¿nh h°áng cÿa n ng ộ B khác nhau ến kh¿ năng n¿y m m và

kết luận n ng ộ B = 1mg/l cho kết qu¿ tốt nhÁt H t °ợc gieo trong i u kiện 16h sáng 8h tối d°ới ánh sáng huỳnh quang, nhiệt ộ 240 trong 7 ngày Islam và cs  nghiên cāu ¿nh h°áng cÿa B và 2,4D ến kh¿ năng t o mô sẹo á ch i ngọn và nốt lá m m ậu t° ng Th nghiệm cho thÁy môi tr°ßng MS bổ sung 2,5mg/l BAP + 0,5mg/l 2,4D cho tỷ lệ phát sinh callus cao nhÁt 76,60% Kết qu¿ cũng cho thÁy tỷ lệ phát sinh callus cÿa ch i ngọn cao h n có y nghĩa so với nốt lá m m [56], [61] Begum và cs  nghiên cāu ¿nh h°áng cÿa 2,4D, N , B ến kh¿ năng t o mô sẹo Môi tr°ßng th ch hợp nhÁt là MS 3,32mg/L 2,4D và MS + 1,5mg/L B P Tỷ lệ 100% Môi tr°ßng phát sinh ch i sử dụng B và N cho kết qu¿ tốt nhÁt MS + 2,5mg/l BAP + 1,0mg/l NAA (tỷ lệ 79,4%, ch i cao 5,32cm [29] Theo Hu CY và cs môi tr°ßng MS 1mg/l B th ch hợp nhÁt cho tái sinh ch i Hu CYvà cs cũng ch ra r ng ch i ch phát sinh trong môi tr°ßng có n ng ộ B từ 5 - 10µM/l Kho¿ng 1 - 2mg/l , á n ng ộ cao h n 10µM/l 35 ch i không hình thành [59] i u này ph hợp với những nghiên cāu cÿa Sairam và cs [127] Sau khi callus phát sinh ch i, ch i °ợc chuyển sang môi tr°ßng kéo dài ch i SEM), môi tr°ßng ph hợp là môi tr°ßng MS bổ sung 0,1mg/l IAA, 0,5 mg/l GA3, 1mg/l ZR trong 14 ngày [85]

1.2.2 Kết quả nghiên cứu chuyển gen ở đậu tương trên thế giới

1.2.2.1 Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium

ây là ph° ng pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium nh° một vector sinh học

ể biến n p một ph n DN cÿa ch ng vào hệ gen thực vật, kết qu¿ là t o °ợc cây

biến ổi gen Agrobacterium xâm nhiễm vào cây tr ng thông qua vết th° ng Khi bị

tổn th° ng, mô thực vật sẽ tiết ra hợp chÁt phenol, hợp chÁt này sẽ d n dụ vi khuẩn

Agrobecteriumbiểu hiện gen v ng vir Kết qu¿ biểu hiện cÿa gen Vir, sợi  n

DN sẽ °ợc chuyển và tổng hợp trong hệ gen thực vật VÁn  ch nh cÿa ph° ng pháp chuyển gen này là sự kết hợp giữ tế bào chÿ với vector t° ng āng [57], [139]

Mặc d ban  u ậu t° ng không ph¿i là ối t°ợng °ợc xem xét ể lây nhiễm với vi khuẩn cho tới khi Pederson và cs chāng minh ậu t° ng là vật chÿ th ch hợp với lo i vi khuẩn này [38], [115] Tuy nhiên, hiệu qu¿ chuyển gen v n bị kiểm soát bái yếu tố v giống [41], [96], [110], [113] Mặt khác, kh¿ năng thu °ợc

các ch i chuyển gen từ những khối mô có kh¿ năng tái sinh nh° phôi vô t nh và nốt lá m m ban  u rÁt thÁp ể nâng cao hiệu qu¿ chuyển gen ngày càng có nhi u nghiên cāu nh m tối °u quy trình nh°: bổ sung hợp chÁt có vai trò x c tác nh°

acetosyringone ể k ch th ch sự biểu hiện cÿa gen Vir, L-cystein, hoặc sử dụng các

chÿng vi khuẩn có kh¿ năng gây ộc tính cao [109], xác ịnh các yếu tố ¿nh h°áng ến hiệu qu¿ chuyển gen thông qua nốt lá m m, nghiên cāu c¿i tiến nốt lá m m làm vật liệu biến n p, kết hợp lây nhiễm với tái sinh [110] VÁn  khác khi sử dụng vi

khuẩn Agrobacterium còn phụ thuộc vào chÿng khuẩn, số l°ợng b¿n DN copy

°ợc tổng hợp trong hệ gen thực vật, pH môi tr°ßng, māc ộ gây tổn th° ng cÿa m u Trái ng°ợc với các ph° ng pháp chuyển DN tr°ợc tiếp có thể cho kết qu¿ với số b¿n copy nhi u h n, có thể là các m¿nh hoặc các o n °ợc kết hợp trong một khuân m u không °ợc kiểm soát [110], [114]

Những cây ậu t° ng chuyển gen  u tiên °ợc t o ra b ng ph° ng pháp nốt

lá m m sử dụng vi khuẩn Agrobacterium làm trung gian °ợc báo cáo vào năm

1988 [55] Nốt lá m m cÿa giống Peking °ợc lây nhiễm với chÿng vi khuẩn

Agrobacteriummang gen ch thị gus, gen kháng kanamycin và glyphosate M u

°ợc nuôi cÁy trên môi tr°ßng có chāa B P ể c¿m āng t o ch i, kanamycin cùng với các kháng sinh khác có tác dụng lo i bỏ l°ợng vi khuẩn còn l i sau khi  ng nuôi cÁy Sau một vài tháng, cây con °ợc tái sinh và °ợc kiểm tra thông qua sự

biểu hiện cÿa gen gus hoặc kh¿ năng kháng glyphosate h 6% tổng số ch i lựa

chọn °ợc chuyển gen Tám cây °ợc tái sinh và phân t ch, kết qu¿ cho thÁy ch ng có một sợi DN ch n vào Mặc d sự biến n p cho hiệu qu¿ không cao nh°ng báo cáo ch ra r ng có thể tái sinh các tế bào chuyển gen cÿa một giống ậu t° ng khi

°ợc lây nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium th ch hợp

Nhóm tác gi¿ Townsend và Thomas  sử dụng quy trình t° ng tự  thu °ợc cây chuyển gen từ giống Pioneer 9341 ác yếu tố quan trọng gi p họ thành công ó là 1 sử dụng chÁt acetosyringone; 2 giới h n nhiệt ộ giai o n  ng nuôi cÁy °ợc kiểm soát trong kho¿ng 18 - 280

C; 3 mật ộ tế bào vi khuẩn lây

nhiễm từ 108 ến 3x109

/ml; 4 sử dụng axit pyroglutamic ể bổ sung vào trong môi tr°ßng tái sinh [130]

Vi khuẩn Agrobacterium và nốt lá m m cũng °ợc sử dụng ể chuyển gen

tổng hợp protein vỏ cÿa virus Bean Pod Mottle một lo i vius rây bệnh ốm vỏ trên h t ậu vào ậu t° ng Tuy nhiên, tỷ lệ chuyển n p gen thÁp, ch có 5 cây chuyển gen s khái cÿa 5 lá m m khác nhau °ợc t o ra từ 400 lá m m ban  u Phân t ch Southern cho thÁy sự t ch hợp gen BPMV P-P vào bộ gen và thể hiện qua các cây R1 Kho¿ng 30% cây R2 có ngu n gốc từ 1 dòng chuyển gen ban  u °ợc xét nghiệm ELIS Enzym-linked Immuno Sorbent ssay cho thÁy kh¿ năng kháng hoàn toàn với virus này T nh tr ng hình thái không bị biến ổi so với thế hệ R1 [91], [130]

Parrott và cs  °a ra ph° ng pháp chuyển gen khác ó là sử dụng vi khuẩn

Agrobacteriumlây nhiễm với m u mô lá m m h t non ể t o phôi vô t nh sau ó tái

sinh thành cây hoàn ch nh Ba cây chuyển gen có chāa gen zein k ch th°ớc 15kD

°ợc hình thành Tuy nhiên, những cây chuyển gen này  u bị kh¿m và khi phân

t ch các cây á thế hệ sau không thÁy có một cây nào có chāa gen zein 15kD [113]

G n ây, một ph° ng pháp mới và có kh¿ năng cho hiệu qu¿ h n  °ợc

phát triển ể biến n p vi khuẩn Agrobacterium mang gen vào thẳng tế bào mô  ch Kỹ thuật mới này gọi là S T Sonicate Assisted Agrobacterium - media

transformation) [131] Sử dụng S T với nuôi cÁy huy n ph phát sinh phôi vô t nh  cho hiệu qu¿ chuyển gen ổn ịnh và không có hiện t° ng thể kh¿m Ph° ng pháp này có °u iểm là thßi gian nuôi cÁy cộng sinh mô thực vật với

Agrobacterium°ợc r t ngắn Với kỹ thuật hiển vi iện tử quét, nhóm tác gi¿ khám phá ra S T, t o ra những r nh và khe nhỏ giống nhau, xuyên qua mô, cho phép

Agrobacterium dễ dàng i vào mô  ch mong muốn không giống nh° ph° ng pháp chuyển n p gen khác Sử dụng kỹ thuật S T ể chuyển gen vào  nh sinh tr°áng  làm gia tăng hiệu qu¿ chuyển n p gen t m thßi trong nhi u c quan nh°: lá, nốt

lá m m, phôi hữu t nh, phôi vô t nh, rễ, thân, ch i, h t qua sự thể hiện GUS tăng

gÁp 100 - 400 l n trên cây Ohio buckeye, ậu ũa cowpea , cây vân sam trắng

white spruce , l a mì, ngô và ậu t° ng,  ng thßi gen chuyển n p t° ng ối ổn ịnh qua các thế hệ Meurer và cs áp dụng ph° ng pháp nêu trên á 28 giống ậu t° ng, nhóm tác gi¿ cho r ng, ể thực hiện thành công ph° ng pháp S T thì c n kh¿o sát các yếu tố nh°: chÿng vi khuẩn, xác ịnh tế bào chÿ và kh¿ năng tiếp nhận gen cÿa mô mong muốn Với ph° ng ph° ng pháp S T, chọn những cụm phôi có 10 - 20 phôi °ßng k nh 2 - 4 mm °ợc lây nhiễm với 1 ml dịch khuẩn A tumefaciens có n ng ộ OD600 = 0,1 - 0,5 trong thßi gian 0 - 300 giây Sau 2 ngày trên môi tr°ßng lây nhiễm có 0,1mM cetosyringone m u °ợc chuyển lên môi tr°ßng chāa 400 mg timentin/l Hai tu n sau khi S T, chuyển mô sang môi tr°ßng có 20 mg hygromycin/l và 400 mg timentin/l Những dòng chuyển gen °ợc quan sát và phân lập kho¿ng 6 - 8 tu n sau khi S T Kỹ thuật này cho hiệu qu¿ chuyển gen cao h n so với các ph° ng pháp chuyển gen khác Má ra một h°ớng

mới sử dụng vi khuẩn Agrobacterium ể biến n p gen cho các mô  ch khác nhau

[97], [131]

1.2.2.2 Nghiên cứu chuyển gen bằng súng bắn gen

Kỹ thuật bắn gen dựa trên gia tốc cÿa các h t bọc DN v ph a tế bào thực vật Nhß có gia tốc lớn mà các h t DN có thể âm xuyên qua thành tế bào và màng tế bào Bên trong tế bào, DN °ợc phân tách từ các h t nhỏ và tổng hợp á trong hệ gen thực vật ¯u iểm cÿa s ng bắn gen là có thể lo i bỏ các tác nhân sinh học không th ch hợp, ặc biệt là với những lo i m u không th ch hợp với chuyển

gen b ng vi khuẩn Agrobacterium Ph° ng pháp này cho phép chuyển trực tiếp gen

quan tâm vào mô phân sinh  nh cÿa thực vật Tuy nhiên, ph° ng pháp này yêu c u ph¿i có dụng cụ, máy móc chuyên dụng có thể phân chia ch nh xác các h t DN sâu trong mô phân sinh  ch [97] Báo cáo  u tiên v chuyển gen b ng s ng bắn gen vào ậu t° ng sử dụng ch i phân sinh  nh làm mô  ch °ợc McCabe và cs tiến hành năm 1988 h i  nh sau khi biến n p °ợc c¿m āng t o a ch i tr°ớc khi tái sinh thành cây hoàn ch nh Phân t ch khối mô chuyển gen nhận thÁy có các h t nhỏ mang DN và có sự tái tổ hợp DN trong tế bào chÿ [87], [97] Kh¿ năng tổng

hợp DN trong tế bào °ợc xem nh° biểu hiện cÿa quá trình chuyển gen có hiệu qu¿ [62]

1.2.2.3 Nghiên cứu chuyển gen bằng xung điện

Sử dụng xung iện cho hiệu qu¿ biến n p khá cao ối với tế bào ộng vật Fromm M và cs l n  u tiên cho r ng có thể c¿i tiến ph° ng pháp này ể biến n p gen vào thực vật, nhóm tác gi¿  sử dụng kỹ thuật xung iện ể chuyển gen vào tế bào tr n cÿa cây ngô và họ  thu °ợc cây ngô chuyển gen b n vững b ng ph° ng pháp này ng với các th nghiệm thu °ợc trên cây thuốc lá cÿa nhi u tác gi¿ khác, ph° ng pháp này  °ợc sử dụng ể chuyển gen cho cây ậu t° ng [118], [52]

Tế bào tr n ậu t° ng °ợc xung iện ¿m b¿o mật ộ 2 - 4 x 106 tế bào trên/ml môi tr°ßng Kao bổ sung 40mM Na l Một ml dung dịch huy n ph tế bào tr n °ợc h t cho vào cuvet 1,5ml và làm l nh trong thßi gian ngắn trên á Dòng iện xung phát ra từ các sợi b ch kim có kho¿ng cách 1cm Dòng iện này °ợc cung cÁp bái một tụ iện 490µF Sprague Power-lytic 36D, Marsh Electronics, Milwaukee, WI và là ngu n cung cÁp iện áp ổn ịnh iện thế °ợc i u ch nh b ng một vôn kế [54]

Chowrira và cs sử dụng ph° ng pháp xung iện ể biến n p gen vào iểm sinh tr°áng cÿa cây m m ậu t° ng ây m m 7 - 10 ngày °ợc lo i bỏ lá m m, ADN °ợc tiêm vào  nh ch i b ng hệ thống ống tiêm có chāa dung dịch lipofectin DN °ợc chuyển vào b ng một dòng iện xung, cây sinh tr°áng mà không c n tác nhân chọn lọc Quá trình này  °ợc thực hiện trên nhi u mô phân sinh và thu °ợc một vài thể kh¿m ây là ph° ng pháp tốt nh°ng việc āng dụng còn nhi u h n chế [35]

1.2.2.4 Nghiên cứu chuyển gen qua ống phấn

H u hết các ph° ng pháp chuyển gen hiện t i  u dựa trên c sá nuôi cÁy mô tế bào, nó òi hỏi các tế bào chuyển gen ph¿i °ợc tái sinh thành cây [26] Phát triển một hệ thống chuyển gen ộc lập với nuôi cÁy mô tế bào  giành °ợc nhi u sự quan tâm cÿa các nhà khoa học ách tiếp cận này cho phép v°ợt qua rào c¿n v kiểu gen cÿa cây biến n p vốn ¿nh h°áng rÁt nhi u ến hiệu qu¿ chuyển gen Mặt

khác chi ph tài ch nh và thßi gian chọn t o sẽ °ợc r t ngắn Ph° ng pháp chuyển gen qua ống phÁn l n  u tiên °ợc báo cáo thành công trên cÁy bông [35] Kỹ thuật này sau ó °ợc sử dụng ể chuyển gen á một số cây tr ng nh°: ngô [33], bông [102], lúa [39], [87], ậu t° ng [138], [140], [141], d°a hÁu [32] Một số báo cáo  ch ra r ng có thể chuyển gen vào ậu t° ng thông qua ống phÁn, Meurer và cs  sử dụng ph° ng pháp này ể t o ra cây ậu t° ng và cây bông chuyển gen, nhóm tác gi¿  thu °ợc 50 h t ậu t° ng, 226 h t bông Nh°ng tÁt c¿  u cho kết qu¿ âm t nh khi sử lý thuốc diệt cỏ [99]

Zenglu Li và cs  thu °ợc xÁp x 5.000 h t ậu t° ng sau khi xử lý hoa

với DN mang gen bar Khi kiểm tra tÁt c¿ các h t thu °ợc từ cây xử lý với DN có chāa gen bar  u không cho kết qu¿ d° ng t nh với gen này Quan sát hình thái

cÿa một vài cây thÁy có sự khác nhau, nh°ng h t cÿa ch ng không có kh¿ năng n¿y

m m Th nghiệm khác với gen gus, nhóm tác gi¿ thu °ợc g n 2% số h t cÿa các cây °ợc xử lý với DN có chāa gen gus ph¿n āng d° ng t nh với gen này khi

kiểm tra Tuy nhiên, khi cho h t n¿y m m và tiến hành lÁy lá phân t ch thì không

thÁy có sự ho t ộng cÿa gen gus 3% h t thu từ các cây thế hệ sau °ợc kiểm tra  u không thÁy có biểu hiện cÿa gus [140] Huixia Shou và cs tiến hành chuyển gen

vào 8 giống ậu t° ng, trong ó có giống mô hình Williams 82 b ng kỹ thuật chuyển gen qua ống phÁn, tuy nhiên kết qu¿  không thành công nh° mong muốn[59] Nhi u báo cáo tr°ớc ây khi sử dụng ph° ng pháp chuyển gen này cũng  u ch ra một số h n chế cÿa ph° ng pháp này [142], [79], [102]

1.2.3 ác tính trạng được cải thiện thông qua chuyển gen ở cây đậu tương

Hiện nay, ể áp āng n n nông nghiệp hiện  i thì kỹ thuật di truy n là h°ớng nghiên cāu ch nh °ợc áp dụng trên nhi u cây tr ng quan trọng nh° ngô, l a, bông, ậu t° ng và  thu °ợc những kết qu¿ rÁt kh¿ quan ác gen quy ịnh các ặc t nh quan trọng °ợc °a vào cây tr ng và h u hết các dòng chuyển gen này  °ợc tr ng kh¿o nghiệm ngoài  ng ruộng, nhi u giống  °ợc th° ng m i hóa ối với cây ậu t° ng, một số ặc t nh sau  °ợc c¿i thiện nh° kháng thuốc diệt cỏ, kháng côn tr ng, chịu h n, ch n sớm, c¿i thiện chÁt l°ợng h t hay giun tròn h i rễ

1.2.3.1 Đặc tính kh ng thuốc diệt cỏ

B ng công nghệ sinh học ng°ßi ta  có thể t o ra những giống cây tr ng kháng thuốc diệt cỏ, cho phép lo i trừ °ợc cỏ d i một cách chọn lọc Nhìn chung, s¿n xuÁt cây tr ng kháng thuốc diệt cỏ °ợc tiến hành b ng việc chuyển gen m hóa enzyme gây bÁt ho t thuốc diệt cỏ vào cây tr ng

Theo tác gi¿ Lawton có kho¿ng 1.000 giống ậu t° ng kháng thuốc diệt cỏ glyphosate ang °ợc bán bái h n 200 công ty trên thế giới Monsanto, công ty giữ b¿n quy n v giống ậu t° ng chuyển gen kháng cỏ <Round up= thống kê cho thÁy năm 1996 có kho¿ng 0,4 triệu hecta tr ng ậu t° ng kháng thuốc diệt cỏ, năm 1997 tăng lên 3,6 triệu hecta và năm 1998  t 11,3 triệu hecta [75]

Gen m hóa enzyme tổng hợp 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimic (EPSPS), gen m hóa enzyme phosphinothricin acetyl transerase P T  °ợc chuyển vào cây ậu t° ng và t o ra các dòng ậu t° ng chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ glyphosate/glufosinate

ác giống ậu t° ng chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ glufosinate, Roundup và imidazoline  °ợc th° ng m i hóa Năm 2004, hàng lo t các giống ậu t° ng chuyển gen kháng các lo i thuốc diệt cỏ khác nhau °ợc tr ng chÿ yếu á Mỹ và ch ng  °ợc nhập khẩu vào cộng  ng chung Châu Âu, mặc d v n t n t i khá nhi u tranh c i Trong thập kỷ qua 1995-2006 , ối với cây chuyển gen, ặc t nh kháng thuốc diệt cỏ liên tục là t nh tr ng nổi bật chiếm 71% , tiếp sau là ặc t nh kháng sâu bệnh chiếm 18% và các cây mang c¿ hai ặc t nh này chiếm 11% [10]

1.2.3.2 Đặc tính kh ng côn trùng

Việc sử dụng giống kháng bị h n chế vì không có giống kháng cao ể hoàn toàn phòng trừ sâu h i ậu t° ng, á Mỹ một vài kỹ thuật canh tác °ợc áp dụng nh° là gieo tr ng sớm hay tr ng các giống ngắn ngày ể né tránh các  nh bộc phát cÿa sâu Velvetbean; tr ng g n bên các ruộng cây tr ng khác °ợc sâu o °a th ch h n ậu t° ng cũng h n chế māc gây h i cÿa sâu o ến ruộng ậu t° ng á một số v ng tr ng ậu t° ng cÿa n°ớc Mỹ [10], [45] Thuốc trừ sâu th°ßng °ợc d ng khi mật ộ sâu lên ến māc ng° ng gây h i Tổng chi ph °ớc t nh cho thuốc trừ sâu sử